羊水細(xì)胞培養(yǎng)染色體制備常規(guī)

1、羊水細(xì)胞培養(yǎng)染色體制備常規(guī)一、羊膜腔穿刺的時間及方法：1、羊膜腔穿刺的時間：最理想是在妊娠16? 20 周進(jìn)行羊膜腔穿刺。2、羊膜腔的穿刺方法：1) B 型起聲定位穿刺點(diǎn)，預(yù)先確定胎盤和胎頭部位，盡量避開胎盤附著處進(jìn) 針。2) 、囑孕婦排盡尿，以使膀胱空虛。3) 、檢查穿刺部位的皮膚有無茹腫、皮炎 , 感染等不適合穿刺的惜況。4) 、仰臥手術(shù)臺上，然后囑病人翻身數(shù)次，以使羊膜腔內(nèi)脫落的細(xì)胞懸浮。5) 、恢復(fù)仰臥位后，按常規(guī)消毒腹部皮膚，鋪上消毒孔巾。6) 、穿刺針通過腹壁、子宮 , 進(jìn)入羊膜腔的過程中，術(shù)者會體會到三種不同的 彈性阻抗性。當(dāng)估計(jì)穿刺針已進(jìn)入羊膜腔后，輕輕抽出穿刺針針芯 , 接上

2、無菌注射 器。7) 、為了防止穿刺時注射器針頭內(nèi)混有母體細(xì)胞 ,可將先抽出的 l、2ml 羊水棄 去,然后更換注射器再抽取羊水1520ml,注入無菌、帶蓋的離心管內(nèi)，供羊水細(xì)胞培養(yǎng)用。8) 、抽出羊水標(biāo)本立即送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行培養(yǎng)。二、羊水細(xì)胞培養(yǎng)：1、離心(1000八1500r/min)5 分鐘。2、無菌環(huán)境中，吸出上清液留作其它檢驗(yàn)用。將剩下的0.5ml 沉淀物輕輕打均。用無菌滴管吸取沉淀懸液，分別平鋪于兩個無菌羊水培養(yǎng)瓶內(nèi)。3、吸取F10培養(yǎng)液2.1ml和小牛血清0. 9ml于羊水培養(yǎng)瓶內(nèi)，輕輕搖勻，塞緊 瓶塞放入 37°C 培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)。4、換液,于培養(yǎng) 6稱天，將羊水培養(yǎng)瓶

3、置接種箱內(nèi)，吸出倒出瓶內(nèi)培養(yǎng)液，加 入新鮮F10培養(yǎng)液2. lml和小牛血清0. 9ml,塞緊瓶塞。5、 倒 置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況。如已貼壁生長，以后每天置倒置顯微鏡下 觀察一次。6、 當(dāng) 羊水瓶瓶壁布滿圓形細(xì)胞或出現(xiàn)兒個小島布滿許多圓形細(xì)胞。每個圓形細(xì) 胞飽滿，邊緣清晰，胞核清楚，內(nèi)含絲狀物。細(xì)胞腫脹似阿米巴原蟲伸出的偽足，象要破 裂似的。有的圓形細(xì)胞透亮，成雙成對。此時羊水培養(yǎng)的細(xì)胞可以收獲。一般曠12 天可以收獲。收獲前視細(xì)胞生長悄況更換新鮮培養(yǎng)液。7、于培養(yǎng)終止前 4'6小時 , 每個培養(yǎng)瓶中參加秋水仙素，最終濃度為2、3ug/ml 放入溫箱繼續(xù)培養(yǎng)。三、制片：1、細(xì)胞收

4、獲:將培養(yǎng)液移至離心管內(nèi)，加 EDTA-胰酶消化液2ml,置37 C恒溫 箱 中 5分鐘，用滴管吸打 3? 4次, 然后把消化液移到離心管中，再用 0. 85% NaCl 沖 冼培 養(yǎng)瓶內(nèi)殘留細(xì)胞，合并到離心管中。2、 離心(1000八1500r/min)6"7分鐘，棄去上清液，留細(xì)胞沉淀0. 20. 3 ml加 預(yù)溫 至370C低滲液(0.4%枸椽酸鈉與0. 4%KCI 1:1) 5滴以手指輕輕彈起或氣泡沖 勻加至 5ml ,370C 低滲 5 分鐘。3、預(yù)固定，加固定液 (甲醇: 冰酷酸為 3:1) 7 滴，輕輕用氣泡沖勻，離心 (lOOOToOOr/min) 5 分鐘。4、固定

5、，棄去上清液，加固定液 4ml 混勻，固定 40 分鐘，離心棄去上清液 ; 第 二次固定，加固定液2ml,輕輕以氣泡沖勻，固定 20分鐘。5、滴片，離心 (1000"1500r/min)5 分鐘，棄去上清液，加新鮮固定液 34滴, 氣 泡 沖勻，滴片3張。標(biāo)本放600C烤箱，烤16、24小時，即可進(jìn)行顯帶。四、影響培養(yǎng)成功的關(guān)鍵問題：1、培養(yǎng)基PH值以6. 8、6. 9為宜,PH值低于6. 4或高于7. 0,細(xì)胞不易貼璧生 長。2、小牛血清建議用混合小牛血清，應(yīng)在零下 20 度低溫保存。3、培養(yǎng)過程必須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作規(guī)程 , 防止培養(yǎng)物被污染。4、每一步操作都要輕，離心時間不能太長，速度不能太快。5、直觀羊水中混有血液的標(biāo)本可提前一天換液。五、禁忌癥：1、孕周小于 14周或大于 24周