流式細(xì)胞儀分析技術(shù)及應(yīng)用ppt課件

1、 流式細(xì)胞儀 分析技術(shù)及運(yùn)用 FCM FCM是以流式細(xì)胞儀為檢測(cè)是以流式細(xì)胞儀為檢測(cè)手段的一項(xiàng)能快速、準(zhǔn)確的對(duì)手段的一項(xiàng)能快速、準(zhǔn)確的對(duì)單個(gè)細(xì)胞理化特性進(jìn)展多參數(shù)單個(gè)細(xì)胞理化特性進(jìn)展多參數(shù)定量分析和分選的新技術(shù)。定量分析和分選的新技術(shù)。什么是流式細(xì)胞術(shù)什么是流式細(xì)胞術(shù)(FCM)(FCM)？第一節(jié)第一節(jié) 流式細(xì)胞儀的分析及分選原理流式細(xì)胞儀的分析及分選原理第二節(jié)第二節(jié) 數(shù)據(jù)的顯示與分析數(shù)據(jù)的顯示與分析第三節(jié)第三節(jié) 流式細(xì)胞儀分析的技術(shù)要求流式細(xì)胞儀分析的技術(shù)要求第四節(jié)第四節(jié) 流式細(xì)胞術(shù)在免疫學(xué)檢查中運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)在免疫學(xué)檢查中運(yùn)用 一一 任務(wù)原理：任務(wù)原理： FCMFCM是一種在計(jì)算機(jī)技術(shù)支持下

2、的高度是一種在計(jì)算機(jī)技術(shù)支持下的高度自動(dòng)化的細(xì)胞顯微熒光脈沖分光光度儀。自動(dòng)化的細(xì)胞顯微熒光脈沖分光光度儀。第一節(jié)第一節(jié) 流式細(xì)胞儀的分析及分選原理流式細(xì)胞儀的分析及分選原理 1 1、液流系統(tǒng)、液流系統(tǒng) 樣品流和鞘流樣品流和鞘流 2 2、光學(xué)系統(tǒng)、光學(xué)系統(tǒng) 激光、透鏡組、激光、透鏡組、 光電倍增管等。光電倍增管等。 3 3、數(shù)據(jù)處置系統(tǒng)、數(shù)據(jù)處置系統(tǒng)( (一一 根本組成構(gòu)根本組成構(gòu)Injector TipSheath fluid樣品流和鞘流樣品流和鞘流1 1、液流系統(tǒng)、液流系統(tǒng)PMTPMTPMTPMTDichroicFiltersBandpassFiltersLaser 1234Flow ce

3、ll 激光、透鏡組、光電倍增等。激光、透鏡組、光電倍增等。2 2、光學(xué)系統(tǒng)、光學(xué)系統(tǒng) 二二 根本任務(wù)原理根本任務(wù)原理單細(xì)胞流：流動(dòng)室單細(xì)胞流：流動(dòng)室單細(xì)胞照明：激光單細(xì)胞照明：激光488 nm laser488 nm laser單細(xì)胞檢測(cè)：信號(hào)處置單細(xì)胞檢測(cè)：信號(hào)處置一前向散射光一前向散射光 (foword scatter)(foword scatter)：FSCFSC 信號(hào)的強(qiáng)弱與細(xì)胞的大小相關(guān)信號(hào)的強(qiáng)弱與細(xì)胞的大小相關(guān)二側(cè)向散射光二側(cè)向散射光side scatter)side scatter)：SSCSSC 信號(hào)的強(qiáng)弱與細(xì)胞內(nèi)的顆粒多少相關(guān)信號(hào)的強(qiáng)弱與細(xì)胞內(nèi)的顆粒多少相關(guān)二二 散射光的測(cè)定

4、散射光的測(cè)定FALS SensorLaserForward Angle Light Scatter細(xì)胞對(duì)光的散色景象與細(xì)胞樣品制備無(wú)關(guān)細(xì)胞對(duì)光的散色景象與細(xì)胞樣品制備無(wú)關(guān). .90 Degree Light ScatterFALS Sensor90LS SensorLaser細(xì)胞對(duì)光的散色景象與細(xì)胞樣品制備無(wú)關(guān)細(xì)胞對(duì)光的散色景象與細(xì)胞樣品制備無(wú)關(guān). .前向散色光前向散色光FSCFSC側(cè)向散色光側(cè)向散色光SSCSSC 利用前向角和測(cè)向角散射光可以把外周血白細(xì)胞分成三群，淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和粒細(xì)胞。散射光的測(cè)定散射光的測(cè)定 熒光檢測(cè)器檢測(cè)特定熒光的特定發(fā)射波長(zhǎng)熒光檢測(cè)器檢測(cè)特定熒光的特定發(fā)射波長(zhǎng)一

5、光信號(hào)丈量一光信號(hào)丈量 線性放大器線性放大器 對(duì)數(shù)放大器對(duì)數(shù)放大器三三 熒光丈量熒光丈量600 nm300 nm500 nm700 nm400 nm457350514610 632488Common Laser LinesExcitationEmisson300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm二熒光補(bǔ)償二熒光補(bǔ)償 利用電子技術(shù)或計(jì)算機(jī)軟件等方法將串入相鄰熒光通道的信號(hào)加以扣除的技術(shù)稱(chēng)“熒光補(bǔ)償一分選的根本原理一分選的根本原理488 nm laser+-Charged PlatesSingle cells sortedinto test tubesFALS Sens

6、orFluorescence detector四四 細(xì)胞分選原理細(xì)胞分選原理陽(yáng)性選擇陽(yáng)性選擇MACS-Magnetic Cell Sorting MACS-Magnetic Cell Sorting 磁珠分別磁珠分別陰性選擇陰性選擇1 1 、分選速度：幾千個(gè)細(xì)胞、分選速度：幾千個(gè)細(xì)胞/ /秒秒2 2 、分選純度、分選純度:99.5%:99.5%左右左右3 3 、分選收獲率、分選收獲率:90-95%:90-95%4 4 、分選得率、分選得率二分選的技術(shù)要求二分選的技術(shù)要求 分選純度 是指分別后的樣品中該亞群細(xì)胞所占的百分比。 分選收獲率 是指分別后所得的細(xì)胞亞群數(shù)占原細(xì)胞樣品中該亞群細(xì)胞數(shù)的百分

7、比。第二節(jié)第二節(jié) 數(shù)據(jù)的顯示和分析數(shù)據(jù)的顯示和分析 一、參數(shù)前向散射光FS: 反映顆粒的大小側(cè)向散射光SS: 細(xì)胞內(nèi)部構(gòu)造復(fù)雜程度熒光FL: 細(xì)胞被染上熒光部分?jǐn)?shù)量的多少二、數(shù)據(jù)的顯示方式二、數(shù)據(jù)的顯示方式一一 單參數(shù)直方圖單參數(shù)直方圖二二 雙參數(shù)顯示雙參數(shù)顯示三三 三參數(shù)顯示三參數(shù)顯示 以分布直方圖( distribution histogram )來(lái)顯示，橫軸為該參數(shù)丈量強(qiáng)度相對(duì)值，單位是道數(shù)。強(qiáng)度分布可以是線性的，也可以是對(duì)數(shù)的。縱軸普通是細(xì)胞數(shù)或細(xì)胞出現(xiàn)的頻數(shù)。( (一一) ) 單參數(shù)直方圖的顯示單參數(shù)直方圖的顯示Single-Parameter Histogram DisplaysX

8、軸表示綠熒光信號(hào)軸表示綠熒光信號(hào)(CD3)強(qiáng)弱強(qiáng)弱,Y軸那么反響細(xì)胞的數(shù)軸那么反響細(xì)胞的數(shù)量量.( (二二) )雙參數(shù)數(shù)據(jù)的顯示雙參數(shù)數(shù)據(jù)的顯示Two-Parameter Data DisplaysTwo-Parameter Data Displays 細(xì)胞雙參數(shù)測(cè)定不僅能提供二個(gè)參數(shù)各自與細(xì)胞數(shù)量的關(guān)系，更重要的是獲得了這二個(gè)參數(shù)之間的相關(guān)關(guān)系，其中包含了更多的生物學(xué)信息。雙參數(shù)數(shù)據(jù)顯示最常用的是二維的散點(diǎn)圖( Dot Plot )。在二維圖上，橫軸代表第一個(gè)丈量參數(shù)，縱軸代表第二個(gè)丈量參數(shù)。 縱軸與橫軸分別代表被測(cè)細(xì)胞的兩個(gè)丈量縱軸與橫軸分別代表被測(cè)細(xì)胞的兩個(gè)丈量參數(shù)參數(shù), ,在圖中每一個(gè)

9、點(diǎn)代表一個(gè)細(xì)胞在圖中每一個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)細(xì)胞1 1 、點(diǎn)圖、點(diǎn)圖 用等高線來(lái)表示細(xì)胞數(shù)，在一條等高線上細(xì)胞數(shù)相用等高線來(lái)表示細(xì)胞數(shù)，在一條等高線上細(xì)胞數(shù)相同，不同的等高線上細(xì)胞數(shù)不同。同，不同的等高線上細(xì)胞數(shù)不同。2 、二維等高圖、二維等高圖 縱軸與橫軸分別代表被測(cè)細(xì)胞的兩個(gè)丈量參縱軸與橫軸分別代表被測(cè)細(xì)胞的兩個(gè)丈量參數(shù)數(shù),Z,Z軸為細(xì)胞數(shù)。軸為細(xì)胞數(shù)。3 、假三維等高圖、假三維等高圖 三維坐標(biāo)勻?yàn)閰?shù)散射光或熒光而三維坐標(biāo)勻?yàn)閰?shù)散射光或熒光而非細(xì)胞數(shù)。非細(xì)胞數(shù)。( (三三) ) 三參數(shù)直方圖三參數(shù)直方圖 普通利用所得參數(shù)的兩兩組合并利用設(shè)門(mén)普通利用所得參數(shù)的兩兩組合并利用設(shè)門(mén)Gate)技術(shù)，來(lái)

10、分析參數(shù)之間的相互關(guān)系。技術(shù)，來(lái)分析參數(shù)之間的相互關(guān)系。四流式細(xì)胞儀的多參數(shù)分析四流式細(xì)胞儀的多參數(shù)分析1 、Region設(shè)置設(shè)置2 、 設(shè)置設(shè)置Gate 樣品制備：?jiǎn)渭?xì)胞懸液 特定熒光染料的選擇：光譜重疊 陰性對(duì)照的設(shè)置:檢測(cè)標(biāo)本的反復(fù)性 質(zhì)量控制第三節(jié)第三節(jié) 流式細(xì)胞儀免疫分析的技術(shù)要求流式細(xì)胞儀免疫分析的技術(shù)要求 細(xì)胞碎片細(xì)胞碎片 細(xì)胞團(tuán)塊細(xì)胞團(tuán)塊 離心漂洗離心漂洗 固定劑固定劑一、免疫檢測(cè)樣品制備一、免疫檢測(cè)樣品制備 淋巴細(xì)胞分別液分別外周血中單個(gè)核細(xì)胞。淋巴細(xì)胞分別液分別外周血中單個(gè)核細(xì)胞。Ficoll,40kdFicoll,40kd，高密度，低浸透壓，無(wú)毒性。，高密度，低浸透壓，無(wú)

11、毒性。比重為比重為1.01771.01770.0010.001的分層液的分層液).).一外周血淋巴細(xì)胞樣品的制備一外周血淋巴細(xì)胞樣品的制備 利用紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞后，得到外周血中一切白細(xì)胞的流式細(xì)胞分析的二維散色光點(diǎn)圖 單層培育細(xì)胞加蛋白酶消化后吸管吹打的方法單層培育細(xì)胞加蛋白酶消化后吸管吹打的方法使細(xì)胞從培育皿上消化下來(lái)，然后離心漂洗。使細(xì)胞從培育皿上消化下來(lái)，然后離心漂洗。 懸浮培育細(xì)胞，可不用酶消化，直接吹打制備懸浮培育細(xì)胞，可不用酶消化，直接吹打制備成單細(xì)胞懸液。成單細(xì)胞懸液。二二) ) 培育細(xì)胞的樣品制備培育細(xì)胞的樣品制備 機(jī)械法：剪碎法、網(wǎng)搓法、研磨法。機(jī)械法：剪碎法、網(wǎng)搓法、

12、研磨法。 酶處置法：胃蛋白酶、胰蛋白酶、膠原酶處置法：胃蛋白酶、胰蛋白酶、膠原酶等。酶等。 化學(xué)試劑處置法：化學(xué)試劑處置法：EDTA、EGTA等。等。 外表活性劑處置法：外表活性劑處置法： Triton-100、皂素、皂素等。等。(三三)新穎實(shí)體組織單細(xì)胞懸液的制備新穎實(shí)體組織單細(xì)胞懸液的制備 機(jī)械法往往常成嚴(yán)重的細(xì)胞損傷，而結(jié)果卻是較低的細(xì)胞產(chǎn)量。 如用低速離心去碎片，用尼龍網(wǎng)過(guò)濾團(tuán)塊等，也可利用電子學(xué)技術(shù)處置的方法排除團(tuán)塊和碎片的干擾。 酶學(xué)法、化學(xué)法對(duì)實(shí)體組織的分散效果較理想，但會(huì)呵斥所測(cè)化學(xué)成份的不良影響。FCM所測(cè)細(xì)胞是單個(gè)分散形狀；對(duì)細(xì)胞團(tuán)塊，細(xì)胞碎片盡能夠少；細(xì)胞的活性不受損害，

13、以保證下一步的熒光染色處置不受影響。 防止細(xì)胞自溶，堅(jiān)持細(xì)胞膜原有的特性保管的方法：防止細(xì)胞自溶，堅(jiān)持細(xì)胞膜原有的特性保管的方法：1 1、深低溫保管法：深低溫冰箱，保管一年。、深低溫保管法：深低溫冰箱，保管一年。2 2、乙醇與甲醇保管法：、乙醇與甲醇保管法：70%70%冷乙醇、冷乙醇、75%75%的甲醇。的甲醇。3 3、甲醛或多聚甲醛固定法：細(xì)胞不具有生物活性，但、甲醛或多聚甲醛固定法：細(xì)胞不具有生物活性，但 細(xì)胞外表熒光染色分析不受影響。細(xì)胞外表熒光染色分析不受影響。( (四單細(xì)胞懸液的保管四單細(xì)胞懸液的保管 染料的選擇和標(biāo)志染色保證了熒光信號(hào)的產(chǎn)生一免疫熒光標(biāo)志最常用的熒光染料熒光染料熒光

14、染料 激發(fā)波長(zhǎng)激發(fā)波長(zhǎng)nm) 發(fā)射波長(zhǎng)發(fā)射波長(zhǎng)nm) 顏色顏色FITC 488 525 深藍(lán)色PE(RDI) 488 575 橙色ECD 488 620 橙紅色PeCy-5 488 670 紅色PeCy-7 488 755 深紅色PI 488 620 橙紅色APC 633 670 紅色FITC 488 525 深藍(lán)色PE(RDI) 488 575 橙色ECD 488 620 橙紅色PeCy-5 488 670 紅色PeCy-7 488 755 深紅色PI 488 620 橙紅色APC 633 670 紅色二、免疫分析中常用的熒光染料與標(biāo)志染色二、免疫分析中常用的熒光染料與標(biāo)志染色 用化學(xué)法將兩

15、種不同激發(fā)波長(zhǎng)的染料結(jié)合在一同，在488nm波長(zhǎng)激發(fā)光激發(fā)后產(chǎn)生的發(fā)射波長(zhǎng)激發(fā)另一熒光染料產(chǎn)生的熒光信號(hào)。LaserCY5PECY5CY5488nm能量傳送染料：能量傳送染料：熒光染料與細(xì)胞成分的結(jié)合方式：熒光染料與細(xì)胞成分的結(jié)合方式： 構(gòu)造親和方式構(gòu)造親和方式 嵌入結(jié)合方式嵌入結(jié)合方式 共價(jià)結(jié)合方式共價(jià)結(jié)合方式 熒光抗體特異性結(jié)合方式熒光抗體特異性結(jié)合方式1、直接免疫熒光染色、直接免疫熒光染色2、間接免疫熒光染色、間接免疫熒光染色二免疫熒光標(biāo)志二免疫熒光標(biāo)志3、雙或多參數(shù)熒光抗體的組合標(biāo)志、雙或多參數(shù)熒光抗體的組合標(biāo)志FITC+PE 488 525 、575 綠色、橙色綠色、橙色FITC+T

16、 red 488 525 綠色綠色 568 615 紅色紅色FITC+PeCy5 488 525、 675 綠色、綠色、 紅色紅色FITC+ ECD 488 525、 625 綠色、橙紅色綠色、橙紅色F+P +PeCy5 488 525、575、675 綠、橙、紅色綠、橙、紅色F+ ECD +PeCy5 488 525、575、675 綠、綠、 橙紅色、紅色橙紅色、紅色F+P+APC 488 525 、 575 綠色、橙色綠色、橙色 633 670 紅色紅色熒光染料熒光染料 激發(fā)波長(zhǎng)激發(fā)波長(zhǎng)nm) 發(fā)射波長(zhǎng)發(fā)射波長(zhǎng)nm) 顏色顏色 FITC FITC的激發(fā)的激發(fā)波優(yōu)點(diǎn)于自發(fā)波優(yōu)點(diǎn)于自發(fā)熒光的光

17、譜區(qū)熒光的光譜區(qū)內(nèi)，因此內(nèi)，因此FITCFITC熒光易受自發(fā)熒光易受自發(fā)熒光的干擾。熒光的干擾。( (三三) ) 細(xì)胞的自發(fā)熒光細(xì)胞的自發(fā)熒光一單細(xì)胞懸液制備的質(zhì)量控制一單細(xì)胞懸液制備的質(zhì)量控制二細(xì)胞懸液免疫熒光染色的質(zhì)量控制二細(xì)胞懸液免疫熒光染色的質(zhì)量控制 1、溫度對(duì)熒光染色的影響、溫度對(duì)熒光染色的影響 2、pH對(duì)熒光發(fā)射強(qiáng)度的影響對(duì)熒光發(fā)射強(qiáng)度的影響 3、熒光染料濃度的控制、熒光染料濃度的控制 4、固定劑對(duì)熒光染色的影響、固定劑對(duì)熒光染色的影響三儀器操作技術(shù)的質(zhì)量控制三儀器操作技術(shù)的質(zhì)量控制三、流式細(xì)胞免疫學(xué)技術(shù)的質(zhì)量控制三、流式細(xì)胞免疫學(xué)技術(shù)的質(zhì)量控制 1 1、同型對(duì)照：選用一樣源性的未

18、標(biāo)志單抗作為、同型對(duì)照：選用一樣源性的未標(biāo)志單抗作為同型對(duì)照陰性對(duì)照同型對(duì)照陰性對(duì)照 2 2、全程質(zhì)控：在流式檢測(cè)中，樣品標(biāo)志、溶血、全程質(zhì)控：在流式檢測(cè)中，樣品標(biāo)志、溶血、洗滌、儀器質(zhì)量控制和上機(jī)檢測(cè)的過(guò)程都會(huì)直接影洗滌、儀器質(zhì)量控制和上機(jī)檢測(cè)的過(guò)程都會(huì)直接影響檢測(cè)結(jié)果。采用規(guī)范質(zhì)控樣品來(lái)進(jìn)展全程質(zhì)控，響檢測(cè)結(jié)果。采用規(guī)范質(zhì)控樣品來(lái)進(jìn)展全程質(zhì)控，使得同類(lèi)實(shí)驗(yàn)室建立質(zhì)控比對(duì)，數(shù)據(jù)可以互用。使得同類(lèi)實(shí)驗(yàn)室建立質(zhì)控比對(duì)，數(shù)據(jù)可以互用。四免疫檢測(cè)的質(zhì)量控制四免疫檢測(cè)的質(zhì)量控制一、淋巴細(xì)胞及其亞群的分析一、淋巴細(xì)胞及其亞群的分析 淋巴細(xì)胞是機(jī)體免疫系淋巴細(xì)胞是機(jī)體免疫系統(tǒng)中的一群重要細(xì)胞群，統(tǒng)中的一群

19、重要細(xì)胞群，是參與免疫調(diào)理和執(zhí)行細(xì)是參與免疫調(diào)理和執(zhí)行細(xì)胞免疫功能的免疫活性細(xì)胞免疫功能的免疫活性細(xì)胞，胞，T細(xì)胞、細(xì)胞、B細(xì)胞和細(xì)胞和NK細(xì)胞，各自發(fā)揚(yáng)不同的作細(xì)胞，各自發(fā)揚(yáng)不同的作用。用。第四節(jié)第四節(jié) 流式細(xì)胞在免疫學(xué)檢查中的運(yùn)用流式細(xì)胞在免疫學(xué)檢查中的運(yùn)用三色標(biāo)志三色標(biāo)志 淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞T、B、 NK1、Th 細(xì)胞：細(xì)胞：CD3+ CD4 + CD8-T細(xì)胞，能輔助細(xì)胞，能輔助B細(xì)胞分化成熟生細(xì)胞分化成熟生成抗體產(chǎn)生細(xì)胞成抗體產(chǎn)生細(xì)胞槳細(xì)胞，參槳細(xì)胞，參與促進(jìn)細(xì)胞介導(dǎo)與促進(jìn)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)對(duì)。的免疫應(yīng)對(duì)。一淋巴細(xì)胞及其亞群分析一淋巴細(xì)胞及其亞群分析2 2、TcTc細(xì)胞：細(xì)胞： CD3+

20、CD3+ CD4 - CD8 +T CD4 - CD8 +T細(xì)胞，細(xì)胞，能特異性直接殺傷能特異性直接殺傷靶細(xì)胞，一切表達(dá)靶細(xì)胞，一切表達(dá)MHC IMHC I類(lèi)分子的靶類(lèi)分子的靶細(xì)胞?？鼓[瘤免疫，細(xì)胞。抗腫瘤免疫，抗病毒感染，移植抗病毒感染，移植排斥反響和本身免排斥反響和本身免疫疾病中均起了重疫疾病中均起了重要作用。要作用。 B B細(xì)胞約為細(xì)胞約為5%-10%5%-10%，標(biāo)志，標(biāo)志為為BCRBCR，膜外表免疫球蛋白，膜外表免疫球蛋白SmlgSmlg。表達(dá)。表達(dá)CD19CD19、 CD20CD20、CD21CD21、CD22CD22分子。分子。B B細(xì)胞也是免疫系統(tǒng)重要細(xì)胞也是免疫系統(tǒng)重要的免疫

21、細(xì)胞，主要功能是的免疫細(xì)胞，主要功能是介導(dǎo)體液免疫?？乖f呈介導(dǎo)體液免疫?？乖f呈細(xì)胞，能攝取、加工和遞細(xì)胞，能攝取、加工和遞呈抗，同時(shí)還能分泌細(xì)胞呈抗，同時(shí)還能分泌細(xì)胞因子調(diào)理免疫應(yīng)對(duì)。因子調(diào)理免疫應(yīng)對(duì)。( (二二B B淋巴細(xì)胞及其亞群淋巴細(xì)胞及其亞群 自然殺傷細(xì)胞自然殺傷細(xì)胞Natural killer cell,NK Natural killer cell,NK 細(xì)胞為一細(xì)胞為一組大顆粒的淋巴細(xì)胞，組大顆粒的淋巴細(xì)胞，5%-10% 5%-10% 左右，標(biāo)志左右，標(biāo)志CD16CD16、CD56CD56、CD2CD2、CD11a/CD18CD11a/CD18。用三色熒光標(biāo)志將。用三色熒光標(biāo)志將CD3-CD16+CD56+CD3-CD16+CD56+淋巴淋巴細(xì)胞定為細(xì)胞定為NKNK細(xì)胞。主要功能是參與細(xì)胞免疫，在腫瘤免疫細(xì)胞。主要功能是參與細(xì)胞免疫，在腫瘤免疫抗病毒感染中均起重要作用?？共《靖腥局芯鹬匾饔谩Ｈ齆KNK細(xì)胞分析細(xì)胞分析 一細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)一細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)二細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子測(cè)定二細(xì)胞內(nèi)細(xì)