肝糖原的提取、鑒定與定量實驗報告材料

1、南方醫(yī)科女曇生物化學(xué)實驗報告姓 名: 學(xué) 號: 專業(yè)年級: 組 另I:生物化學(xué)與分子生物學(xué)實驗教學(xué)中心實驗名稱肝糖原的提取、鑒定與定量實驗日期實驗地點合作者指導(dǎo)老師評分XX教師簽名 某某批改日期 2013-06-03格式要求：正文請統(tǒng)一用：小四號，宋體,1.5倍行距；數(shù)字、英文用Times NewRoman 標(biāo)題用：四號，黑體，加粗。需強(qiáng)調(diào)的地方請用藍(lán)顏色標(biāo)出。不得出現(xiàn)多行、 多頁空白現(xiàn)象。一、實驗?zāi)康?、掌握組織樣品的制備方法，了解其注意事項。2、了解肝糖原提取、糖原和葡萄糖鑒定與蒽酮比色測定糖原含量的原理和注意事項， 掌握其操作方法。3、正確操作使用刻度吸管和可調(diào)微量取液器。4、熟練運(yùn)用溶

2、液混勻的各種方法。5、正確掌握溶液轉(zhuǎn)移的操作。6、正確操作使用分光光度計。二、實驗原理1、肝糖原的提取與鑒定糖原儲存于細(xì)胞，采用研磨勻漿等方法可使細(xì)胞破碎，低濃度的三氯醋酸能使蛋白 質(zhì)變性，破壞肝組織中的酶且沉淀蛋白質(zhì)，而糖原仍穩(wěn)定地保存于上清液中，從而使用 糖原與蛋白質(zhì)等其它成分分離開來。糖原不溶于乙醇而溶于熱水，故先用95%乙醇將濾 液中糖原沉淀，再溶于熱水中。.下載可編輯.糖原水溶液呈乳樣光澤，遇碘呈紅棕色。這是糖原中葡萄糖長鏈形成的螺旋中,依靠分子間引力吸附碘分子后呈現(xiàn)的顏色。糖原還可被酸水解為葡萄糖，利用呈色反應(yīng) 和葡萄糖的還原性，可判定肝組織中糖原的存在。CuSO十 2NaOH =

3、 NaSO+Cu(OH) J2Cu(OH十C6H2Q = 2CuOHf氧化型葡萄糖+HO2CuOH = C12OJ (紅色)+H2OCu(OH=CuQ (黑色)+H2O2、肝糖原定量測定糖原在濃酸中可水解成為葡萄糖，濃硫酸能使葡萄糖進(jìn)一步脫水生成糠醛衍生物一5-羥甲基呋喃甲醛，此化合物再與蒽酮脫水縮合生成藍(lán)色的化合物。該物質(zhì)在620nm處有最大吸收。糖含量在(10100)g圍，溶液顏色的深淺與可溶性糖含量成正比。利用此反應(yīng)與同樣處理的已知葡萄糖含量標(biāo)準(zhǔn)溶液比色，通過標(biāo)準(zhǔn)對照法(直接比較法)即 可計算出樣品中糖原的含量。糖原在濃堿溶液中非常穩(wěn)定，故在顯色之前，肝組織先臵 于濃堿中加熱，以破壞其它

4、成分，而保留肝糖原。三、材料與方法：以流程圖示意1、材料:(1) 樣品：雞肝(2) 試劑：95聽醇、5%(W/V 三氯乙酸、濃鹽酸、12.5mol/L (50% NaOH溶液、碘 試劑、班氏試劑、5.35mol/L (30% KOH溶液、標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液(50mg/L)、蒽酮顯色劑(3) 儀器和器材：普通離心機(jī)、室溫-100 °C恒溫水浴箱、可見光分光光度計、托盤天平、剪刀、鑷子、研缽、試管架、離心管、試管、100mm*15m試管、刻度吸量管(2ml、5ml )、1000卩l(xiāng)微量可調(diào)取液器、100ml容量瓶、白瓷反應(yīng)板2、方法:(1)肝糖原的提取與鑒定沉淀(棄去)1上清液(棄去)沉淀沸水

5、浴2min ,溶解沉淀白瓷板孔穴中糖原溶液1ml加碘試劑2滴糖原溶液2滴加碘試劑2滴+濃HCL5滴屮呈色對比+50%NaOH 5 滴沸水浴15min，冷卻2滴糖原水解液+班氏試劑4滴糖原水解液混勻沸水浴2min，觀察變化(2)肝糖原定量測定四、結(jié)果與討論： 結(jié)果：實驗數(shù)據(jù)、現(xiàn)象、圖譜；討論：以結(jié)果為基礎(chǔ)的邏輯 推論，并得出結(jié)論。1、結(jié)果:（1）實驗現(xiàn)象：1）肝糖原的提取與鑒定第一次離心后，肝勻漿分為2層，上層為上清液，不完全澄清，下層為淡褐色沉淀。圖1肝勻漿圖2肝勻漿第一次離心后加入乙醇混勻并靜置后，溶液分層，上層為上清液，下層有白色絮狀沉淀。第二次離心后，溶液分為2層，上層為上清液，試管底部

6、有少量白色沉淀圖3第二次離心后的白色沉淀 加入蒸餾水并沸水浴后，白色沉淀溶解 白瓷板上，糖原溶液加碘試劑后呈紅棕色，與碘自身的黃色有明顯區(qū)別碘試劑2滴碘試劑2滴 糖原溶液2滴圖4呈色對比結(jié)果（左為糖原溶液加碘試劑，右為碘試劑） 往糖原水解液中加入班氏試劑后，溶液呈藍(lán)色（班氏試劑本身為藍(lán)色）。沸水浴后,溶液變?yōu)榇u紅色（生成磚紅色沉淀）圖5糖原水解液圖6沸水浴前2）肝糖原定量測定圖7沸水浴后往雞肝中加入KOH并沸水浴后，溶液變?yōu)榧t棕色圖8沸水浴后，溶液變?yōu)榧t棕色水浴前，空白管呈黃色，標(biāo)準(zhǔn)管呈綠色，樣品管呈黃色（顏色比空白管淺）。水浴后,空白管無明顯變化，標(biāo)準(zhǔn)管顏色略變深，樣品管由黃色變?yōu)樯罹G色（顏

7、色比標(biāo)準(zhǔn)管深）圖9水浴前圖10水浴后（2）實驗數(shù)據(jù):測定次數(shù)標(biāo)準(zhǔn)管樣品管10.5930.40120.5930.39730.5940.396平均值0.5930.398表1標(biāo)準(zhǔn)管和樣品管測得的吸光度（A620）及平均值按下式計算樣品中肝糖原的含量：A 樣品100100肝糖原（g/100g 肝組織）=* 0.05 * * 1.11A標(biāo)準(zhǔn)肝組織重（g）1000由于樣品稀釋了一倍，因此計算結(jié)果需乘二。結(jié)果：肝糖原的含量為4.966g/100g肝組織。故本次實驗結(jié)論為：該雞肝樣品含有肝組織，且肝糖原含量為4.966g/100g肝組織。2、討論:（1）實驗數(shù)據(jù)分析：本次實驗測得肝糖原含量為 4.966g/1

8、00g肝組織。查書得飽食雞 肝肝糖原含量為23g/100g肝組織。本次實驗結(jié)果偏大，說明肝組織中含有過多肝糖原, 試驗所用雞肝為脂肪肝。（2）呈色對比結(jié)果分析：糖原溶液與碘試劑反應(yīng)呈紅棕色，與碘試劑本身的黃色區(qū)別明顯，說明糖原含量較大。（3）糖原水解液與班氏試劑反應(yīng)結(jié)果分析：該反應(yīng)主要是通過檢測葡萄糖與班氏試劑的還原性糖反應(yīng)間接鑒定溶液中糖原的存在。糖原溶液被濃鹽酸水解為葡萄糖，葡萄糖 中的醛基可被Cu（OH氧化為羧基，即把葡萄糖氧化為葡萄糖酸，CF則被還原生成Cu2O 磚紅色沉淀。因此水浴后，溶液由藍(lán)色變?yōu)榇u紅色，實驗現(xiàn)象明顯。（4）注意事項：1）蒽酮試劑為濃硫酸所配制，使用時應(yīng)小心謹(jǐn)慎。若不慎沾到皮膚上，應(yīng)立即用大量 清水沖洗。2）離心后，用移液槍吸取上清液時應(yīng)避免槍頭觸及沉淀，否則會使沉淀物上浮，導(dǎo)致 上清液渾濁。避免將槍頭伸到液面下再按按鈕，否則槍頭噴出的氣泡也會激起沉淀物。3）打開室溫-100 C恒溫水浴箱蓋子時要小心水蒸氣，以免燙傷。4）使用離心機(jī)時要注意配平，否則會損