設(shè)計(jì)RTPCR引物方法

1、設(shè)計(jì)RT-PCR引物方法要鑒定某一個(gè)基因在mRNA水平上的表達(dá)，需要使用Q-PCR的方法。引物設(shè)計(jì)是很重要的一環(huán)，要進(jìn)行Q-PCR時(shí)，獲得引物的途徑有很多種，其中最為方便的是使用NCBI和primer bank，首先介紹這一方法：比如你要檢測(cè)某藥物對(duì)小鼠細(xì)胞中IL-2的表達(dá)影響，通過(guò)Q-PCR檢測(cè)，要設(shè)計(jì)引物。 登陸NCBI，選擇gene，在選框中輸入 IL-2 mus（搜索小鼠IL-2基因）點(diǎn)擊搜索獲得結(jié)果如下：選擇第一個(gè)基因，打開(kāi)，可以獲得gene的ID利用primer bank和ncbi的gene ID就可以獲得前人已經(jīng)設(shè)計(jì)好的引物 登陸primer bank （），按下圖選擇NCBI

2、gene ID 選擇物種 mouse ，在 for text中輸入前面獲得的你要檢測(cè)基因的ID（NCBI的編號(hào)）點(diǎn)擊submit 查詢(xún)，獲得如下結(jié)果可以看到其它人設(shè)計(jì)的好幾對(duì)引物，基本上是通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的，做Q-PCR的話(huà)直接拿來(lái)用就行了，點(diǎn)擊綠色高亮的鏈接可以看到其他人使用這對(duì)引物做Q-PCR獲得的結(jié)果。二、自己設(shè)計(jì)Q-PCR引物方法比如要檢測(cè)CXCR3的表達(dá)，做Q-PCR的擴(kuò)增目的條帶在100bp左右，如果半定量的話(huà)（通過(guò)跑膠定量）擴(kuò)增產(chǎn)物一般400bp左右 登陸NCBI，選擇gene，在選框中輸入 CXCR3 mus（搜索小鼠CXCR3基因）點(diǎn)擊搜索點(diǎn)擊打開(kāi)將網(wǎng)頁(yè)往下拖到NCBI refe

3、rence sequence 選擇箭頭所示mRNA序列打開(kāi)鏈接往網(wǎng)頁(yè)下方拖動(dòng)，可以看到CDS，點(diǎn)擊CDS（編碼蛋白區(qū)）出現(xiàn)如下界面，高亮部分為CDS去ATG起始密碼子TAA終止密碼子復(fù)制CDS區(qū)及其附近部分序列，如果要提取基因的話(huà)需要完全包括CDS區(qū)，如果只是檢測(cè)的話(huà)，比如半定量的話(huà)就沒(méi)必要全部包括。打開(kāi)primer 5 軟件，新建一個(gè)DNA序列將復(fù)制的序列粘貼到選項(xiàng)框中，點(diǎn)擊oK序列就導(dǎo)入了primer 5中，然后單擊箭頭所指primer，進(jìn)入引物設(shè)計(jì)界面界面如下，點(diǎn)擊search，使用primer自動(dòng)尋找引物功能進(jìn)入界面后，分別按下圖選取所需要的參數(shù)，PCR product size使用默

4、認(rèn)值即可，primer length一般在20bp左右比較合適點(diǎn)擊OK后進(jìn)入如下界面，點(diǎn)擊OK出現(xiàn)如下界面，點(diǎn)擊rating，按打分排列，打分是100分制，分值越高引物越好，根據(jù)自己試驗(yàn)?zāi)康模x擇打分高的，產(chǎn)物片段400bp左右的引物對(duì)，并且Tm溫度最好在60以上，有義鏈和反義鏈Tm值靠的越近越好，最好不要超過(guò)2攝氏度，下圖中Tm行中藍(lán)色字體表示有義鏈的Tm值，紅色字體表示反義鏈Tm值，PCR退火溫度一般設(shè)置比Tm值低5攝氏度。我選擇的是排行第四的引物對(duì)，單擊選擇后在，引物設(shè)計(jì)窗口，我們可以看到這對(duì)引物的具體情況，下圖中紅色箭頭指的S和A分別指的是有義鏈和反義鏈，點(diǎn)擊edit primers可

5、以復(fù)制編輯引物選擇引物序列，復(fù)制到word文檔中作為正向引物點(diǎn)擊ok后回到primer 界面后點(diǎn)擊A，然后點(diǎn)擊Edit primers獲得反向引物序列下面是我獲得的引物序列因?yàn)樽霭攵康哪０迨钦麄€(gè)小鼠基因組，這就需要使用primer-blast驗(yàn)證引物的特異性（是否不會(huì)擴(kuò)增出其它的基因）進(jìn)入primer-blast網(wǎng)站()在primer parameters中輸入前面設(shè)計(jì)的正向引物和反向引物在primer pair specificity checking中選擇database為refseq mRNA ，organism中輸入mouse后選擇mouse最后選擇如下，選擇在新窗口中顯示結(jié)果，點(diǎn)擊

6、get primer。最后出現(xiàn)如下結(jié)果，反饋的結(jié)果中就只有一個(gè)基因CXCR3，就是我要檢測(cè)的基因，證明這對(duì)引物的特異性不錯(cuò)，可以用于實(shí)驗(yàn)。并不是選擇的每一對(duì)引物通過(guò)blast后就只有一個(gè)基因，很多情況下回出現(xiàn)不是只有一個(gè)基因的情況，情況如下圖，那就需要再次設(shè)計(jì)，然后檢驗(yàn)，直到獲得特異的結(jié)果。獲得特異性結(jié)果后，可以使用oligo7對(duì)所設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行評(píng)價(jià)，另外使用primer5的設(shè)計(jì)的引物在很多情況下總是特異性不是很好，也可以使用oligo7設(shè)計(jì)引物，oligo7設(shè)計(jì)的引物特異性會(huì)好一些。使用oligo 7設(shè)計(jì)引物新建一個(gè)序列將mRNA的序列粘貼到新建對(duì)話(huà)框中，選擇accept&close

7、選擇search for primers& probes分別單擊paremeters和ranges在parameters中根據(jù)圖所示選擇引物長(zhǎng)度（一般在20bp左右）在ranges中選擇PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度范圍和設(shè)計(jì)引物的范圍單擊search后出現(xiàn)引物對(duì)選擇selected oligonucleotides單擊選擇評(píng)分最高的引物 ，然后選擇edit中forward primer 和reverse primer，復(fù)制所設(shè)計(jì)引物到進(jìn)入primer-blast網(wǎng)站 ()進(jìn)行特異性檢驗(yàn)選擇analysis中的PCR，查看引物的最適退火溫度另外設(shè)計(jì)RT-PCR 引物最好跨內(nèi)含子，設(shè)計(jì)方法如下問(wèn)題一：如何在pubmed上找到目標(biāo)基因的DNA序列以及其內(nèi)含子和外顯子情況。步驟：打開(kāi)NCBI主頁(yè)面，選GENE，輸入基因名稱(chēng)-顯示出很多不同種但名字相同的基因（fig.1）-找到你要的種屬，打開(kāi)-顯示基因信息，找到”Genomic regions, transcripts, and products”,點(diǎn)擊基因名稱(chēng)，links到geneback（fig.2）-顯示了該基因DNA的信息(fig.3),可以看到這是基因組DNA,從mRNA選項(xiàng)中可以看到JION后面的是外顯子的位置，