遺傳實驗教案學生

1、實驗一、 減數(shù)分裂（3學時）一、 實驗目的了解高等植物的花粉減數(shù)分裂過程，觀察其染色體的動態(tài)變化，領(lǐng)會減數(shù)分裂過程在遺傳學基本理論中的意義。二、 實驗原理減數(shù)分裂的定義減數(shù)分裂各時期的主要特征：前期I:細線期染色體成細長的線狀，核膜完整；偶線期同源染色體開始配對；粗線期非姊妹染色單體間可能發(fā)生交換；雙線期出現(xiàn)交叉；終變期交叉端化，染色體最為短粗，是計數(shù)染色體最佳的時期。中期I染色體排列在赤道板上，后期I同源染色體分開移向兩極，末期I形成兩個子細胞第二次減數(shù)分裂同有絲分裂遺傳學意義：1）遺傳 2）變異 粗線期及后期I可產(chǎn)生變異三、 用具及藥品顯微鏡、解剖針、蓋玻片、載玻片、鑷子、醋酸洋紅、卡諾固

2、定液、乙醇四、 實驗步驟1、 取材和固定培養(yǎng)大蔥，當花蕾呈嫩綠色表面光滑時進行取材，時間是上午7-10時，將花序總苞剝?nèi)?，立即投入到卡諾固定業(yè)中固定4-24小時，經(jīng)95乙醇和70乙醇各沖洗30分鐘，然后換入70乙醇中保存，4度下可保存一年以上。2、 染色取發(fā)育程度不同的花序，每個花序按上、中、下不同部位分別鑷取2-3個花蕾放于載片上，用解剖針剝出花藥，加1滴醋酸洋紅染色液，用解剖針反復擠壓花藥，使花粉母細胞進入染液中，染色5-10分鐘。較大的花藥可以用刀片橫切成3-4段，然后再擠壓。3、 壓片將載玻片放在酒精燈上微烤幾次，在材料處加上蓋玻片覆以吸水紙，用拇指均勻用力壓片。4、 觀察五、 作業(yè)繪

3、出所觀察的花粉母細胞減數(shù)分裂各個時期的分裂相。六、 注意事項1、 操作過程盡量減少花粉母細胞的遺失2、 注意區(qū)分第一次減數(shù)分裂和第二次減數(shù)分裂的細胞（第一次細胞為一個大的圓形的細胞，第二次為兩個長橢圓型的細胞）3、 區(qū)分花粉母細胞和花藥壁細胞（后者為半月型細胞核均勻）4、 前期、中期區(qū)別核膜有無，后期、末期區(qū)分細胞板是否形成需要配制藥品：實驗二、 染色體組型分析（6學時）一、實驗目的學習染色體組型分析的方法，了解染色體組型分析的意義二、實驗原理2 / 16染色體組（genome）：一個二倍體生物配子所含有的全套染色體，稱為一個染色體組。而染色體組在細胞分裂中期的表型稱為染色體組型或稱核型，包括

4、染色體數(shù)目（即基數(shù)）、形態(tài)、大小、著絲點位置及副縊痕、隨體的有無等特征。染色體組型分析就是通過對染色體標本和其照片進行測量、對比分析、配對分組、排列，對組內(nèi)各染色體的形態(tài)進行測量、描述，從而闡明生物染色體組成的過程。染色體組型分析的意義：1） 分析未知生物的染色體數(shù)目，推斷其倍數(shù)。首先計數(shù)總的染色體數(shù)目，然后根據(jù)染色體的形態(tài)特征進行分組、配對。2） 將未知生物的染色體組型特征與已知生物的染色體組型特征進行比較，進而對未知生物進行分類，歸屬于具體的門、綱、目、科、屬、種、甚至亞種。3） 染色體組型分析可以用來鑒別染色體變異包括結(jié)構(gòu)變異和倍數(shù)性變異。三、用具與藥品剪刀、鑷子、直尺、硬紙板、漿糊等四

5、、 實驗步驟1、 制作有絲分裂中期染色體玻片標本采用植物根尖（如蠶豆、洋蔥、大蒜、玉米等）去壁低滲法培養(yǎng)材料預處理前低滲固定酶解去壁后低滲滴片染色2、 選材與顯微攝影選材：細胞間無重疊，胞內(nèi)染色體數(shù)目完整，每條染色體間無重疊，分散良好，染色體粗細適中，都伸展開，處于同一平面上，并且染色鮮明、形態(tài)清晰、著絲粒明顯，隨體可見。選取上述的細胞進行顯微照相。取清楚的底片放大成8cm x 4cm左右的黑白照片。萬壽菊7對14條3、 測量（首先對每條染色體隨機標號）測量每條染色體的長臂長度和短臂長度。以著絲粒為起點（若著絲粒過大將其一分為二）分別量至長臂末端和短臂末端（以中間為準）單位為毫米，有隨體的染色

6、體，隨體的長度可以記入也可以不記入染色體長度之內(nèi)，但應說明。另外染色體彎曲不能用直尺測量的，可以先用細線量取與染色體等長的長度，再用尺子量出線的相應長度。4、 計算絕對長度、相對長度、臂比、著絲粒指數(shù) 總長度1/n所有染色體長度之和（即染色體組內(nèi)全部染色體長度之和）。相對長度可降低誤差，臂比表示兩臂相對長度，比值越大，說明二者長度相差越懸殊，進而推斷著絲粒位置，長度相近著絲粒位于中央，懸殊時著絲?？拷瘫勰┒恕Ｖz粒指數(shù)：為整數(shù)如37表示37，即短臂長度占染色體總長的37，用短臂所占的比例來描述著絲粒的位置。5、 配對依據(jù)：同源染色體特征相似（形態(tài)、大小、著絲粒位置、隨體有無）1） 從形態(tài)上初

7、步推斷 2）在形態(tài)相似染色體的基礎(chǔ)之上比較相對長度3）著絲粒位置，依據(jù)臂比值或著絲粒指數(shù)判斷 4）有隨體的根據(jù)隨體的大小和位置判斷。對照片上的染色體進行粗剪并進行配對。6、 排列先畫一直線，將染色體由大到小，短臂在上，長臂在下，著絲粒在直線上進行排列。等長的染色體以短臂長的在前，帶隨體的染色體及性染色體排在最后。7、分類： 根據(jù)臂比值或著絲粒指數(shù)確定著絲粒位置，進而依照著絲粒的位置將染色體分為四類。 1）中部著絲粒染色體（M）：臂比1.0-1.7 著絲粒指數(shù) 37-50 2）近中著絲粒染色體（SM）：1.73.0 2537 3）近端著絲粒染色體（ST）： 3.07.0 1225 4）端部著絲粒

8、染色體（T）： 7.0以上 12一下8、剪貼 并寫出核型公式 如：K=2n106m+2sm+2stsat核型公式的意義：作業(yè)：完成一種作物的染色體組型分析圖實驗三、 Hardy-Weinberg遺傳平衡定律的驗證（3學時）一、實驗目的在調(diào)查本班同學某些遺傳性狀的基礎(chǔ)上，學會計算控制各性狀的基因頻率和基因型頻率，掌握運用Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律進行遺傳性狀分析的方法。二、實驗原理群體：指一群同種個體所組成的集合。群體遺傳學中的群體不是許多個體的簡單集合，而是一種特定的孟德爾群體，特指能進行隨機交配的群體。在有性繁殖的生物中，一個物種就是一個最大的孟德爾群體。隨機交配：指在有性生

9、殖的生物中，一種性別的任何一個個體都有同樣的機會和相反性別的個體交配的方式稱為隨機交配。自花授粉植物形成的群體不是孟德爾群體，無性繁殖的群體也不是孟德爾群體。研究群體中的遺傳結(jié)構(gòu)，主要通過研究基因頻率和基因型頻率來表達，使之具有可分析的形式，觀察其在上下代之間的變化?；蝾l率：指一個群體中某種基因的數(shù)量與群體中該基因的全部等位基因的比例?；蛐皖l率：指群體中某種基因型的數(shù)量與該群體中全部等位基因組成的基因型總數(shù)之比。遺傳平衡定律：1908年英國數(shù)學家Hardy和德國物理學家Weinberg各自獨立地運用數(shù)學方法探討基因在群體中的行為規(guī)律時得出一致的結(jié)論。內(nèi)容：在一個充分大的Mendel群體中，

10、其個體間進行隨機交配，假設(shè)沒有自然選擇的作用，沒有新的突變發(fā)生，也沒有個體的大規(guī)模遷移，則群體中的基因頻率和基因型頻率為一個常數(shù)，可以一代代傳下去，保持不變。人類一些相對性狀是由一對等位基因控制的，按孟德爾方式遺傳，假定某群體在某位點上的基因A的頻率為p、基因a的頻率為q，如群體處于遺傳平衡，則基因頻率和基因型頻率保持如下關(guān)系：p(A)+q(a)2=p2(AA)+2pq(Aa)+q2(aa)現(xiàn)分兩種情況介紹：2、 不完全顯性時 如人類對PTC嘗味能力的差異表現(xiàn)不完全顯性的遺傳。也就是可以觀察到三種表現(xiàn)型，這樣就能直接從三種表現(xiàn)型（基因型）的觀察數(shù)算出表現(xiàn)型頻率，進而算出基因頻率?，F(xiàn)假定某人群為

11、：基因型 AA Aa aa基因型觀察數(shù) P H Q P+H+Q=N三種基因型的頻率為P(AA)=P/N H(Aa)=H/N Q(aa)=Q/N于是基因頻率為p(A)=P+1/2H q(a)=Q+1/2H 或q=1-p又假定該人群處于遺傳平衡狀態(tài)，根據(jù)已估出的p和q即可算出三種基因型的理論頻率及其相應人數(shù)。再與相應的實際觀察人數(shù)比較，運用卡方檢驗，即能得出該人群是否處于遺傳平衡狀態(tài)的結(jié)論。2、完全顯性時另外一些性狀，如卷舌與非卷舌，有耳垂與無耳垂，由于基因A對基因a為顯性，所以只能區(qū)別兩種表現(xiàn)型，因而不能用表現(xiàn)型觀察數(shù)直接算出基因頻率。但我們可以假定該性狀處于遺傳平衡狀態(tài)，于是表現(xiàn)型【A】（包括

12、AA和Aa）的頻率為p2+2pq,另一表現(xiàn)型【a】(基因型aa)的頻率為q2，由此可用下式分別計算出p和q。q= p=1-q根據(jù)已算出的p和q值，推算出各基因型頻率。最后算出顯性表型中純合體和雜合體的比例。三、實驗用品苯硫脲（PTC）溶液1-14號，或乙醇1-13號稱取1.3gPTC定溶于1000ml蒸餾水中，該溶液為1號，按等量對半稀釋到14號為止。取25乙醇為13號，按等量對半稀釋到1號為止。四、實驗步驟1、PTC味盲基因測試 從14-1號逐個品嘗，根據(jù)嘗到苦味的閾值推測基因型。嘗試閾值11號為純合嘗味者TT，10-7號為雜合嘗味者Tt，7號為味盲型tt。2、嗅閾測試 從1-13號逐個聞下

13、去，直到有味為止，高度敏感型閾值為第1-6號，中度敏感型為7-11號，不敏感型或嗅盲型為12-13號。3、卷舌和耳垂的調(diào)查 能將舌的兩側(cè)卷起呈“U”型為卷舌者表型為F，非卷舌者為f；有耳垂指耳朵下緣與頭部連接處向上有凹陷者表型為E，無耳垂為e。五、作業(yè)1、分別計算本班嗅覺基因的頻率，檢驗分析該性狀在本班是否處于遺傳平衡狀態(tài)。2、計算卷舌和耳垂的基因型頻率，并推算顯性表型中純合體和雜合體的比例。實驗四、果蠅的性狀觀察及飼養(yǎng)（3學時）一、實驗目的1、了解果蠅生活史及各個階段的形態(tài)特征2、區(qū)別雌雄果蠅及常見突變型的主要特征3、掌握果蠅的飼養(yǎng)管理技術(shù)二、實驗原理黑腹果蠅為雙翅目昆蟲，個體發(fā)育為完全變態(tài)

14、。用作實驗材料有以下優(yōu)點：1）容易飼養(yǎng)，生活周期短，25度左右10天繁殖一代。2）繁殖能力較強，一只受精的雌蠅可產(chǎn)卵400-600個，因此可在短期內(nèi)獲得較大的子代群體，有利于遺傳學分析。3）突變類型多，有400個以上，且多數(shù)為形態(tài)特征的變異，便于觀察。4）唾腺染色體較大。因此，在遺傳學研究中，果蠅作為實驗材料被廣泛使用。三、材料與用品1、材料 野生型及突變型果蠅2、用具及藥品 雙筒解剖鏡，放大鏡，麻醉瓶、培養(yǎng)箱、白瓷板、毛筆、棉塞、載片、恒溫培養(yǎng)箱、吸水紙；乙醚。四、實驗步驟1、果蠅生活史的觀察1）卵：白色長橢圓型，0.5mm左右，在其背面的前端具有兩個觸絲。2）幼蟲：從卵中孵化出來后即為一齡

15、幼蟲，一齡幼蟲蛻皮后成為二齡幼蟲，二齡蛻皮后成為三齡幼蟲，三齡幼蟲較大，活動力強，常爬在培養(yǎng)基表面或培養(yǎng)瓶壁上。3）蛹：幼蟲經(jīng)6-7天后即化蛹，附于瓶壁上，呈梭型，初期柔軟呈淡黃色，以后逐漸硬化變成深褐色，深褐色的蛹就要羽化了。4）成蟲：剛羽化出來的果蠅，蟲體較長，半透明乳白色，翅未完全展開。過12小時后，雙翅伸展開，體色加深，各種性狀趨于明顯。5）影響果蠅生活史的因素：I、營養(yǎng)條件：果蠅的食物是酵母菌，培養(yǎng)基發(fā)酵良好，酵母菌充足即可。II、溫度：適宜溫度為10-25度，并隨溫度升高生活周期縮短，10度57天，15度18天，20度15天，25度10天，低于10度、高于30度果蠅不育或死亡。2、

16、麻醉果蠅1）制備麻醉瓶：用培養(yǎng)瓶或與培養(yǎng)瓶口徑相同的玻璃瓶及橡膠塞棉花圖釘組成2）引出果蠅：將有果蠅的培養(yǎng)瓶用手輕拍，使果蠅震落瓶底，迅速拔出棉塞，將麻醉瓶與培養(yǎng)瓶的兩口相對，培養(yǎng)瓶在上，麻醉瓶在下，用手輕拍瓶壁或輕輕搖晃使果蠅落入麻醉瓶?；蚺囵B(yǎng)瓶在下，麻醉瓶在上，并朝向燈光處，雙手遮住培養(yǎng)瓶，利用果蠅的趨光性和向上性，將果蠅引人麻醉瓶。3）麻醉：在麻醉瓶瓶塞的棉花上滴1-2滴乙醚，迅速塞入麻醉瓶瓶口，0.5-1分鐘左右大部分果蠅即被麻醉落入瓶底，搖動麻醉瓶，全部果蠅震落瓶底，之后立即將果蠅倒在白瓷板上，用毛筆小心撥動觀察，若翅膀外展45度角表明果蠅已被麻醉致死。若中途有復蘇的，需在濾紙上滴加

17、1滴乙醚，并用培養(yǎng)皿蓋住。觀察后要將果蠅放回原來的培養(yǎng)瓶，將培養(yǎng)瓶橫放，然后用毛筆將果蠅掃入培養(yǎng)瓶中，待果蠅蘇醒后再將瓶豎起。3、成蟲雌雄性別的區(qū)別：雌果蠅雄果蠅體型大，末端尖，背部環(huán)紋5節(jié)，無黑斑小，末端鈍，背部環(huán)紋3節(jié)，有黑斑腹部腹片7節(jié)腹片5節(jié)第一對足跗節(jié)基部無性梳跗節(jié)基部有黑色鬃毛狀性梳4、果蠅常見突變型性狀的觀察突變名稱基因符號性狀特征在染色體上座位白眼W復眼白色X1.5黑檀體E身體成烏木色，黑亮IIIR70.7殘翅Vg翅明顯退化，部分殘留，不能飛IIR67.0焦剛毛sn剛毛卷曲如燒焦狀X21.05、果蠅培養(yǎng)基的配制水瓊脂玉米粉蔗糖酵母粉丙酸100ml1g10g10g0.5g0.5m

18、l五、作業(yè)寫出果蠅性狀觀察中的注意事項及原種保存中應注意的事項。實驗五、果蠅雜交大實驗（6學時）一、實驗目的驗證分離定律、自由組合定律、伴性遺傳定律二、實驗原理1、分離定律 F2分離比3：12、自由組合定律 F2分離比為9：3：3：13、伴性遺傳 正反交結(jié)果是否相同例：培養(yǎng)灰身果蠅過程中出現(xiàn)黑身果蠅，請問1）黑身為顯性、隱性？2）該基因位于常染色體還是性染色體？3）由幾一對等位基因控制？4、卡方檢驗三、實驗步驟1、設(shè)計雜交組合2、挑選處女蠅 因為雌蠅體內(nèi)有一貯精囊，一次交配后可保存大量精子供多次排卵受精用。剛孵化出的果蠅一般8小時之內(nèi)不進行交配，所以將雌雄分開，所得的雌蠅即為處女蠅。3、F1幼

19、蟲出現(xiàn)時移去親本果蠅4、從F1中挑選3-5對轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)F2代5、F2幼蟲出現(xiàn)時移去F1成蠅6、觀察F2成蠅7、統(tǒng)計分析實驗六、果蠅唾腺染色體的觀察（3學時）一、實驗目的1、練習分離果蠅幼蟲唾腺的技術(shù)2、學習唾腺染色體制片方法3、觀察唾腺染色體結(jié)構(gòu)的特點，了解其在遺傳學中的意義。二、實驗原理：雙翅目昆蟲如果蠅、搖蚊等的幼蟲期都具有很大的唾腺細胞，其中的染色體就是巨大的唾腺染色體。這些巨大的染色體具有許多重要特征，為遺傳學研究的許多方面（如染色體結(jié)構(gòu)、化學組成、基因差別表達等）提供了獨特的研究材料。雙翅目昆蟲的整個消化道細胞發(fā)育到一定階段之后就不再進行有絲分裂，而停止在分裂間期。但隨著

20、幼蟲整體器官以及這些細胞本身體積的增大，細胞核中的染色體，尤其是唾液腺染色體仍不斷地進行自我復制而不分開，經(jīng)過許多次的復制形成約10004000拷貝的染色體絲，合起來達5m寬、400m長，比普通中期分裂相染色體大得多（約100150倍），所以又稱為多線染色體和巨大染色體。唾腺染色體形成的最初，其同源染色體即處于緊密配對狀態(tài)，稱為體細胞聯(lián)會、在以后不斷的復制中仍不分開，由此成千上萬條核蛋白纖絲合在一起，緊密盤繞。所以配對的染色體只呈現(xiàn)單倍數(shù)。黑腹果蠅的染色體數(shù)位2n=2×4，其中第II、第III染色體為中部著絲粒染色體，第IV和第I（X染色體）染色體為端部著絲粒染色體。而唾腺染色體形成

21、時，染色體著絲粒和近著絲粒的異染色質(zhì)區(qū)聚在一起形成一染色中心，所以在光學顯微鏡下可見從染色中心處伸出6條配對的染色體臂，其中5條為長臂，1條為緊靠染色中心的很短的臂。由于唾腺細胞在果蠅幼蟲期一直處于細胞分裂的間期狀態(tài)，每條核蛋白纖絲都處于伸展狀態(tài)，因而不同于一般有絲分裂中期高度螺旋化的染色體。唾腺染色體經(jīng)染色后，呈現(xiàn)深淺不同、疏密各異的橫紋。這些橫紋的數(shù)目、位置、寬窄及排列順序都具有種的特異性。研究認為，這些橫紋與染色體的基因是有一定關(guān)系的。從其橫紋分布特征可對物種的進化特征進行比較分析，而一旦染色體上發(fā)生了缺失、重復、倒位、易位等，也可較容易地在唾腺染色體上觀察識別出來。可見唾腺染色體技術(shù)上

22、遺傳學研究中一項基本的技術(shù)。唾腺染色體上的橫紋寬窄、濃淡是一定的，但在果蠅的特定發(fā)育時期會出現(xiàn)不連續(xù)的膨脹，稱為疏松區(qū)。目前人們認為這是這部分基因被激活的標志。多線染色體的特征：1）染色體巨大，遠遠超過一般體細胞染色體大小；2）唾腺細胞始終處于分裂的前中期狀態(tài)，且同源染色體配對在一起，故觀察到的多線染色體數(shù)為n；3）各條多線染色體上具有異染色質(zhì)的著絲粒部分相互靠攏，形成染色中心；4）由于DNA螺旋化程度不同，多線染色體上的橫紋，表現(xiàn)深淺不同、疏密相間，是基因所在的位置。三、材料及用品生理鹽水（NaCl 7.5g, KCl 0.35g CaCl2 0.21g順次溶于1000ml蒸餾水中）解離液（

23、20HCl ： 45%醋酸3：1或4：1或5：1），1龍膽紫染液四、實驗步驟1、幼蟲的培養(yǎng) 18度，水分多的培養(yǎng)基，酵母菌充足2、剖取唾腺3、解離 在唾液腺上加解離液解離3分鐘，用吸水紙將解離液吸去，并用蒸餾水沖洗2-3次。4、染色 滴一滴甲苯胺藍染色液染色3-5分鐘，之后用吸水紙吸去染液，并用蒸餾水沖洗多余的染液。5、壓片 加一滴蒸餾水放上蓋片、覆以吸水紙用針柄輕敲幾下，然后用拇指用力朝一個方向揉片。6、觀察光圈盡量調(diào)暗些五、作業(yè)繪出果蠅唾腺染色體圖實驗七、觀察不同誘變因素對染色體結(jié)構(gòu)的影響（3學時）一、實驗目的1、了解不同誘變因素對遺傳物質(zhì)的效應及誘變機制2、學習誘發(fā)植物染色體結(jié)構(gòu)變異的方

24、法3、認識畸變的幾種類型二、實驗原理常見畸變有染色體粘著、著絲點區(qū)域斷裂、破壞紡錘絲形成、染色體或染色單體的斷裂，出現(xiàn)環(huán)狀染色體及“染色體橋”和落后染色體異常等現(xiàn)象。微核：是在理化因素作用下，細胞質(zhì)內(nèi)產(chǎn)生的一種小核。在不同的細胞中，這些小核的數(shù)目不等。小核中如有核仁則具有合成DNA的能力。微核的來源可能來自染色體損傷后的一些無著絲點斷片；也可能是紡錘絲受損后，由各別落后的染色體形成。微核存在于細胞分裂的各個時期，容易觀察。染色體畸變檢測方法：1）在有絲分裂中、后期細胞中，統(tǒng)計染色單體斷裂、無著絲點斷片和橋等的出現(xiàn)頻率，這是一種比較客觀、準確的遺傳毒理學技術(shù)。2）微核檢測法：由于微核可以出現(xiàn)在細

25、胞分裂的所有時期，因而觀察時，不必考慮分裂相的多少，這種方法簡便、敏感。實踐中往往將上述兩種方法結(jié)合使用，效果可更為精確。在遺傳學研究、遺傳疾病的診斷以及致突變致癌致畸變物質(zhì)的檢測方面應用較多。三、材料及用品R射線處理的種子，硫酸二乙脂處理的種子 鹽酸酒精解離液 龍膽紫染液 45醋酸四、實驗步驟1、根尖培養(yǎng)2、固定3、解離 根尖解離10分鐘水洗45醋酸軟化5分鐘水洗4、染色及壓片 染色5-8分鐘5、觀察五、作業(yè) 1、敘述誘變原理及檢測方法2、觀察不同誘變統(tǒng)計細胞中畸變頻率3、繪出輻射處理后染色體發(fā)生畸變的有絲分裂制片圖實驗八 擬南芥的有性雜交一、 實驗目的1. 了解擬南芥作為模式生物的特點2.

26、 學習并掌握植物有性雜交的方法二、 實驗原理1. 擬南芥的形態(tài)學特征擬南芥（Arabidopsis thaliana）為十字花科擬南芥屬。一年生細弱草本植物。株高15至30厘米，隨生長環(huán)境或培養(yǎng)條件變化?；~多數(shù)，長圓形或橢圓形，呈蓮座狀排列。莖生葉具短柄或無柄。總狀花序頂生，花瓣白色；雄蕊6枚（4強2短），花藥黃色；雌蕊圓柱狀。長角果線形，長約10至16毫米，成熟時開裂。種子呈卵形，長約1毫米，成熟時紅褐色。2. 擬南芥的培養(yǎng)方法將種子用10%的漂白水（或0.5%次氯酸鈉）消毒20-30分鐘，經(jīng)無菌水沖洗3-4遍后，在無菌條件下播種到MS培養(yǎng)基上，4春化2-4天后，在22,16h光照、相對

27、濕度70%左右的條件下培養(yǎng)，當幼苗具有4-6片真葉時，移入培養(yǎng)土中在溫室中生長即可。由于個體小，很容易在面積有限的溫室或人工氣候室內(nèi)大批量地種植；而且，擬南芥對生長條件的要求并不十分嚴格，這一特點使得在實驗工作中很容易實現(xiàn)擬南芥的栽培管理。在一般的栽培條件下，完成一個生長周期大約需8周左右的時間。還可人為控制條件（如改變溫度、延長光照時間）縮短生長周期。擬南芥的這一特性使實驗工作周期大大縮短，特別是對于許多遺傳分析工作，比利用一般的高等植物材料（如麥類、豆類作物）可以成倍的地節(jié)約時間。3. 擬南芥的遺傳學特性既可以自交、又可人工雜交，在自然條件下，擬南芥是典型的自交繁殖植物，這使得擬南芥在種植

28、繁種過程中得以保持其遺傳上的穩(wěn)定性。同時在實驗過程中，根據(jù)研究目的又可方便地實施人工雜交，使得遺傳分析工作很容易完成。在培養(yǎng)條件良好的情況下，一個角果可結(jié)實數(shù)十粒種子；單株結(jié)實量可達數(shù)千粒甚至上萬粒之多！這使得很容易進行后代的遺傳分析工作，也很容易擴增所需突變體的種子庫，容易被誘變產(chǎn)生所需突變體。二倍體擬南芥有5對染色體，單倍體的基因組總長約為125Mb，已完成全基因組測序。另外，在分子遺傳學水平上，擬南芥具有基因組小、重復序列少、易于遺傳轉(zhuǎn)化等特點。三、 實驗用品處于開花期的擬南芥植株；尖頭鑷子；線繩等四、 實驗步驟1. 播種并培養(yǎng)擬南芥至開花期2. 選擇母本選擇剛剛露白的花蕾作為母本。這是

29、雜交成功與否的關(guān)鍵所在。太幼嫩的花蕾去雄后雌蕊會死亡，而發(fā)育稍過的花蕾其內(nèi)部已在進行或完成自花授粉過程，因此難以達成人工雜交的目的。3. 去雄用干凈的尖端稍細的鑷子由外向內(nèi)依次剝?nèi)セㄝ?、花瓣、雄蕊（?枚，4長2短；此時雄蕊的長度明顯短于雌蕊，尚未進行自花授粉），只留下雌蕊。注意不要觸傷柱頭，否則難以完成授粉作用。另外，雄蕊一定要去完全，如果留下一或多根雄蕊，待第二天花柱伸長后依然可以進行自花授粉作用，使人工設(shè)計的雜交失敗。4. 授粉剛剛?cè)バ鄣拇迫镏^還未發(fā)育成熟，一般在去雄后第二天，柱頭處于膨脹毛茸茸的狀態(tài)時，為最適合接受花粉的狀態(tài)。選擇處于盛花期（四個花瓣完全展開呈十字狀，花藥為鮮黃色）的

30、花朵作為父本，用鑷子夾住雄蕊柄部取下小花，在母本花的柱頭上輕輕擦拭數(shù)次，做好標記。為保證授粉成功率，可以連續(xù)兩天進行授粉。一般授粉在上午10點之前進行為宜；下午兩三點鐘花朵盛開較多時亦可。5. 觀察記錄兩三天后，如果柱頭明顯發(fā)育長大，形成細長形的角果，則表明雜交成功。為了驗證雜交結(jié)果，一般F1植株還需取材進行鑒定（如相應抗性的篩選或者基因組PCR等）五、 作業(yè)論述擬南芥有性雜交的意義及雜交過程中的注意事項？實驗九 根癌農(nóng)桿菌介導的植物遺傳轉(zhuǎn)化一、 實驗目的1. 了解Ti質(zhì)粒作為基因工程載體的特點及根癌農(nóng)桿菌介導的植物基因轉(zhuǎn)化的原理。2. 掌握浸花法轉(zhuǎn)化擬南芥的方法。二、 實驗原理1. 雙元Ti

31、載體Ti質(zhì)粒為根癌土壤桿菌菌株中存在的質(zhì)粒（染色體外自主復制的環(huán)形雙鏈DNA分子），能夠通過感染植物的傷口，將其上一段含有植物激素和冠癭堿合成酶基因的DNA轉(zhuǎn)移并整合至植物受體的基因組中，天然的Ti質(zhì)粒整合入植物基因組中的基因能夠控制根瘤的形成（Ti即tumor-inducing 腫瘤誘發(fā)的縮寫）。Ti質(zhì)粒中有2個獨立的區(qū)域決定DNA轉(zhuǎn)移及整合：T-DNA區(qū)（transferred DNA）和vir區(qū)（virlence region）。在Vir區(qū)基因產(chǎn)物的幫助下，T-DNA區(qū)能夠插入植物基因組中，并隨植物基因組復制及遺傳給后代。研究發(fā)現(xiàn)，T-DNA插入植物基因組時，其左右兩個邊界區(qū)是必須的，而

32、中間部分的序列可以去除或替換。利用此特點，可以將目的基因插入該區(qū)域內(nèi)?；赥i質(zhì)粒這個結(jié)構(gòu)特點，1983年Hoekema等提出雙元載體策略：將去除致瘤基因的T-DNA區(qū)從Ti質(zhì)粒中分離，放置在一個能在農(nóng)桿菌和大腸桿菌中復制的穿梭質(zhì)粒中。這個穿梭載體稱為雙元Ti載體。Vir區(qū)則存在于一個已經(jīng)除去T-DNA的Ti質(zhì)粒中，在農(nóng)桿菌中作為輔助質(zhì)粒，通過反式激活使T-DNA能轉(zhuǎn)移到植物細胞基因組中。通過基因工程改造，將篩選標記基因、多克隆位點及能在植物中高表達的啟動子和終止子等按照一定的順序放入T-DNA區(qū)中，即構(gòu)成Ti衍生載體，作為單、雙子葉植物轉(zhuǎn)基因的工程載體。2.浸花法轉(zhuǎn)化擬南芥為了得到能夠穩(wěn)定遺

33、傳的轉(zhuǎn)基因植物，一般用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的植物材料會選擇愈傷組織或者植物的生長點部位。前者可以通過分化和再生得到攜帶目的基因的轉(zhuǎn)基因植株；而利于轉(zhuǎn)化的生長點部位主要包括根尖分生組織及花分生組織。浸花法轉(zhuǎn)化擬南芥即是用攜帶目的基因的農(nóng)桿菌菌液浸泡擬南芥幼嫩花蕾中的分生組織，使得T-DNA區(qū)攜帶目的基因插入到花分生組織細胞基因組DNA中，而花作為擬南芥的生殖器官結(jié)實后產(chǎn)生的種子中即攜帶目的基因，在繁殖過程中可以將外源基因穩(wěn)定地遺傳給后代。利用此法轉(zhuǎn)化擬南芥的轉(zhuǎn)化率較高，?？梢赃_到1%（即后代中陽性轉(zhuǎn)化植株所占比例）甚至更高。實際上，由于擬南芥的種子結(jié)實量大，即便轉(zhuǎn)化率低一些，也還是很容易從大量的后代中篩選獲得轉(zhuǎn)化植株。三、 實驗用品已抽薹但有許多未開花的幼嫩花蕾的擬南芥野生型（Clo0）哥倫比亞型植株；經(jīng)帶有目的基因的Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的根癌農(nóng)桿菌；抗性MS培養(yǎng)基等。四、 實驗步驟1. 含有目的基因的Ti質(zhì)粒的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化受體農(nóng)桿菌菌株選擇合適的限制性內(nèi)切酶組合，將目的基因按照正確的方向插入Ti質(zhì)粒的多克隆位點中。構(gòu)建好的重組質(zhì)粒通過化學轉(zhuǎn)化或電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞中，從而得到含有攜帶目的基因Ti質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌株。2. 植物材料的準備將擬南芥種子用0.5%次氯酸鈉消毒10-20分鐘、用無菌水清洗3-4次后將消毒后的種子在4下春化2至3天，直接播種于營養(yǎng)土與蛭石的混合物（