標(biāo)本處理對(duì)聚合酶鏈反應(yīng)測(cè)定乙肝病毒核酸的影響

1、標(biāo)本處理對(duì)聚合酶鏈反應(yīng)測(cè)定乙肝病毒核酸的影響    【摘要】 目的 研究對(duì)血清標(biāo)本進(jìn)行乙型肝炎病毒（HBV）DNA聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）測(cè)定前的最佳標(biāo)本處理方法。方法 使用煮沸裂解方法和核酸純化方法同時(shí)處理2份HBVnbsp;DNA含量不同血清標(biāo)本及3份溶血和正常血清標(biāo)本，比較熒光定量PCR測(cè)定的重復(fù)性及測(cè)定值的差異。     中華醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志 2000年第6期第23卷 論著 作者：李金明王露楠鄧巍 單位：衛(wèi)生部北京醫(yī)院衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心100730 關(guān)鍵詞：聚合酶鏈反應(yīng)；標(biāo)本制備；DNA；病毒 【摘要】目的研究對(duì)

2、血清標(biāo)本進(jìn)行乙型肝炎病毒（HBV）DNA聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）測(cè)定前的最佳標(biāo)本處理方法。方法使用煮沸裂解方法和核酸純化方法同時(shí)處理2份HBV DNA含量不同血清標(biāo)本及3份溶血和正常血清標(biāo)本，比較熒光定量PCR測(cè)定的重復(fù)性及測(cè)定值的差異。結(jié)果煮沸裂解法處理2份標(biāo)本所得結(jié)果的重復(fù)性（變異系數(shù)CV分別為0.2165和0.3262）明顯差于對(duì)樣本進(jìn)行核酸純化后的測(cè)定重復(fù)性（CV分別為0.0699和0.1092）；并且，當(dāng)標(biāo)本中血紅蛋白含量大于5.89 g/L時(shí)（肉眼未見(jiàn)有明顯溶血），采用煮沸裂解法處理標(biāo)本所得HBV DNA量較核酸純化方法所得值低約2個(gè)數(shù)量級(jí)（P0.05）。結(jié)論在HBV DNA PCR

3、檢測(cè)時(shí)，煮沸裂解法不適合用來(lái)處理血清標(biāo)本，而應(yīng)使用核酸純化方法。 Influence of nucleic acid extraction from serum with two methods on HBV DNA detection by fluorescence quantitative PCR (TaqMan) LI JinmingWANG LunanDENG Wei （National Center for Clinical Laboratory,Beijing 100730, China） 【Abstract】ObjectiveTo investigate the influenc

4、e of nucleic acid extraction by boiling the serum samples and purifing nucleic acid from serum on HBV DNA detection by PCR. MethodsThe DNA templates from 2 serum samples with different HBV DNA concentration and 3 serum samples with hemolysis and non-hemolysis for PCR were prepared by two kinds of me

5、thod, i.e. by boiling the serum to release HBV DNA from the virus particles and by purifing the nucleic acid from serum. Then,the difference of reproducibility and HBV DNA quantitative values by PCR using the templates prepared by the two nucleic acid extraction methods was compared.ResultsHBV DNA q

6、uantitative values by PCR using the templates purified from the two samples were more reproducible(CV: 0.2165 and 0.3262, respectively) than those using the templates prepared by boiling the serum (CV: 0.0699 and 0.1092, respectively). Moreover, when the concentration of hemoglobin in serum samples

7、was higher than 5.89 g/L, the HBV DNA quantitative values by PCR using the templates purified from the samples were about one-hundred-fold more than those using the templates prepared by boiling the serum (P0.05).ConclusionThe results suggested that the DNA template prepared by boiling the serum is

8、not suitable for HBV DNA quantitative PCR detection, and nucleic acid for PCR must be purified from serum. 【Key words】Polymerase chain reaction;Specimen handling;DNA, viral 乙型肝炎病毒（HBV）DNA的定量測(cè)定在乙型肝炎病人的臨床治療監(jiān)測(cè)中有重要參考價(jià)值，其前提是定量必須具有很好的重復(fù)性。目前國(guó)內(nèi)用于HBV DNA定量測(cè)定的方法基本上是熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR, TaqMan)技術(shù)，這種實(shí)時(shí)測(cè)定技術(shù)方便簡(jiǎn)單，且不易引起

9、污染。影響PCR測(cè)定重復(fù)性和準(zhǔn)確性的因素，除了PCR擴(kuò)增本身以外，還有一個(gè)常被忽略但也非常關(guān)鍵的因素，即標(biāo)本處理。目前，國(guó)內(nèi)絕大部分用于HBV DNA測(cè)定的PCR試劑盒，常采用直接對(duì)血清煮沸裂解以釋放病毒核酸的方法處理標(biāo)本，這種方法雖然較經(jīng)典的核酸提取方法簡(jiǎn)便，但由于其只是簡(jiǎn)單地將核酸從病毒顆粒中釋放出來(lái)，繼而用于擴(kuò)增檢測(cè)，血清中的一些成分，如血紅素可能會(huì)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)生抑制作用，從而影響測(cè)定。為此，我們比較了核酸提取純化與煮沸裂解法對(duì)HBV DNA熒光定量測(cè)定的準(zhǔn)確性和重復(fù)性的影響，結(jié)果報(bào)告如下。 材料和方法 一、材料 1.試劑：HBV DNA熒光定量PCR試劑盒由深圳匹基生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司提供

10、。核酸純化試劑來(lái)自于美國(guó)Biotronics公司。 2.儀器：PE5700熒光定量PCR儀(PE，美國(guó))。 二、方法 1.血清標(biāo)本處理。煮沸裂解法即采用現(xiàn)常用的試劑盒方法，操作簡(jiǎn)述如下：50 l血清中加入等體積裂解液，煮沸10 min，離心后取上清直接用于PCR擴(kuò)增。核酸純化方法按試劑說(shuō)明操作，簡(jiǎn)述如下：于1.5 ml離心管中加入120 l血清或血漿和200l STG溶液，充分混勻，80 10 min。15 000 g離心5 min，然后用異丙醇沉淀，KW試劑洗滌，干后備用。該方法較酚氯仿核酸純化方法簡(jiǎn)便易行。 2.標(biāo)本處理方法對(duì)測(cè)定的重復(fù)性的影響。取1份HBV DNA含量較高樣本，原樣及用陰

11、性人血清稀釋100倍后，分別用上述2種樣本處理方法各提取15次，然后進(jìn)行熒光定量測(cè)定，比較2種不同方法的測(cè)定重復(fù)性。 3.血紅蛋白干擾試驗(yàn)。取枸櫞酸鹽抗凝的正常人血，用生理鹽水冼滌數(shù)次后，加入一定量無(wú)菌蒸餾水溶解紅細(xì)胞，測(cè)定血紅蛋白含量。取一定量加入至HBV DNA較高含量樣本中，至血紅蛋白終濃度分別為589g/L、58.9g/L和5.89g/L。然后再對(duì)這HBV DNA含量相同，但血紅蛋白含量不同的3份樣本分別用上述2種樣本處理方法雙份提取，熒光定量測(cè)定HBV DNA，比較結(jié)果。 4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。血紅蛋白含量不同對(duì)2種標(biāo)本處理方法所得測(cè)定結(jié)果的差異采用t檢驗(yàn)。 結(jié)果 一、對(duì)HBV DNA定量

12、測(cè)定重復(fù)性的影響 從表1可見(jiàn)，核酸純化方法處理標(biāo)本所得到的測(cè)定結(jié)果，重復(fù)性明顯好于煮沸裂解法。同時(shí)核酸純化方法所得的結(jié)果，較好地反映出了2個(gè)樣本之間1100稀釋的倍比關(guān)系。 表12種標(biāo)本處理方法對(duì)HBV DNA定量重復(fù)性的影響    標(biāo)本處理    方法 樣本 提取    次數(shù) HBVDNA（拷貝數(shù)/ml）    s CV    煮沸裂解法 原樣 15 7.76×106 2.53

13、5;106 0.3260     原樣1100 15 2.15×105 4.66×104 0.2165    核酸純化 原樣 15 3.02×107 3.30×106 0.1090     原樣1100 15 4.45×105 3.11×104 0.0699 二、血紅蛋白對(duì)測(cè)定結(jié)果的干擾(表2) 當(dāng)血清標(biāo)本中血紅蛋白含量大于5.89 g/L時(shí)，采用煮沸裂解法處理標(biāo)本，測(cè)定HBV DNA的含量明顯低于核酸純化方法（P0

14、.05）。從熒光定量的擴(kuò)增變化曲線來(lái)看，煮沸裂解法處理標(biāo)本所得的曲線明顯較核酸純化方法平坦。 表2血紅蛋白對(duì)PCR測(cè)定結(jié)果的干擾    標(biāo)本處理    方法 血紅蛋白    含量（g/L） HBVDNA（拷貝數(shù)/ml）    現(xiàn)測(cè)值 原測(cè)值    煮沸裂解法        5.89 5.80×105 7.76

15、×106     58.90 6.27×105 7.76×106     589.00 4.33×105 7.76×106    核酸純化     5.89 2.19×107 3.02×107     58.90 4.34×107 3.02×107     589.00

16、 9.48×106 3.02×107 討論在臨床進(jìn)行血清HBV DNA的PCR測(cè)定時(shí)，由于煮沸處理標(biāo)本進(jìn)而直接擴(kuò)增較核酸提取純化法簡(jiǎn)便快速，因而國(guó)內(nèi)絕大部分試劑盒均采用此種標(biāo)本處理方法，但國(guó)外試劑如Roche公司Amplicor HBV DNA PCR-ELISA定量測(cè)定試劑及Biotronics公司的HBV DNA熒光定量PCR試劑均采用核酸純化方法。 HBV DNA定量測(cè)定主要是用于乙型肝炎病人治療的動(dòng)態(tài)觀察及療效判斷，這就要求定量測(cè)定要有很好的重復(fù)性，從而不至于給出錯(cuò)誤的信息。我們探討了目前國(guó)內(nèi)常用的血清標(biāo)本煮沸處理方法對(duì)HBV DNA熒光定量測(cè)定重復(fù)性的影響，發(fā)現(xiàn)其

17、測(cè)定的重復(fù)性（2份樣本的測(cè)定CV分別為0.2165和0.3262）明顯差于對(duì)標(biāo)本進(jìn)行核酸純化后的測(cè)定重復(fù)性（CV分別為0.0699和0.1092）。這可能是由于煮沸處理血清標(biāo)本只是將病毒核酸從病毒顆粒中釋放出來(lái)，因而在吸取離心后的樣本上清用于擴(kuò)增時(shí)，樣本中很可能或多或少地會(huì)含有一些原有的血清標(biāo)本成分，如血紅素及其他一些蛋白等，很難保證在每次吸取時(shí)，這些對(duì)PCR擴(kuò)增有干擾的物質(zhì)的量均是一致的。Roche公司 的Amplicor HBV DNA PCR-ELISA定量測(cè)定方法的批內(nèi)CV小于0.20001。 此外，有研究表明，血紅素可通過(guò)其卟啉環(huán)與Taq酶的不可逆結(jié)合而抑制Taq酶活性，從而影響PC

18、R測(cè)定2-4。本組的結(jié)果表明，當(dāng)血清標(biāo)本中血紅蛋白含量為589.00g/L，可見(jiàn)血清明顯為紅色，2種標(biāo)本處理方法測(cè)定結(jié)果均有降低，但煮沸處理法更為明顯（從7.76×106拷貝數(shù)/ml降至4.33×105拷貝數(shù)/ml）；當(dāng)血紅蛋白含量為58.90 g/L，肉眼觀察略有紅色，而在血紅蛋白含量為5.89 g/L時(shí)，肉眼觀察不到是否溶血，這種情況在臨床很常見(jiàn)。采用煮沸裂解方法處理標(biāo)本，在擴(kuò)增模板溶液中會(huì)有殘留的血紅蛋白，血紅蛋白可通過(guò)對(duì)Taq酶的強(qiáng)抑制作用而影響擴(kuò)增檢測(cè)。但如能在擴(kuò)增模板制備即標(biāo)本處理時(shí)，將血紅蛋白去除，則不會(huì)影響后面的擴(kuò)增檢測(cè)。從表2可以看出，核酸純化方法在這兩種情況下，結(jié)果均無(wú)明顯改變，而煮沸處理法結(jié)果有明顯降低。 綜上所述，在HBV DNA的PCR定量測(cè)定時(shí)，用煮沸方法處理標(biāo)本，操作雖簡(jiǎn)單一些，但測(cè)定的重復(fù)性明顯不如對(duì)標(biāo)本進(jìn)行核酸純化后的測(cè)定重復(fù)性，并且提取效率亦低些。尤其要引起重視的是，由于血液采集及分離血清過(guò)程中的操作原因，臨床血清樣本常見(jiàn)有輕微溶血，煮沸處理標(biāo)本可致測(cè)定結(jié)果明顯偏低（降低2個(gè)數(shù)量級(jí)），這將使得在監(jiān)測(cè)病人治療中HBV DNA的定量失去診斷價(jià)值，而且在定性測(cè)定時(shí)，也會(huì)由于這些抑制物的存在，而使