酸棗仁藥材總黃酮提取工藝研究

1、    酸棗仁藥材總黃酮提取工藝研究 王勇,魏娜,朱智云作者單位：海南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，海南 ?？凇菊磕康模簝?yōu)化酸棗仁總黃酮醇提取工藝。方法：以浸膏收率和總黃酮含量為指標(biāo)，采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，考察乙醇用量、乙醇濃度、提取時(shí)間和提取次數(shù)，優(yōu)化酸棗仁中總黃酮的醇提取工藝條件。結(jié)果：優(yōu)化的醇提取條件為加乙醇量與酸棗仁量之比為91，乙醇濃度為60%，提取時(shí)間1 h，提取2次。結(jié)論：該提取工藝合理，方法簡(jiǎn)便，可作為酸棗仁總黃酮醇提取生產(chǎn)工藝的參考。【關(guān)鍵詞】 酸棗仁;總黃酮;紫外分光光度法;正交設(shè)計(jì);提取工藝ABSTRACT Objective： To optimi

2、ze the extraction process of total flavonoids from Ziziphi spinosae Semen. Methods： The factors that affect the extraction process such as the amount of ethanol，the concentration of ethanol， fluxing time and extraction times were investigated by orthogonal design experiments with the yield of dry ex

3、tract and the content of total flavonoids as indices. Results： The optimum extraction technology was that the crude drug powder was extracted by 9 times equivalent volume of 60% ethanol for 1 h in 2 cycles. Conclusions： It is proved that the method is reasonable and simple， which can provide a refer

4、ence for the production of Ziziphi spinosae Semen.KEY WORDS Ziziphi spinosae Semen; Total flavonoids; Ultraviolet spectrophotometry; Orthogonal experiments; Extraction process目前，焦慮、失眠等癥狀不斷困擾著現(xiàn)代人的正常生活，對(duì)于具有改善睡眠功能中藥的研究開(kāi)發(fā)日益迫切。酸棗仁的藥用功能主要為養(yǎng)心、安神、斂汗。用于虛煩不眠，驚悸多夢(mèng)，體虛多汗，津傷口渴1。近年研究還表明酸棗仁對(duì)心血管系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)有明顯的調(diào)節(jié)作用2。酸棗仁(

5、ziziphi spinosae semen)為鼠李科植物酸棗(ziziphus jujuba mill.var.spinosa huex H.F.Chou)的干燥成熟種子，是較為常用的鎮(zhèn)靜催眠中藥。有文獻(xiàn)報(bào)道，酸棗仁中含有脂肪油，皂苷，黃酮等多種物質(zhì)，黃酮類(lèi)為其主要有效成份之一3。中藥中，黃酮類(lèi)化合物的含量測(cè)定方法主要有紫外分光光度法、可見(jiàn)分光光度法和高效液相色譜法4。在提取工藝方面，目前國(guó)內(nèi)學(xué)者多采用溶劑提取法、超聲波提取法和復(fù)合酶法5。其中，在溶劑提取法中多采用正交設(shè)計(jì)，以酸棗仁中總黃酮苷得率為考察指標(biāo)，篩選酸棗仁中黃酮苷的最佳提取工藝條件。這些提取工藝研究都為充分開(kāi)發(fā)和利用酸棗仁資源提

6、供了科學(xué)依據(jù)。本研究對(duì)酸棗仁藥材中黃酮類(lèi)成分的提取主要采用乙醇提取，設(shè)計(jì)了L9(34)正交試驗(yàn)，以浸膏提取率和斯皮諾素(spinosin)含量為指標(biāo)，獲得最佳提取工藝，為后續(xù)藥效學(xué)、制劑學(xué)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)，為酸棗仁新產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。1試藥與儀器1.1試藥酸棗仁藥材購(gòu)自河北省內(nèi)丘縣酸棗仁軍景加工廠，經(jīng)鑒定為鼠李科植物酸棗的干燥成熟種子，斯皮諾素對(duì)照品(純度：98.5% ，上海TAUTO生物公司，批號(hào)：09051321)，石油醚 (6090) (分析純，天津大茂化學(xué)試劑廠),95%乙醇(藥用級(jí)，洛陽(yáng)市化學(xué)試劑廠)。1.2儀器116搖擺式六兩裝高速中藥粉碎機(jī)(海南佳惠食品機(jī)構(gòu))，F(xiàn)A1104型電子

7、天平(德國(guó)賽多利斯儀器有限公司)，衡新ACS系列電子秤(中山市衡新電子有限公司)，DK-98-11A型電熱恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)，R-205旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海申勝生物技術(shù)有限公司),98-1-B型電子調(diào)溫電熱套(天津泰斯特儀器有限公司)，GZX-9240ME型數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)，JASCO紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) (日本分光光度儀器公司)。2方法與結(jié)果2.1正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)參考酸棗仁的主要成分和理化性質(zhì)的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道4,6，酸棗仁黃酮類(lèi)化合物易溶于醇，對(duì)酸棗仁進(jìn)行乙醇提工藝研究。以乙醇濃度、乙醇用量、提取次數(shù)、提取時(shí)間為考察因素，每因素設(shè)計(jì)3個(gè)水平，以浸膏收率

8、、總黃酮含量作為考察指標(biāo)，按L9(34)正交試驗(yàn)表安排試驗(yàn)，平行操作，因素水平見(jiàn)表1。表1酸棗仁正交實(shí)驗(yàn)因素水平表2.2酸棗仁醇提液中總黃酮含量的測(cè)定2.2.1對(duì)照品溶液儲(chǔ)備液的制備精密稱(chēng)取spinosin 1.34 mg，用蒸餾水溶解，配制成0.134 mg/mL的溶液，作為對(duì)照品溶液儲(chǔ)備液。2.2.2供試品溶液的制備分別取定容到100 mL的酸棗仁提取液10 mL，用20 mL石油醚萃取3次，水層加水稀釋至100 mL，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液1 mL，加水稀釋至25 mL，搖勻，得供試品溶液。2.2.3測(cè)定波長(zhǎng)的選擇取供試品溶液及對(duì)照品溶液適量，在200400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，發(fā)現(xiàn)

9、對(duì)照品溶液在270 nm或335 nm附近有最大吸收峰，試驗(yàn)選擇測(cè)定波長(zhǎng)為335 nm。見(jiàn)圖1。AB圖1spinosin(A)波長(zhǎng)掃描圖和酸棗仁供試品溶液(B)波長(zhǎng)掃描圖2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備分別精密吸取spinosin對(duì)照品儲(chǔ)備溶液0.25 mL,0.5 mL,1 mL,1.5 mL,2 mL,2.5 mL至10 mL 容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，于335 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度，以吸收度為縱坐標(biāo)，對(duì)照品溶液濃度為橫坐標(biāo)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.036 5X(r=0.999 6)。對(duì)照品溶液濃度在3.3533.5 g/mL范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。2.2.5供試品溶液的測(cè)定方法將定容到25 m

10、L的供試品溶液，以蒸餾水為空白對(duì)照，在335 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。將測(cè)定的結(jié)果代入線性方程，計(jì)算醇提取液中總黃酮的含量。2.3提取工藝2.3.1試驗(yàn)安排及結(jié)果分別稱(chēng)取酸棗仁粉末(過(guò)20目篩)9份，每份100 g，按表2醇提正交試驗(yàn)表加入相應(yīng)濃度及用量的乙醇，提取相應(yīng)的次數(shù)及時(shí)間，用紗布(200目)濾過(guò)，回收乙醇，濃縮后，冷卻，用蒸餾水稀釋到100 mL，搖勻。以浸膏收率、總黃酮含量為考察指標(biāo)，其中浸膏收率權(quán)重系數(shù)為0.3，總黃酮含量權(quán)重系數(shù)為0.7。篩選酸棗仁藥材總黃酮提取的最佳工藝，具體的試驗(yàn)安排及結(jié)果見(jiàn)表2。2.3.2浸膏收率測(cè)定精密量取25 mL提取液置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸

11、干后，于105 干燥3 h，冷卻30 min后，稱(chēng)重。其浸膏得率計(jì)算公式為：浸膏得率=M2-M125×100藥材總重×(1-11.52%)×100%(注：M1為蒸發(fā)皿凈重量，M2為干燥后蒸發(fā)皿和浸膏重量，11.52%為酸棗仁藥材含水量)2.3.3醇提取液中總黃酮的測(cè)定分別精密量取九份正交實(shí)驗(yàn)供試品溶液各2份，每份10 mL，用20 mL石油醚萃取3次，水層加水稀釋至100 mL，濾過(guò)，取續(xù)濾液1 mL，定容至25 mL，以蒸餾水為空白，于335 nm處測(cè)定吸光度值。將測(cè)定的結(jié)果代入線性方程，計(jì)算醇提取液中總黃酮的含量。總黃酮含量的計(jì)算公式為：黃酮含量=A/0.03

12、65M×(1-11.52%)×2.5×10-2×100%(注：A為吸光度，M為藥材總重，11.52%為酸棗仁藥材含水量)2.3.4直觀分析(極差分析)結(jié)果表2L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果2.3.5方差分析結(jié)果結(jié)果表明，乙醇用量和提取次數(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有顯著性影響(P0.05)，乙醇濃度和提取時(shí)間對(duì)結(jié)果影響不大(P0.05)。綜合考慮，最后確定最佳提取工藝條件為9倍量60%乙醇，加熱回流2次，每次1 h。表3方差分析結(jié)果2.4最佳提取工藝驗(yàn)證根據(jù)以上優(yōu)化工藝，制備3批樣品，進(jìn)行工藝驗(yàn)證試驗(yàn)。見(jiàn)表4。表4總黃酮含量及浸膏收率3討論3.1波長(zhǎng)的選擇試驗(yàn)中對(duì)照品spin

13、osin溶液與酸棗仁供試品溶液進(jìn)行波長(zhǎng)掃描發(fā)現(xiàn)，spinosin溶液在270 nm及335 nm附近有最大吸收峰，與藥典及相關(guān)文獻(xiàn)相符;而酸棗仁供試品溶液在270 nm及325 nm附近有最大吸收峰。這可能與藥品質(zhì)量、供試品中化學(xué)成分、溶劑選擇等有關(guān)。參考藥典和相關(guān)文獻(xiàn)1,4,6，本研究最終選擇335 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。3.2提取工藝本研究由表2確定的最佳提取工藝應(yīng)為9倍量60%乙醇，提取2次，每次1.5 h;由表3方差分析結(jié)果得出乙醇用量和提取次數(shù)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有顯著性差異(P0.05)，乙醇濃度和提取時(shí)間影響不大(P0.05)。考慮到降低成本，本研究最后確定最佳提取工藝條件為加入9倍量，60%

14、乙醇，加熱回流2次，每次1 h。驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)表明工藝條件較穩(wěn)定。與文獻(xiàn)報(bào)道最佳工藝條件有一定差異，可能與設(shè)置的水平和選取的考察指標(biāo)有關(guān)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1中華人民共和國(guó)國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(2010年版一部)S.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010：343.2彭智聰，朱建軍. 酸棗仁化學(xué)成分及藥理研究進(jìn)展J. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2001,12(1)：86-87.3袁昌魯，王中博，焦瑩，等. 酸棗仁中黃酮類(lèi)鎮(zhèn)靜催眠有效成分的研究J. 中藥通報(bào)， 1987,9(21)：34-35.4梁柱華，楊建設(shè)，楊藝虹，等. 酸棗仁中總黃酮的含量測(cè)定研究J.分析測(cè)試技術(shù)與儀器，2008,14(1)：34-37.5

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