葛根總黃酮的提取及其抗氧化性能研究

1、作者簡介周率(1980-,男,湖南汨羅人,碩士研究生,研究方向:天然產(chǎn)物的開發(fā)與利用。*通訊作者。收稿日期2008!04!09葛根為豆科葛屬植物,在我國各地均有分布,資源豐富1。葛根總黃酮具有抗氧化、抑菌、抗癌、防治骨質(zhì)疏松等作用2-3。因此,研究葛根總黃酮的提取、優(yōu)化提取工藝、開發(fā)天然抗氧化劑日益成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。筆者對葛根總黃酮的提取及其抗氧化性能進(jìn)行了研究,旨在為科學(xué)利用葛根資源提供試驗(yàn)依據(jù)。1材料與方法1.1材料供試原料為葛根(橫峰葛業(yè)開發(fā)有限公司提供。藥品:乙醇(分析純,甲醇(分析純,重蒸水,葛根素對照品(中國藥品生物制品檢定所提供,鄰啡啰啉,CuSO 4,H 2O 2,魯米諾,鄰

2、苯三酚。儀器:T6系列紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司,BPCL !K 微弱發(fā)光測量儀(中國科學(xué)院生物物理所,恒溫水浴鍋(深圳天南海北實(shí)業(yè)有限公司,電子天平(上海天平儀器廠,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海申科機(jī)械研究所,SHZ !D 循環(huán)水式真空泵(河南鞏義市英峪豫華儀器廠。1.2方法1.2.1葛根總黃酮的提取工藝流程。葛根前處理乙醇提取過濾減壓濃縮濃縮物過柱洗脫減壓濃縮真空干燥總黃酮提取物。1.2.2單因素試驗(yàn)條件優(yōu)化。分別對提取溫度、乙醇濃度、乙醇用量和提取次數(shù)進(jìn)行考察。1.2.3葛根總黃酮的提取。稱取9份葛根,每份為10g ,根據(jù)影響葛根總黃酮提取的因素,選取溫度(A 、乙醇濃度(B

3、、乙醇用量(C 、提取次數(shù)(D 作為考察因素,且每次提取3h 。以葛根總黃酮提取物的提取率為考察指標(biāo),設(shè)計(jì)4因素3水平L 9(34正交試驗(yàn),每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次,確定最佳提取工藝參數(shù)。1.2.4硅膠柱層析純化葛根總黃酮提取物。選取200300目的硅膠,活化后裝入硅膠柱,徑高比為120。分別取正交試驗(yàn)提取得到的樣品1g 置于燒杯中,加入適量甲醇溶解后上柱,洗脫液為甲醇與氯仿混合溶劑(甲醇氯仿=27。每30ml 收集液為1次,采用薄層層析法檢測所得收集液,結(jié)果表明前300ml 收集液含有葛根總黃酮,濃縮該收集液,真空干燥后得葛根總黃酮純化物。1.2.5葛根總黃酮含量的測定。(1標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立4。稱取葛

4、根素對照品5.3mg 置于25ml 容量瓶中,加甲醇溶液并稀釋至刻度。吸取溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml 分別置于10ml 容量瓶中,加甲醇溶液,并稀釋至刻度。同時(shí)以上述溶劑為對照,在波長250nm 處進(jìn)行比色。以濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。試驗(yàn)確定以葛根素為標(biāo)準(zhǔn)品的總黃酮測定標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:c=10.627A-0.2032,R 2=0.9993。(2總黃酮含量的測定5-6。稱取經(jīng)柱層析純化后的葛根總黃酮0.0734g ,置于250ml 容量瓶中,加10ml 甲醇溶解,并加甲醇定容至250ml ;再吸取甲醇溶液1ml 置于10ml 容量瓶中,加甲醇定

5、容至10ml ,在250nm 處分別測定其吸光度,并以甲醇作空白對照,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算葛根提取物中葛根總黃酮的含量。(3提取率的計(jì)算。提取率(%=提取物質(zhì)量(g 原料質(zhì)量(g ×1001.2.6葛根總黃酮抗氧化作用(化學(xué)發(fā)光法7試驗(yàn)。(1化學(xué)發(fā)光評價(jià)葛根總黃酮抗氧化活性的原理8-9。采用鄰苯三酚-魯米諾體系測定葛根總黃酮抑制超氧陰離子葛根總黃酮的提取及其抗氧化性能研究周率,張彬*,周武,黎新江,歐陽輝桂(南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西南昌330047摘要目的優(yōu)化提取葛根總黃酮的最佳工藝條件,研究其抗氧化性能。方法用乙醇提取葛根總黃酮,通過正交試驗(yàn),研究影響葛根總黃酮提取率

6、的因素,確定最佳提取工藝參數(shù);用硅膠柱層析法純化葛根總黃酮提取物,采用BPCL 法測定葛根總黃酮的抗氧化性能。結(jié)果正交實(shí)驗(yàn)表明,影響葛根總黃酮提取率的4個(gè)因素的強(qiáng)弱順序?yàn)?溫度>乙醇濃度>固液比>提取次數(shù)。提取葛根總黃酮的最佳工藝條件為:乙醇濃度70%,固液比為18,提取次數(shù)3次,每次3h ,溫度80,葛根總黃酮的提取率為22.9%,樣品純度為15.5%。結(jié)論利用BPCL 法測定葛根總黃酮對超氧自由基(O 2-和羥基自由基(OH 的抑制率,結(jié)果證明葛根總黃酮具有一定的抗氧化作用。關(guān)鍵詞葛根;總黃酮;抗氧化作用中圖分類號S567.1+9文獻(xiàn)標(biāo)識碼A 文章編號0517-6611(

7、200817-07402-03Study on Extracting Total Flavone from PuerariaLobata and Its Property of AntioxidationZHOU Lu et al (State Key Laboratory of Food Science and Technology,Nanchang University,Nanchang,Jiangxi 330047Abstract ObjectiveThe aim was to optimize the best technical conditions of extracting to

8、tal flavone from Pueraria lobata,and studied its antioxidation property.MethodThe total flavone from P.lobata was extracted with ethanol,the factors that influenced the extraction rate of total flavone from P.lobata was studied through orthogonal experiment,and the optimal extracting process paramet

9、ers were identified.The extract of total flavone from P.lobata was purified by using silica gel column chromatography,and the antioxidation property of P.lobata total flavone was determined with BPCL method.ResultThe orthogonal experiment showed that the sequence of four factors that affected the ex

10、traction rate of total flavone from P.lobata was:temperature >ethanol concentration >solid !liquid ratio >extracting times.The optimal technical conditions of extracting total flavone from P.lobata were:ethanol concn.of 70%,solid !liquid ratio of 18,extracting at 80for times with 3h per tim

11、e,under which,the extraction rate of total flavone from P.lobata was 22.9%,with the sample purity of 15.5%.ConclusionThe BPCL method was utilizedto determine the inhibitory rate of total flavone from P.lobata to superoxide free radical (O 2-,and hydroxyl radical (OH,and the resultdemonstrated that t

12、he total flavone from P.lobata had a certain antioxidant effects.Key words Pueraria lobata;Total flavone;Antioxidant effect安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),Journal of Anhui Agri.Sci.2008,36(17:7402-7404,7420責(zé)任編輯張楊林責(zé)任校對馬君葉圖5提取次數(shù)對提取效率的影響Fig.5Effects of extraction times on extraction efficiency12101416182022264321總黃酮提取物提取率E x t

13、 r a c t i o n r a t e o f t o t a l f l a v o n o i d e x t r a c t s %提取次數(shù)Extraction times 次241210141618202224110114181614總黃酮提取物提取率E x t r a c t i o n r a t e o f t o t a l f l a v o n o i d e x t r a c t s %固液比(M/V Solid !liquid ratio 112圖4固液比對提取效率的影響Fig.4Effects of solid !liquid ratio on extract

14、ion efficiency 自由基(O 2-。在堿性條件下,鄰苯三酚自氧化產(chǎn)生O 2-,氧化魯米諾產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光,反應(yīng)中魯米諾吸收化學(xué)能而躍遷到激發(fā)態(tài),然后通過能級躍遷釋放出光子,最大發(fā)射波長為425430nm 的化學(xué)發(fā)光。在體系中加入測試樣品,如有清除O 2-的作用,則可抑制該反應(yīng)的發(fā)光,而光子的釋放過程用儀器來捕捉并記錄,可測定其對自由基的抑制率。采用CuSO 4!Vc !H 2O 2-鄰啡啰啉(Phenanthroline 水溶液體系測定葛根總黃酮抑制羥基自由基(OH 。鄰啡啰啉(Phen 與金屬Cu 2+生成配合物(Phen 2Cu 2+,再被Vc 還原成(Phen 2Cu +,再與H

15、 2O 2反應(yīng)生成OH ,同時(shí)伴隨發(fā)光現(xiàn)象。在體系中加入測試樣品,如有清除OH 的作用,就可以抑制該反應(yīng)的發(fā)光,光子的釋放過程用儀器來捕捉并記錄,可測定其對自由基的抑制率。(2O 2-抑制率測定10。在發(fā)光杯中依次加入不同濃度待測樣品溶液20l (以空白試樣為對照樣,加入1mmol/L 的鄰苯三酚10l ,放入發(fā)光儀的反應(yīng)池內(nèi),原位注入970l 魯米諾(1mmol/L -碳酸鹽緩沖液(pH 值10.2,迅速啟動發(fā)光,測定250s 內(nèi)發(fā)光強(qiáng)度。試驗(yàn)平行3次。(3OH 抑制率測定。在發(fā)光杯中依次加入濃度2mmol/L 的新鮮Vc 200l ,濃度2mmol/L 的CuSO 4溶液400l ,濃度2

16、mmol/L 的鄰菲啰啉溶液400l ,加濃度0.1mol/LpH 值8.0的磷酸鹽緩沖液600l ,再加50l 不同濃度的待測樣品溶液(以空白試樣為對照樣,混勻放入發(fā)光儀的反應(yīng)池內(nèi),加入600l 的濃度100mmol/L H 2O 2溶液迅速啟動發(fā)光,測定600s 內(nèi)發(fā)光強(qiáng)度。試驗(yàn)平行3次,抑制率計(jì)算公式如下:發(fā)光抑制率(%=I 0-I 1I 0×100式中,I 0為空白發(fā)光曲線總面積;I 1為樣品發(fā)光曲線總面積。1.2.7葛根總黃酮與2,6!二叔丁基對甲酚(BHT 的抗氧化性能比較。采用化學(xué)發(fā)光法測定相同濃度下BHT 對O 2-和OH 的抑制率,并與葛根總黃酮對自由基的抑制率進(jìn)行

17、比較,以評價(jià)其抗氧化性能。2結(jié)果與分析2.1葛根總黃酮提取試驗(yàn)條件優(yōu)化結(jié)果2.1.1單因素試驗(yàn)結(jié)果。試驗(yàn)結(jié)果表明,溫度越高,提取率越高(圖2;采用濃度70%的乙醇提取時(shí),產(chǎn)物中葛根總黃酮含量較高(圖3;隨著固液比的增加,葛根總黃酮提取率也隨之提高,當(dāng)固液比小于110(M/V 時(shí),提取率變化不大(圖4;隨著提取次數(shù)的增加,提取率也隨之提高,當(dāng)提取次數(shù)大于3時(shí),提取率變化不大(圖5。2.1.2正交試驗(yàn)結(jié)果。表1表明,影響葛根總黃酮提取率的4個(gè)因素的強(qiáng)弱順序?yàn)?溫度>乙醇濃度>固液比>提取次50101520251.51.00.52.0葛根素濃度P u e r a r i n c o

18、 n c e n t r a t i o n g /m l吸光度Absorbency圖1吸光度-葛根素濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1Standard curve of absorbency-puerarin concentrationy=10.627x -0.2032R 2=0.9993121014161820222480907060504030總黃酮提取物提取率E x t r a c t i o n r a t e o f t o t a l f l a v o n o i d e x t r a c t s %溫度Temperature 圖2溫度對提取效率的影響Fig.2Effects of te

19、mperature on extraction efficiency 12101416182022248090706050總黃酮提取物提取率E x t r a c t i o n r a t e o f t o t a l f l a v o n o i d e x t r a c t s %乙醇溶度Ethanol concentration %圖3乙醇濃度對提取效率的影響Fig.3Effects of ethanol concentration on extraction efficiency周率等葛根總黃酮的提取及其抗氧化性能研究36卷17期7403化,得葛根總黃酮純化物0.77g 。取純

20、化物0.0734g ,測得其吸光度為1.295,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算葛根總黃酮的含量為13.36g/ml ,經(jīng)過換算,每10g 葛根中含葛根總黃酮0.356g 。2.3葛根總黃酮抗氧化作用由圖67可知,隨著樣品濃度的增大,反應(yīng)放出的光子總數(shù)逐漸減少,即葛根總黃酮抑制反應(yīng)的發(fā)光能力逐漸加強(qiáng),表明葛根總黃酮對O 2-和OH 的抑制率隨著樣品濃度的增大而增大。2.4BHT 抗氧化作用結(jié)果由圖89中可知,隨著樣品濃度的增大,反應(yīng)放出的光子總數(shù)逐漸減少,即BHT 抑制反應(yīng)的發(fā)光能力逐漸加強(qiáng),表明BHT 對O 2-和OH 的抑制率隨著樣品濃度的增大而增大。2.5葛根總黃酮與BHT 抑制率的比較結(jié)果表2表明,在

21、同樣的濃度下,葛根總黃酮抑制OH 的能力比BHT 要強(qiáng),而在低濃度下葛根總黃酮抑制O 2-的能力比BHT 要弱,但隨著樣品濃度的增大,葛根總黃酮抑制O 2-的能力也強(qiáng)于BHT ,所以總體來說,葛根總黃酮抑制自由基的能力比BHT要強(qiáng),表明葛根總黃酮的抗氧化性要強(qiáng)于BHT ,所以葛根總(下轉(zhuǎn)第7420頁200050光子個(gè)數(shù)P h o t o n n u m b e r時(shí)間Time s400060008000100001200014000160001800020000220002501001502001234567注:17分別代表葛根總黃酮的濃度為0、2.3、4.7、9.4、14.1、18.8、23

22、mg/ml 。圖7同。Note:1-7stand for the total flavonoid concentrations of puerarin being 0,2.3,4.7,9.4,14.1,18.8and 23mg/mL.The same as Fig.7.圖6葛根總黃酮O 2-發(fā)光動力學(xué)曲線Fig.6Chemiluminescence kinetic curve of total flavonoid O 2-inpuerarin圖7葛根總黃酮抑制OH 發(fā)光動力學(xué)曲線Fig.7Chemiluminescence kinetic curve of OH inhibition bypu

23、erarin200000時(shí)間Time s4000006000008000001000000120000014000006001003002001456237光子個(gè)數(shù)P h o t o n n u m b e r500400實(shí)驗(yàn)號Test No.溫度ATemperature 乙醇濃度BEthanol concentration %固液比(M/V Solid "liquid ratio提取次數(shù)DExtraction times 次總黃酮提取物Total flavonoid extracts g提取率Extraction rate %11(701(601(1611.861.86212(70

24、2(1822.012.01313(803(11032.162.1642(801232.202.20522312.272.27623122.192.1973(901322.282.28832132.312.31933212.262.26R 0.270.170.120.09表1正交試驗(yàn)結(jié)果Table 1Result of orthogonal test數(shù)。根據(jù)正交試驗(yàn)的結(jié)果,當(dāng)溫度為8090,乙醇濃度為70%,固液比為110,提取次數(shù)為4次時(shí),葛根總黃酮提取物的提取率較高,但考慮到節(jié)約能耗,節(jié)省時(shí)間,所以取最佳工藝條件為乙醇濃度70%,固液比18,溫度80,提取3次,每次3h ,在該工藝條件下葛根

25、總黃酮提取物的提取率為22.9%,樣品純度為15.5%。2.2葛根中葛根總黃酮含量的測定結(jié)果取10g 葛根,采用最佳工藝提取得到葛根總黃酮2.29g ,經(jīng)柱層析分離純 !(上接第7404頁黃酮具有一定的抗氧化作用。3結(jié)論(1通過正交試驗(yàn)確定葛根總黃酮的最佳提取條件為:溫度80、乙醇濃度70%、固液比18、提取3次、時(shí)間3h 。在該條件下葛根總黃酮的提取率為22.9%,樣品純度為15.5%;經(jīng)過柱層析純化后,樣品純度為46.2%。(2試驗(yàn)結(jié)果表明,葛根總黃酮對O 2-和OH 抑制率隨著濃度的增大而增大,且抑制率強(qiáng)于BHT ,表明葛根總黃酮具有抗氧化作用。參考文獻(xiàn)1顧志平,連文瑣,陳碧珠.中藥葛根

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29、黃酮和BHT 濃度梯度及抑制率Table 2Total flavonoid in puerarin,BHT concentrationgradient and inhibition rate 濃度Concentra !tion mg/ml 葛根總黃酮Total flavonoid inpuerarinBHT 葛根總黃酮Total flavonoid inpuerarin BHT 2.362.5632.0730.1450.044.765.1160.9951.5354.719.466.5762.4575.2359.7914.170.3766.7483.2968.7018.873.0371.8987

30、.9770.5623.076.5174.7792.3275.33對O -2的抑制率Inhibition rate of O -2對OH 的抑制率Inhibition rate of OH%0206030104050t h8.004.00012.0016.0020.00圖7不同配料水對殘留總糖含量的影響Fig.7Effects of different kinds of mixing water on residualtotal sugar content 總糖含量T o t a l s u g a r c o n t e n t %0206030104050t h6.004.0008.0010.0012.002.00圖8不同配料水對殘留還原糖含量的影響Fig.8Effects of different kinds of mixing water on residual r