細胞培養(yǎng)的基本技術原理

1、第一章 細胞培養(yǎng)的基本原理與技術 現(xiàn)代生物技術一般認為包括基因工程技術、細胞工程技術、酶工程技術和發(fā)酵工程技術，而這些技術的發(fā)展幾乎都與細胞培養(yǎng)有密切關系，特別是在醫(yī)藥領域的發(fā)展，細胞培養(yǎng)更具有特殊的作用和價值。比如基因工程藥物或疫苗在研究生產(chǎn)過程中很多是通過細胞培養(yǎng)來實現(xiàn)的?；蚬こ桃腋我呙绾芏嗍且?CHO 細胞作為載體；細胞工程中更是離不細胞培養(yǎng)，雜交瘤單克隆抗體，完全是通過細胞培養(yǎng)來實現(xiàn)的，既使是現(xiàn)在飛速發(fā)展的基因工程抗體也離不開細胞培養(yǎng)。正在倍受重視的基因治療、體細胞治療也要經(jīng)過細胞培養(yǎng)過程才能實現(xiàn)，發(fā)酵工程和酶工程有的也與細胞培養(yǎng)密切相關?？傊毎囵B(yǎng)在整個生物技術產(chǎn)業(yè)的發(fā)展中起到

2、了很關鍵的核心作用。 第一節(jié) 體外培養(yǎng)的概念 一、基本概念 體外培養(yǎng)（in vitro culture） ，就是將活體結(jié)構成分或活的個體從體或其寄生體取出，放在類似于體生存環(huán)境的體外環(huán)境中，讓其生長和發(fā)育的方法。 組織培養(yǎng)：是指從生物體取出活的組織（多指組織塊）在體外進行培養(yǎng)的方法。 細胞培養(yǎng)：是指將活細胞（尤其是分散的細胞）在體外進行培養(yǎng)的方法。 器官培養(yǎng)：是指從生物體取出的器官（一般是胚胎器官） 、器官的一部分或器官原基在體外進行培養(yǎng)的方法。 二、體、外細胞的差異和分化 1、差異：細胞離體后，失去了神經(jīng)體液的調(diào)節(jié)和細胞間的相互影響，生活在缺乏動態(tài)平衡的相對穩(wěn)定環(huán)境中，日久天長，易發(fā)生如下變

3、化：分化現(xiàn)象減弱；形態(tài)功能趨于單一化或生存一定時間后衰退死亡；或發(fā)生轉(zhuǎn)化獲得不死性，變成可無限生長的連續(xù)細胞系或惡性細胞系。因此，培養(yǎng)中的細胞可視為一種在特定的條件下的細胞群體，它們既保持著與體細胞一樣的基本結(jié)構和功能， 也有一些不同于體細胞的性狀。 實際上從細胞一旦被置于體外培養(yǎng)后，這種差異就開始發(fā)生了。 2、分化：體外培養(yǎng)的細胞分化能力并未完全喪失，只是環(huán)境的改變，細胞分化的表現(xiàn)和在體不同。細胞是否表現(xiàn)分化,關鍵在于是否存在使細胞分化的條件，如 Friend 細胞（小鼠紅白血病細胞）在一定的因素作用下可以合成血紅蛋白，血管皮細胞在類似基膜物質(zhì)底物上培養(yǎng)時能長成血管狀結(jié)構，雜交瘤細胞能產(chǎn)生特

4、異的單克隆抗體，這些均屬于細胞分化行為。 第二節(jié) 細胞培養(yǎng)的一般過程 一、準備工作 準備工作對開展細胞培養(yǎng)異常重要，工作量也較大，應給予足夠的重視，推備工作中某一環(huán)節(jié)的疏忽可導致實驗失敗或無法進行。準備工作的容包括器皿的清洗、干燥與消毒，培養(yǎng)基與其他試劑的配制、分裝與滅菌，無菌室或超凈臺的清潔與消毒，培養(yǎng)箱與其他儀器的檢查與調(diào)試。 二、取材 在無菌環(huán)境下從機體取出某種組織細胞（視實驗目的而定） ，經(jīng)過一定的處理（如消化分散細胞、分離等）后接入培養(yǎng)器血中，這一過程稱為取材。如是細胞株的擴大培養(yǎng)則無取材這一過程。機體取出的組織細胞的首次培養(yǎng)稱為原代培養(yǎng)。 理論上講各種動物和人體的所有組織都可以用于

5、培養(yǎng)，實際上幼體組織（尤其是胚胎組織）比成年個體的組織容易培養(yǎng)，分化程度低的組織比分化高的容易培養(yǎng)，腫瘤組織比正常組織容易培養(yǎng)。取材后應立即處理，盡快培養(yǎng)， 因故不能馬上培養(yǎng)時，可將組織塊切成黃豆般大的小塊，置4的培養(yǎng)液中保存。取組織時應嚴格保持無菌，同時也要避免接觸其他的有害物質(zhì)。取病理組織和皮膚與消化道上皮細胞時容易帶菌，為減少污染可用抗菌素處理。 三、培養(yǎng) 將取得的組織細胞接入培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中的過程稱為培養(yǎng)。如系組織塊培養(yǎng)，則直接將組織塊接入培養(yǎng)器皿底部，幾個小時后組織塊可貼牢在底部，再加入培養(yǎng)基。如系細胞培養(yǎng)，一般應在接入培養(yǎng)器皿之前進行細胞計數(shù)，按要求以一定的量（以每毫升細胞數(shù)表示）

6、接入培養(yǎng)器皿并直接加入培養(yǎng)基。細胞進入培養(yǎng)器皿后，立即放入培養(yǎng)箱中，使細胞盡早進入生長狀態(tài)。 正在培養(yǎng)中的細胞應每隔一定時間觀察一次，觀察的容包括細胞是否生長良好，形態(tài)是否正常，有無污染，培養(yǎng)基的 PH是否太酸或太堿（由酚紅指示劑指示） ，此外對培養(yǎng)溫度和 CO2濃度也要定時檢查。 原代培養(yǎng)一般有一段潛伏期（數(shù)小時到數(shù)十天不等） ，在潛伏期細胞一般不分裂，但可貼壁和游走。過了潛伏期后細胞進入旺盛的分裂生長期。 細胞長滿瓶底后要進行傳代培養(yǎng)， 將一瓶中的細胞消化懸浮后分至兩到三瓶繼續(xù)培養(yǎng)。每傳代一次稱為“一代” 。二倍體細胞一般只能傳幾十代，而轉(zhuǎn)化細胞系或細胞株則可無限地傳代下去。轉(zhuǎn)化細胞可能具

7、有惡性性質(zhì)，也可能僅有不死性（Immortality）而無惡性。 四、凍存與復（可參閱后面有關章節(jié)）為了保存細胞，特別是不易獲得的突變型細胞或細胞株，要將細胞凍存。凍存的溫度一般用液氮的溫度196，將細胞收集至凍存管中加入含保護劑（一般為二甲亞砜或甘油）的培養(yǎng)基，以一定的冷卻速度凍存，最終保存于液氮中。在極低的溫度下，細胞保存的時間幾乎是無限的。復一般采用快融方法，即從液氮中取出凍存管后，立即放入 37水中，使之在一分鐘迅速融解。然后將細胞轉(zhuǎn)入培養(yǎng)器皿中進行培養(yǎng)。 凍存過程中保護劑的選用、細胞密度、降溫速度與復時溫度、融化速度等都對細胞活力有影響。 五、常用儀器設備 無菌室,超凈工作臺,三重純

8、水蒸餾器,抽氣泵,壓力蒸氣消毒器,電熱恒溫培養(yǎng)箱,培養(yǎng)器具，CO2培養(yǎng)箱,恒溫水浴鍋,倒置顯微鏡,離心機,無菌過濾器,洗刷裝置,細胞計數(shù)板和電子細胞技術儀等等。 第三節(jié) 細胞培養(yǎng)的無菌環(huán)境 一、無菌室 無菌室的結(jié)構：一般由更衣間、緩沖間、操作間三部分組成。 無菌室的消毒和防污染：為保持無菌狀態(tài)，經(jīng)常消毒是必要的，通常采用每日（使用前）紫外照射（12 小時） ，每周甲醛、乳酸、過氧乙酸熏蒸（2 小時）和每月新潔爾滅擦拭地面和墻壁一次的方式進行消毒。實際工作中，要根據(jù)無菌室建筑材料的差異來選擇合適的消毒方法。 此外， 還應注意防止無菌室的污染。 造成無菌室污染的可能包括： 送入無菌室的風沒有被過濾

9、除菌； 進出無菌室時，能使外界空氣直接對流進無菌室的操作間；等。 二、超凈工作臺 工作原理：鼓風機驅(qū)動空氣通過高效過濾器得以凈化，凈化的空氣被徐徐吹過臺面空間而將其中的塵埃、細菌甚至病毒顆粒帶走，使工作區(qū)構成無菌環(huán)境。根據(jù)氣流在超凈工作臺的流動方向不同，可將超凈工作臺分為側(cè)流式、直 流式和外流式三種類型。 超凈臺的使用與保養(yǎng)：超凈臺的平均風速保持在0.32-0.48 米/秒為宜，過大、過小均不利于保持凈化度；使用前最好開啟超凈臺紫外燈照射 1030 分鐘， 然后讓超凈臺預工作1015 分鐘， 以除去臭氧和使用工作臺面空間呈凈化狀態(tài)；使用完畢后，要用 70%酒精將臺面和臺四周擦拭干凈，以保證超凈

10、臺無菌。還要定期用福爾馬林熏蒸超凈臺。 第四節(jié) 常用培養(yǎng)器皿與清洗消毒 細胞培養(yǎng)需要大量消耗性物品，如玻璃器皿、金屬器皿、塑料、橡膠制品、布類、紙類等，因此掌握清洗、消毒知識，學會清洗、消毒方法是從事細胞培養(yǎng)工作必須的。 一、清洗 離體條件下，有害物質(zhì)直接同細胞接觸，細胞對任何有害物質(zhì)十分敏感，極少殘留物都可以對細胞產(chǎn)生毒副作用。因此，新的或重新使用的器皿都必須認真清洗，達到不含任何殘留物的要求。 （一）玻璃器皿的清洗 一般經(jīng)過浸泡、刷洗、浸酸、和清洗四個步驟。 1 浸泡 新的或用過的玻璃器皿都要先用清水浸泡， 軟化和溶解附著物。 新玻璃器皿使用前得先用自來水簡單刷洗，然后用5鹽酸浸泡過夜；用

11、過的玻璃器皿往往附有大量蛋白質(zhì)和油脂，干涸后不易刷洗掉，故用后應立即浸入清水中備刷洗。 2 刷洗 將浸泡后的玻璃器皿放到洗滌劑水中，用軟毛刷反復刷洗。不要留死角，并防止破壞器皿表面的光潔度。將刷洗干凈的玻璃器皿洗凈、晾干，備浸酸。 3 浸酸 浸酸是將上述器皿浸泡到清潔液中，又稱酸液，通過酸液的強氧化作用清除器皿表面的可能殘留物質(zhì)。浸酸不應少于六小時，一般過夜或更長。放取器皿要小心。 4 沖洗 刷洗和浸酸后的器皿都必須用水充分沖洗，浸酸后器皿是否沖洗的干凈，直接影響到細胞培養(yǎng)的成敗。手工洗滌浸酸后的器皿，每件器皿至少要反復“注水倒空”15 次以上，最后用重蒸水浸洗 23 次，晾干或烘干后包裝備用

12、。 （二）橡膠制品清洗 新的橡膠制品洗滌方法：0.5mol/L NaOH煮沸15 分鐘，流水沖洗，0.5mol/L HCl煮沸15 分鐘，流水沖洗，自來水煮沸2 次，蒸餾水煮沸 20分鐘，50烤干備用。 （三）塑料制品的清洗 塑料制品特點：質(zhì)軟、易出現(xiàn)劃痕；耐腐蝕能力強、但不耐熱。 清洗程序：使用器皿后立即用清水清洗，浸于自來水過夜，用紗布或棉簽和 50清洗液刷洗，流水沖洗，晾干，浸于清潔液15 分鐘，流水沖洗（1520 遍）,蒸餾水浸洗三次，雙蒸水泡24 小時，晾干備用。 （四）包裝:對細胞培養(yǎng)用品進行消毒前，要進行嚴密包裝，以便于消毒和貯存。常用的包裝材料：牛皮紙、硫酸 紙、棉布、鋁飯盒、

13、較大培養(yǎng)皿等，近幾年用鋁箔包裝，非常方便，適用。培養(yǎng)皿、注射器、金屬器械等用牛皮紙包裝后再裝入飯盒，較大的器皿可以進行局部包扎。 二、消毒和滅菌 微生物污染是造成細胞培養(yǎng)失敗的主要原因 （一）物理消毒法 1.紫外線消毒 紫外線是一種低能量的電磁輻射，可殺死多種微生物。革蘭陰性菌最為敏感，其次是陽性菌，再次為芽孢，真菌孢子的抵抗力最強。紫外線的直接作用是通過破壞微生物的核酸與蛋白質(zhì)等而使其滅活，間接作用是通過紫外線照射產(chǎn)生的臭氧殺死微生物。直接照射培養(yǎng)室消毒，用法簡單，效果好。 紫外燈的消毒效果同紫外燈的輻射強度和照射劑量呈正相關， 輻射強度隨燈距離增加而降低， 照射劑量和照射時間呈正比。因此紫

14、外燈同被照射物的距離和照射時間要適合。離地面 2 米的 30W 燈可照射 9 平方米房間，每天照射23 小時，期間可間隔 30 分鐘。燈管離地面 2 米以外要延長照射時間，2.5 米照射效果較差。紫外燈照射工作臺的距離不應超過 1.5 米，照射時間30 分鐘為宜。 紫外燈不僅對皮膚、眼睛傷害，且對培養(yǎng)細胞與試劑等也產(chǎn)生不良影響，因此，不要開著紫外等操作。 2.高溫濕熱滅菌 壓力蒸汽滅菌是最常用的高溫濕熱滅菌方法。對生物材料有良好的穿透力，能造成蛋白質(zhì)變性凝固而使微生物死亡。布類、物、璃器皿、屬器皿、膠和某些培養(yǎng)液都可以用這方法滅菌。 不同壓力蒸汽所達到的溫度不同， 不同消毒物品所需的有效消毒壓

15、力和時間不同。 從壓力蒸汽消毒器中取出消毒好的物品（不包括液體） ，應立即放到 60-70烤箱烘干，再貯存?zhèn)溆?，否則，潮濕的包裝物品表面容易為微生物污染。煮沸消毒也是常用的濕熱消毒方法，它具有條件簡單、使用方便等特點。 3.高溫干熱消毒 干熱滅菌主要是將電熱烤箱物品加熱到160以上，并保持 90120 分鐘，殺死細菌和芽孢，達到滅菌目的。主要用于滅菌玻璃器皿（如體積較大的燒杯、培養(yǎng)瓶） 、金屬器皿以與不能與蒸汽接觸的物品（如粉劑、油劑） 。 干熱滅菌后要關掉開關并使物品逐漸冷卻后在打開，切忌立即打開，以免溫度驟變而使箱的玻璃器皿破裂。干烤箱物品間要有空隙，物品不要靠近加熱裝置。 燒灼也是滅菌方法之一，常利用臺面上的酒精燈的火焰對金屬器皿與玻璃器皿口緣進行燒灼消毒。 4.過濾除菌：是將液體或氣體用微孔薄膜過濾，使大于孔徑的細菌等微生物顆粒阻留，從而達到除菌目的。在體外培養(yǎng)時，過濾除菌大多用于遇熱容易變性而失效的試劑或培養(yǎng)液。目前，大多實驗室采用微孔濾膜濾器除菌。關鍵步驟是安裝濾膜與無菌過濾過程。 （二）化學消毒：新潔而滅，其0.1水溶液