單克隆抗體制備技術(shù)

1、單克隆抗體制備技術(shù) 廣州醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)系 徐霞基本概念n抗原決定鏃（抗原表位）n細(xì)胞克隆n多克隆抗體n單克隆抗體Antigenic determinantn是指抗原分子中決定抗原特異性的特殊化學(xué)基團(tuán)，又稱表位(epitope).n細(xì)胞克?。河梢粋€(gè)細(xì)胞增殖而成的細(xì)胞集團(tuán)nPolyclonal antibody,PcAb：針對(duì)多種抗原決定簇的混合抗體nMonoclonal antibody,McAb:由單個(gè)B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的針對(duì)單一抗原決定簇的同源抗體雜交瘤技術(shù)的理論基礎(chǔ)n淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體的克隆選擇學(xué)說(shuō)，即一種克隆只產(chǎn)生一種抗體n細(xì)胞融合技術(shù)產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞可以保持雙方親代細(xì)胞的特性n利用代謝缺陷補(bǔ)救機(jī)

2、理篩選雜交瘤細(xì)胞，并克隆化，制備McAbn當(dāng)兩個(gè)細(xì)胞緊密接觸時(shí)，細(xì)胞膜可能融合在一起。融合細(xì)胞含有兩個(gè)不同的細(xì)胞核，稱為異核體，產(chǎn)生具有原來(lái)兩個(gè)細(xì)胞基因信息的單個(gè)核細(xì)胞，稱為雜交細(xì)胞（hybrid cell）。細(xì)胞DNA合成途經(jīng)1.替代途徑：次黃嘌呤（H） HGPRT2.主要途徑：氨 基 酸 鳥(niǎo)嘌呤核苷酸谷 氨 酰 胺 （A-）尿核苷單磷酸 胸腺嘧啶核苷酸 TK3.次要途徑：胸腺嘧啶核苷（T）HAT選擇培養(yǎng)基的原理nHAT選擇培養(yǎng)基組分 次黃嘌呤（hypoxanthine,H) 氨甲喋呤（aminopterin,A):葉酸拮抗劑 胸腺嘧啶核苷（thymidine,T)抗原免疫的脾細(xì)胞 小鼠骨髓

3、瘤細(xì)胞 （B細(xì)胞） （B細(xì)胞惡性腫瘤） 1. 抗體分泌（Ig+) 1.具永生性 2.HGPRT+在HAT生長(zhǎng) 2.8-AG篩選出 HGPRT-株 PEG 融合 HAT篩選 脾-骨髓瘤細(xì)胞（雜交瘤細(xì)胞） （HGPRT+、Ig+） 融合的結(jié)果及命運(yùn)雜交瘤細(xì)胞未融合的脾細(xì)胞未融合的骨髓瘤細(xì)胞脾-脾雜交細(xì)胞骨髓瘤-骨髓瘤雜交細(xì)胞 免疫動(dòng)物 培養(yǎng)骨髓瘤細(xì)胞 收集致敏的B淋巴細(xì)胞 收集骨髓瘤細(xì)胞 細(xì)胞融合 HAT選擇培養(yǎng)基篩選雜交瘤細(xì)胞 檢測(cè)篩選陽(yáng)性細(xì)胞 克隆化培養(yǎng)（反復(fù)3-5次） 獲得穩(wěn)定分泌McAb的雜交瘤細(xì)胞株 McAb的制備（雜交瘤培養(yǎng)上清或誘生腹水） McAb 純化及鑒定 制備單克隆抗體的基本技

4、術(shù)1 抗原提純與動(dòng)物免疫2 骨髓瘤細(xì)胞及飼養(yǎng)細(xì)胞的制備 3 細(xì)胞融合4 抗體檢測(cè)5 雜交瘤的克隆化和凍存6 McAB的制備7 單克隆抗體的純化n免疫成功的標(biāo)志是在融合時(shí)脾臟能夠提供處于增殖狀態(tài)的特異性B細(xì)胞，此時(shí)血清中抗體效價(jià)不一定最高。n可溶性抗原10-15ug/100ul+等量弗氏完全佐劑注射小鼠腹腔 2-4周后加強(qiáng)免疫（量減半，改用不完全佐劑，可反復(fù)多次） 沖擊免疫（融合前3天進(jìn)行）n選用6-12周齡Balb/c小鼠n顆粒性抗原免疫性較強(qiáng)，不加佐劑就可獲得很好的免疫效果 n可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐劑 n目前，用于可溶性抗原(特別是一些弱抗原)的免疫方案也不斷有所更新，如將可溶性抗

5、原顆?；蚬滔嗷?，一方面增強(qiáng)了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。改變抗原注入的途徑，基礎(chǔ)免疫可直接采用脾內(nèi)注射。使用細(xì)胞因子作為佐劑，提高機(jī)體的免疫應(yīng)答水平，促進(jìn)免疫細(xì)胞對(duì)抗原反應(yīng)性。nn骨髓瘤細(xì)胞系選擇要點(diǎn)：n穩(wěn)定易培養(yǎng)、自身不分泌Ig、融合率高、HGPRT缺陷株n常用骨髓瘤細(xì)胞系有：NS1、SP20、X63 等。n保存：防止突變、定期篩選（8-氮鳥(niǎo)嘌呤） 防止支原體污染（胎牛血清）n融合時(shí)保證骨髓瘤細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，良好的形態(tài)，活細(xì)胞計(jì)數(shù)高于95 n融合比例 脾細(xì)胞：骨髓瘤細(xì)胞=3：1許多環(huán)節(jié)需要加飼養(yǎng)細(xì)胞，如：在雜交瘤細(xì)胞篩選、克隆化和擴(kuò)大培養(yǎng)過(guò)程中 n常用的飼養(yǎng)細(xì)胞有：小鼠

6、腹腔巨噬細(xì)胞 n飼養(yǎng)細(xì)胞一般在融合前一天制備n免疫脾細(xì)胞：處于免疫狀態(tài)脾臟中B淋巴母細(xì)胞-漿母細(xì)胞。一般取最后一次加強(qiáng)免疫3天后的脾臟。n融合比例：n骨髓瘤細(xì)胞：脾細(xì)胞=1：5或1：10n融合劑：40%PEG（分子量1000-2000）n融合24小時(shí)后加HAT培養(yǎng)液 2周后 改用HT培養(yǎng)液 2周后 改用一般培養(yǎng)液n一般在雜交瘤細(xì)胞布滿孔底1/10時(shí)，開(kāi)始檢測(cè)特異性抗體，篩選出所需雜交瘤細(xì)胞系。n可靠的篩選方法須在融合前建立，避免由于方法不當(dāng)貽誤篩選時(shí)機(jī)。n克隆化：指將抗體陽(yáng)性孔進(jìn)行克隆化。目的是將抗體分泌細(xì)胞、抗體非分泌細(xì)胞、特異性抗體分泌細(xì)胞和無(wú)關(guān)抗體分泌細(xì)胞分開(kāi)。n克隆化的原則：盡早進(jìn)行，

7、反復(fù)4-5次n克隆化方法：有限稀釋法、軟瓊脂平板法、顯微克隆法n陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞應(yīng)及時(shí)凍存，防染色體丟失、變異及污染n單抗生產(chǎn)的方法：n動(dòng)物體內(nèi)誘生法：小鼠腹腔注射降植丸或液體石蠟，1周后腹腔注射雜交瘤細(xì)胞，7-10天后出現(xiàn)腹水，無(wú)菌采集。單抗純化方法：n鹽析n凝膠過(guò)濾n離子交換層析n親和層析法n辛酸沉淀法n用中性鹽使蛋白質(zhì)沉淀析出的方法為鹽析。大量的鹽加入到蛋白溶液中，高濃度的鹽離子有很強(qiáng)的水化力，可奪取蛋白質(zhì)的水化層，使蛋白質(zhì)膠粒失水發(fā)生凝聚而沉淀析出。 血清 50%飽和度硫酸胺 上清 （清蛋白） 沉淀（球蛋白） 33%飽和度硫酸胺 上清 沉淀 擬球蛋白 r球蛋白凝膠過(guò)濾法n干燥的凝膠顆粒吸

8、水后形成了多孔膠粒，將蛋白質(zhì)溶液加在凝膠柱上進(jìn)行洗脫時(shí)，大分子蛋白不能穿過(guò)凝膠網(wǎng)孔進(jìn)入膠粒內(nèi)，留在膠粒間隙的溶液中，隨洗脫液最先流出，小分子蛋白可穿過(guò)凝膠網(wǎng)孔進(jìn)入膠粒內(nèi)，受到凝膠的阻留，向下移動(dòng)較慢洗脫出來(lái)較慢，據(jù)此將不同大小的蛋白質(zhì)分離出來(lái)。n交聯(lián)葡聚糖凝膠(Sephadex)n瓊脂糖凝膠(Sepharose)離子交換層析法nDEAE纖維素：結(jié)合溶液中帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)，又稱陰離子交換劑nCM纖維素：結(jié)合溶液中帶正電荷的蛋白質(zhì)，又稱陽(yáng)離子交換劑親和層析法n將抗原（或抗體）連接到固相載體上，特異性吸附液相中的抗體（或抗原），形成抗原抗體復(fù)合物，然后改變條件，使抗原抗體復(fù)合物解離洗脫出純化的抗體（

9、或抗原）。nA蛋白-Sepharose CL 4Bn單克隆抗體特性n理化性狀高度均一，生物活性專一，只與一種抗原表位發(fā)生反應(yīng)，特異性強(qiáng)，純度高，易于實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化和大量制備單克隆抗體在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用n檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)診斷試劑n（1）病原微生物抗原抗體的檢測(cè)n（2）腫瘤抗原的檢測(cè)n（3）免疫細(xì)胞及其亞群的檢測(cè)n（4）激素測(cè)定n（5）細(xì)胞因子的測(cè)定n蛋白質(zhì)的提純n腫瘤的導(dǎo)向治療和放射免疫顯像技術(shù)基因工程抗體與抗體庫(kù)技術(shù)n單抗體內(nèi)應(yīng)用和療效受限原因：n1.鼠源性單抗對(duì)人體有較強(qiáng)的免疫原性n2.注入人體的單抗在腫瘤部位的攝取量甚少n3.生產(chǎn)成本高,難于普及應(yīng)用n人雜交瘤技術(shù)未獲真正突破原因:n融合率低、建株難、不穩(wěn)定、產(chǎn)量低、人體不能隨意免疫n基因工程抗體：用基因工程技術(shù)改造現(xiàn)有優(yōu)良的鼠單抗基因，著眼點(diǎn)在于盡量