基因工程復(fù)習(xí)重點(diǎn)

1、基因工程的概念：利用DNA體外重組或PCR擴(kuò)增技術(shù)從某種生物基因組中分離感興趣的 基因，或是用人工合成的方法獲取基因，然后經(jīng)過一系列切割，加工修飾，連接反應(yīng)形成重組DNA分子，再將其轉(zhuǎn)入適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞，以期獲得基因表達(dá)的過程 同裂酶（isoschizomer）來源于不同的生物，能識(shí)別相同順序的限制酶 同尾酶（isocaudamer）有些限制酶識(shí)別序列不同，但切割產(chǎn)生的末端是相同的Klenow片段：用枯草桿菌蛋白酶或胰蛋白酶降解大腸桿菌DNA聚合酶I而得到的該酶的大片段，稱為Klenow片段分子克隆載體是一類可供外源 DNA插入并攜帶重組 DNA分子進(jìn)入適當(dāng)宿主細(xì)胞的DNA分子。哺乳動(dòng)物人工染色

2、體（MAC ）:哺乳動(dòng)物人工染色體（MAC ）指從哺乳動(dòng)物細(xì) 胞中分離出復(fù)制起始區(qū)、端粒以及著絲粒構(gòu)建而成的克隆載體。它可以克隆大 于1000kb的外源 DNA片段。酵母雜交系統(tǒng)載體：一類載體中存在一個(gè) DNA-結(jié)合序列（BD），它與已知的釣餌序列融合；另一類載體則含有基因表達(dá)激活序列（AD），它則與未知或已知的捕獵序列融合。細(xì)菌人工染色體（BAC ） BAC:是基于大腸桿菌的 F質(zhì)粒構(gòu)建的，高通量低拷貝的質(zhì)粒載 體。每個(gè)環(huán)狀 DNA分子中攜帶一個(gè)抗生素抗性標(biāo)記，一個(gè)來源于大腸桿菌F因子（致育因子）的嚴(yán)謹(jǐn)型控制的復(fù)制子oriS （ Shizuya et al. 1992 ），個(gè)易于 DNA 復(fù)

3、制的由 ATP驅(qū)動(dòng)的解旋酶（RepE）以及三個(gè)確保低拷貝質(zhì)粒精確分配至子代細(xì)胞的基因座（parA ,parB ,和 parC ）。裝載片段 100 300kb。P1人工染色體載體（PAC） P1噬菌體載體的改造，結(jié)合了 P1噬菌體載體和 BAC載體的 優(yōu)點(diǎn)。 克隆外源片斷130-150kb酵母菌人工染色體（YAC）廣泛用于構(gòu)建高等動(dòng)植物基因組文庫的構(gòu)建,由YLp經(jīng)適當(dāng)改造后構(gòu)建成pYAC載體。裝載片段為 200500kb。DNA芯片技術(shù)：DNA芯片（或基因芯片）是將許多特定的 DNA寡核苷酸或DNA片段（稱 為探針）固定在芯片的每個(gè)預(yù)先設(shè)置的區(qū)域內(nèi)，將待測(cè)樣本標(biāo)記后同芯片進(jìn)行雜交分析，利用堿基

4、互補(bǔ)配對(duì)原理進(jìn)行雜交，通過檢測(cè)雜交信號(hào)并進(jìn)行計(jì)算機(jī)分析，從而檢測(cè)對(duì)應(yīng)片段是否存在、存在量的多少，以及用于基因的功能研究和基因組研究、疾病的臨床診斷和檢測(cè)等眾多方面基因組文庫：含有某種生物全部遺傳信息的重組DNA分子的克隆總和cDNA文庫：從一定生長(zhǎng)階段或條件的某種細(xì)胞分離到的全部mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄成 cDNA后再重組和增殖所產(chǎn)生的無性繁殖系的總和。限制性內(nèi)切酶的識(shí)別特點(diǎn)：【1】絕大多數(shù)酶的識(shí)別序列是特異的， 僅有少數(shù)有變動(dòng) 【2】識(shí)別序列一般為46個(gè)堿 基對(duì)，一般都富含 GC 【3】大多數(shù)識(shí)別序列具有 180°旋轉(zhuǎn)對(duì)稱的回文結(jié)構(gòu)（Pali ndrome） 限制性內(nèi)切酶的切割方式 ：【1

5、】切點(diǎn)大多數(shù)在識(shí)別順序之內(nèi)【 2】少數(shù)在識(shí)別順序之外DNA經(jīng)限制酶切后，產(chǎn)生 2種類型的末端 ： 粘性末端（sticky end）和平整末端（blunt end） 限制酶反應(yīng)條件：DNA（ DNA的純度與甲基化程度）、限制酶、反應(yīng)緩沖液（Tris-Cl、NaCl、 Mg2+ ）、反應(yīng)時(shí)間與溫度：限制酶星反應(yīng)：在變化的條件下，限制酶識(shí)別序列特異性降低 限制性內(nèi)切酶的分類：I型：識(shí)別特定序列，切割位點(diǎn)在距識(shí)別位點(diǎn)至少1000 bp處隨機(jī)切割I(lǐng)I型：識(shí)別特定序列并在識(shí)別位點(diǎn)處或附近切割I(lǐng)II型：識(shí)別特定序列，切割位點(diǎn)在距識(shí)別位點(diǎn)3'端2527bp處隨機(jī)切割DNA連接酶的特點(diǎn)：DNA連接酶廣泛

6、存在于各種生物體內(nèi)，其催化的基本反應(yīng)是：將DNA雙鏈上的相鄰堿基的 5' -P04和3' -OH共價(jià)結(jié)合形成 3' -5'磷酸二酯鍵連接反 應(yīng)是一個(gè)吸能的反應(yīng)，E.coli及其它細(xì)菌以NAD為能源，動(dòng)物及噬菌體以 ATP為能源連接酶的最佳反應(yīng)溫度是 37C,但在這個(gè)溫度下，粘性末端之間的氫鍵結(jié)合是不穩(wěn)定的， 因此連接反應(yīng)的溫度一般在415 C基因工程中常用的DNA連接酶是T4噬菌體DNA連接酶2、限制酶產(chǎn)生的末端的連接【1】相同粘性末端的連接1、由同一種限制酶產(chǎn)生的帶相同突出末端的兩個(gè)片段2、由不同的限制酶酶切但帶有相同突出末端的兩個(gè)片段【2】平整末端的連接1、

7、平整末端可直接進(jìn)行連接，但連接效率比粘性末端的連接要困難得多，所需的酶量也 多S1核酸酶：特異性降解單鏈 DNA和RNA ,在最適條件下，降解單鏈的速度比雙鏈快75000倍。最佳pH 4.5核糖核酸酶特異性降解RNA用于除去DNA樣品中的RNA分子RNase H 降解 DNA-RNA 雜交分子中的 RNA鏈用于cDNA文庫建立時(shí)除去 RNA鏈以便第二條鏈 cDNA鏈的合成脫氧核糖核酸酶I （DNase I）降解ss和ds-DNA用途：制備RNA樣品時(shí)除去DNA分子 切口移位，制備 DNA探針01、5'宀3' DNA聚合酶活性，要求 3' -OH的引物和模板 DNA 2、

8、5'宀3'核酸 外切酶活性，具有雙鏈特異性3、3' t 5'核酸外切酶活性，具有單鏈特異性，對(duì)ds-DNA的降解活性很低，是 ss-DNA的過剩反應(yīng)用途：除去3'-端突起的單鏈 DNA （在無dNTP時(shí)）;補(bǔ)齊5'-突起端合成第二條 cDNA ; 切口移位制備探針Klenow片段用途：用同位素標(biāo)記具5'端突起的DNA片段末端；補(bǔ)平5'粘性末端 第二條cDNA鏈的合成；DNA序列測(cè)定標(biāo)記基因的作用1）指示外源DNA分子（載體或重組分子）是否進(jìn)入宿主細(xì)胞2）指示外源DNA分子是否插入載體分子形成了重組子。.標(biāo)記基因的種類1）抗性標(biāo)記基

9、因（可直接用于選擇轉(zhuǎn)化子）a. 抗生素抗性基因：Apr , Tcr , Cmr, Kanr, G418r, Hygr , Neorb. 重金屬抗性基因：Cur , Znr , Cd r; c.代謝抗性基因：TK ,抗除草劑基因2） 營(yíng)養(yǎng)標(biāo)記基因（可直接用于選擇轉(zhuǎn)化子）：主要是參與氨基酸，核苷酸及其他必需營(yíng)養(yǎng) 物合成酶類的基因，這類基因在酵母轉(zhuǎn)化中使用最頻繁，如TRP1 , URA3 , LEU2 , HIS43） 牛化標(biāo)記基因其表達(dá)產(chǎn)物可催化某些易檢測(cè)的?；磻?yīng).如lacZ, GUS, CAT4）噬菌斑常用的遺傳標(biāo)記基因：1）四環(huán)素抗性基因（Tcr）; 2）氨芐青霉素抗性基因（Apr）3）氯霉

10、素抗性基因（Cmr）; 4）卡那霉素（Ka nr）,新霉素（Neor）和G418抗性（G418r）基因5）3半乳糖苷酶基因（lacZ和lacZ a或 lacZ'）; 6）葡萄糖苷酸酶基因（GUS）7）熒光素酶基因；8）發(fā)光蛋白質(zhì)基因穿梭載體范圍：細(xì)菌一細(xì)菌（放線菌），細(xì)菌一酵母菌，細(xì)菌一真菌，細(xì)菌 一動(dòng)物表達(dá)型載體(expressi on vector)1）特點(diǎn)：a.基因的啟動(dòng)子序列和終止子序列；b. 一般無檢測(cè)標(biāo)記基因；c.克隆位點(diǎn)是確定的（即位于啟動(dòng)子序列后）；d.重組分子用凝膠電泳檢出（依賴于分子量差異）。2）結(jié)構(gòu):a.轉(zhuǎn)化單元-宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化；b.表達(dá)單元-外源基因表達(dá)3）類型：

11、I型：轉(zhuǎn)錄起始區(qū)（調(diào)控序列 +啟動(dòng)子）+終止子n型：轉(zhuǎn)錄起始區(qū)+翻譯起始區(qū)（核糖體結(jié)合序列和起始密碼子）+終止子川型：轉(zhuǎn)錄起始區(qū)+翻譯起始區(qū)+信號(hào)肽鏈編碼區(qū) +終止子（常稱之為表達(dá)分泌型載體）4）用途:a.表達(dá)外源基因以產(chǎn)生大量外源基因產(chǎn)物；b.用于構(gòu)建cDNA文庫5）注意事項(xiàng)：a.啟動(dòng)子來源；b.終止子來源；c.啟動(dòng)子的啟動(dòng)效率；d.信號(hào)肽來源與結(jié)構(gòu)；e.調(diào)控類型3. 失控型質(zhì)粒載體4.探針型載體5、定序型載體：主要用于核苷酸的序列測(cè)定6.整合型載體：結(jié)構(gòu)與復(fù)制起點(diǎn)探針型載體相同，僅是用于不同目的，該類載體轉(zhuǎn)化頻率 低，但轉(zhuǎn)化體十分穩(wěn)定。E.coli克隆載體的種類1. 質(zhì)粒載體一復(fù)制起點(diǎn)來自

12、一些天然質(zhì)粒。2.噬菌體載體一入，P1和M13、fd載體，復(fù)制起點(diǎn)來自噬菌體。3. COS質(zhì)粒載體一質(zhì)粒載體中插入 入cos片段，以利于體外包裝4. 噬粒載體（phagemid）有質(zhì)粒和M13、fd的復(fù)制起點(diǎn)，以質(zhì)?；蚴删w方式復(fù)制噬菌體入載體入噬菌體侵入菌體后，把自身DNA加進(jìn)細(xì)菌DNA里（整合），作為細(xì)菌基因的一部分，隨菌的細(xì)胞分裂而增殖，這種生活狀態(tài)稱為溶原（lysogen）。入噬菌體從溶原轉(zhuǎn)為裂解是一種可誘導(dǎo)過程。2、入噬菌體可以容納較大的目的基因：基因文庫構(gòu)建常使用入載體；入噬菌體的缺陷：基因組太大（49kb）酶切點(diǎn)太多 野生型只能接納一定長(zhǎng)度的DNA入噬菌體的改造： 切去非必須區(qū)段

13、，在切去的同時(shí)，加載目的基因 去掉太多的酶位點(diǎn)， 每種酶只留1-2個(gè)切口 增加標(biāo)記基因（4）引入無義突變核酸包括DNA、RNA兩種分子，在細(xì)胞中都是以與蛋白質(zhì)結(jié)合的方式存在的真核生物95%DNA存在于細(xì)胞核內(nèi)，5%在細(xì)胞器75%的RNA存在于細(xì)胞質(zhì)，10%在核內(nèi)，15%在細(xì)胞器rRNA （8085%）, tRNA 及核內(nèi)小分子 RNA （1015%）, mRNA （1 5%）核酸分離提取的原則 1.保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性2.排除其它分子的污染質(zhì)粒載體的分離與純化關(guān)鍵：如何使質(zhì)粒DNA與宿主染色體DNA分開堿變性法提取質(zhì)粒 DNA的步驟：收集細(xì)胞沉淀一加入溶液 I （50mM葡萄糖，25mMT

14、ris-HCI, 10mM EDTA, 45mg/mL 溶菌酶）一加入溶液 II （0.2M NaOH, 1%SDS （在強(qiáng)堿性環(huán)境中暴 露時(shí)間過長(zhǎng)，cccDNA可發(fā)生不可逆變性） 一加入溶液III （3M NaAc pH4.8 離心除去沉淀， 得含質(zhì)粒DNA的上清液一苯酚抽提去除蛋白質(zhì)一乙醇沉淀收集質(zhì)粒DNA染色體DNA的分離純化關(guān)鍵：盡可能地保持其高分子量RNA的分離與純化關(guān)鍵：防止內(nèi)外源RNase的作用RNase的特點(diǎn)：抗酸抗堿，具很廣pH作用范圍；抗高溫嚴(yán)寒（065 C均具活性，100 C也不能 使之完全失活）；抗變性劑（變性劑只能使之暫時(shí)失活，去除變性劑后又可恢復(fù)活性）；酶活性不需要

15、輔助因子；存在范圍廣核酸貯存：DNA :溶于 TE 中，放置于 4C、-20C、-70 CRNA :溶于 0.3M NaAc（pH5.2）或ddH2O中，-70 C ;長(zhǎng)期保存可以沉淀形式貯存于乙醇中，-20 C凝膠電泳：脈沖場(chǎng)凝膠電泳、瓊脂凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳分子雜交技術(shù)： Southern 雜交（DNA ）, Northern Blotting （ RNA ）, Western Blotting （蛋白 質(zhì)）PCR技術(shù)一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的 PCR 反應(yīng)體系（50100 卩 I） 50 mmol/L KCI ; 10 mmol/L Tris-HCI （ pH=8.4 ）; 1.5 mmol/L

16、 MgCI2 ;100卩g/ml 明膠或牛血清白蛋白 （BSA） ;2個(gè)引物，各0.25卩moI/L ; dNTP=dATP+dCTP+dGTP+dTTP ）各 200 卩 mol/L ;模板 DNA （人基因組 DNA ）0.11 卩g; Taq DNA 聚合酶 2 U; Denaturation 94 °C , 0.5min ; Primer annealing 55 °C , 1.5mion ; Extension 72 C , 1min ; 30 cycles變性（模板）退火（引物與模板）延伸（新合成DNA鏈）建立基因組文庫的一般程序1. 載體DNA片段的制備：DN

17、A分離純化一限制酶切一脫磷酸化反應(yīng)2. 供體DNA片段的制備：總 DNA分離純化一機(jī)械剪切法一分離特定大小DNA片段3. 供體與載體DNA連接：要提高重組頻率，應(yīng)注意連接反應(yīng)體系中的總DNA濃度和兩種DNA分子的克分子比率。4. 重組DNA分子的轉(zhuǎn)移和基因組文庫的擴(kuò)增：利用轉(zhuǎn)化或感染方法將連接DNA分子導(dǎo)入宿主細(xì)胞，讓其自主復(fù)制，重組DNA分子被擴(kuò)增（重組子比率可能發(fā)生變化）5. 基因組文庫質(zhì)量的評(píng)價(jià)1）文庫規(guī)模-隨機(jī)挑取一些轉(zhuǎn)化子或重組子，提取質(zhì)粒DNA，電泳測(cè)定插入片段大小，然后根據(jù)上述公式計(jì)算文庫大小。2）重組頻率頻率越咼，質(zhì)量越咼，可大大減輕后續(xù)篩選基因工作量。利用質(zhì)粒載體構(gòu)建基因組文

18、庫該法簡(jiǎn)單、快速、易于操作，但僅適合一些低等真核生物和原核生物。CDNA文庫的特點(diǎn)：1基因特異性;2器官特異性；3代謝或發(fā)育特異性處于不同代謝階段 （或發(fā)育階段）的結(jié)構(gòu)基因表達(dá)亦不相同；4不均勻性；5各cDNA均可獲得表達(dá)（一般選用的載體都是表達(dá)型的）建立cDNA文庫的一般程序：1.載體DNA片段的制備;2.多聚（A） RNA的分離與純化;3. 雙鏈cDNA的合成：1）單鏈cDNA的合成：反轉(zhuǎn)錄法；2）第二條cDNA的合成：堿解或酶解（RNaseH）法除去 RNA分子 cDNA第一鏈的合成cDNA第二鏈的合成自身引導(dǎo)法：獲得的雙鏈 置換合成法：獲得的雙鏈 引導(dǎo)合成法：獲得的雙鏈cDNA 5 &

19、#39;端會(huì)有幾對(duì)堿基缺失 cDNA 5 '端也會(huì)有幾對(duì)堿基缺失 cDNA能保留完整的5'端序列4. ds- cDNA 與載體 DNA 相連1 ）人工接頭：要求具平端ds- cDNA，酶切時(shí)可能導(dǎo)致某些 cDNA鏈斷裂2）同聚物加尾：可大大減少載體DNA自身連接；3） cDNA的定向插入5. 重組cDNA分子的轉(zhuǎn)移和文庫的建立選用載體為質(zhì)粒，可直接轉(zhuǎn)化E.coli;若為入載體，則需進(jìn)行體外包裝、感染等。獲得基因的一般方法1. 化學(xué)合成方法：主要用于較小基因的合成，或需改變密碼子的基因。2. 半化學(xué)合成法：mRNA t cDNA宀加人工接頭或合成一段 DNA宀與載體相連3. 篩選

20、法：用于各種方法從基因組文庫或cDNA文庫中選擇目的基因甲基化酶 活性對(duì)限制酶活性的影響【1】.dem和dam甲基化酶對(duì)限制酶的影響（1）抑制某些限制酶的活性，不管兩種限制酶的識(shí)別順序是完全重疊還是邊界重疊（2）不能抑制某些限制酶活性，不管兩者的識(shí)別順序?yàn)楹畏N重疊【2】II型甲基化酶對(duì)限制酶活性的影響（1）抑制同種限制酶的活性（2）抑制不同種限制酶的活性（3）抑制不同種限制酶的部分活性甲基化酶的用途（1） 改變某些限制酶識(shí)別順序的特異性，以便重組體的形成（2） 在建立基因文庫時(shí)，可先使 DNA分子部分甲基化，然后再用限制酶切分子克隆載體的功能：為外源基因提供進(jìn)入受體細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力；為外源基因提

21、供在受體細(xì)胞的復(fù)制能力或整合能力；為外源基因提供在受體細(xì)胞中的擴(kuò)增和表達(dá)能力載體特點(diǎn)：1.至少有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，因而至少可在一種生物體中自主復(fù)制。2. 至少應(yīng)有一個(gè)克隆位點(diǎn)，以供外源DNA插入。3. 至少應(yīng)有一個(gè)遺傳標(biāo)記基因，以指示載體或重組 DNA分子是否進(jìn)入宿主細(xì)胞分子克隆載體的轉(zhuǎn)化頻率和穩(wěn)定性.影響轉(zhuǎn)化頻率的因素：1）復(fù)制起點(diǎn)類型：盡可能選擇高拷貝復(fù)制起點(diǎn)2）標(biāo)記基因：盡可能選擇高效表達(dá)的標(biāo)記基因影響穩(wěn)定性的因素：1）復(fù)制起點(diǎn)類型一低拷貝載體穩(wěn)定，高拷貝載體穩(wěn)定性差2）選擇壓力3）載體在宿主細(xì)胞中的狀態(tài) 一自主復(fù)制型和整合型；4）宿主細(xì)胞的遺傳特性和生理特性 質(zhì)粒的特點(diǎn)：1）質(zhì)粒DNA復(fù)制

22、與染色體復(fù)制無關(guān) 2）質(zhì)粒DNA以超螺旋形式存在 3）質(zhì)粒 DNA可以接合轉(zhuǎn)移4）質(zhì)粒的不相容性和不相容群5）質(zhì)粒DNA的消除一化學(xué)和物理法（吖丫啶染料，EtBr，高溫等）6）質(zhì)粒的整合一F因子又可整合到 E.coli染色體中質(zhì)粒DNA的類型：接合型和非接合型；含大腸桿菌素Col質(zhì)粒和含抗菌；素抗性基因的R質(zhì)粒；F因子和F'因子等。COS質(zhì)粒載體優(yōu)點(diǎn)i .容量大（可達(dá)45 kb）,用于基因簇的克隆ii .形成的重組DNA分子可進(jìn)行體外包裝， 并能感染E.coli細(xì)胞iii .操作簡(jiǎn)便，可直接轉(zhuǎn)化細(xì)胞iv .對(duì)重組DNA分子長(zhǎng)度具有選擇性包裝 遺傳標(biāo)記：與質(zhì)粒載體相同，利用抗生素抗性選擇

23、轉(zhuǎn)化子革蘭氏陽性菌（G+ ）克隆載體1.枯草桿菌克隆載體1） B.subtilis作為宿主菌的優(yōu)點(diǎn)i .芽孢形成過程可用于闡明細(xì)胞發(fā)育過程ii.遺傳背景較清 楚，可直接導(dǎo)入外源 DNA i.非致病細(xì)菌，因而安全 v .研究結(jié)果可用于其它芽孢桿菌v.存在各種分泌蛋白質(zhì)2）B.subtilis作為宿主菌的缺點(diǎn)i .存在多種蛋白酶基因和相應(yīng)產(chǎn)物i .外源DNA導(dǎo)入細(xì)胞后不穩(wěn)定，易發(fā)生重組反應(yīng)核酸提取的基本要求： 盡量簡(jiǎn)化操作步驟，縮短提取過程，以減少各種有害因素對(duì)核酸的破壞；減少化學(xué)因素對(duì)核酸的降解（過酸、過堿）；減少物理因素對(duì)核酸的降解（機(jī)械剪切力、高溫）；防止核酸的生物降解提取核酸的一般程序：破

24、碎細(xì)胞去除與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)及多糖等一去除其它核酸分子沉淀核酸，去除鹽類、有機(jī)溶劑等雜質(zhì)純化核酸核酸的質(zhì)量評(píng)估（電泳、D260/OD280，酶切）DNA序列分析1.雙脫氧核苷酸鏈終止法Sanger法雙脫氧（2', 3'）-核苷酸可以象2'-脫氧核苷酸那樣直接摻入新合成的DNA鏈中，但因3'端不具0H基，DNA鏈合成至此中斷。由于雙脫氧核苷酸在每個(gè)DNA分子中摻入的位置不同，故可根據(jù)不同長(zhǎng)度的 DNA片段測(cè)定出核苷酸序列2. Maxam-Gilbert 化學(xué)法原理：DNA鏈上的不同堿基可以和堿基修飾劑發(fā)生反應(yīng)，然后發(fā)生12個(gè)堿基的脫落或取代，最后發(fā)生鏈斷裂，不同位

25、置斷裂的DNA分子經(jīng)凝膠電泳就可確定其核苷酸序列化學(xué)法測(cè)序的一大優(yōu)點(diǎn)是不需要模板，引物和 DNA聚合酶。待測(cè) DNA鏈的檢測(cè)用32P末 端標(biāo)記引物設(shè)計(jì)的一般原則：引物的長(zhǎng)度常為1730; GC含量為40%60% ; Tm值高于55 C； 兩條引物間配對(duì)堿基數(shù)小于5個(gè)；引物自身配對(duì)（特別是在引物的3'端）形成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，莖的堿基配對(duì)數(shù)不大于 3 （通常采用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)）建立cDNA文庫的一般程序：1.載體DNA片段的制備;2.多聚（A） RNA的分離與純化3. 雙鏈cDNA的合成：1）單鏈cDNA的合成：反轉(zhuǎn)錄法2）第二條cDNA的合成：堿解或酶解（RNaseH）法除去 RNA分子cD

26、NA第一鏈的合成 ;cDNA第二鏈的合成自身引導(dǎo)法：獲得的雙鏈 cDNA 5 '端會(huì)有幾對(duì)堿基缺失；置換合成法：獲得的雙鏈cDNA 5 '端也會(huì)有幾對(duì)堿基缺失；引導(dǎo)合成法：獲得的雙鏈cDNA能保留完整的5 '端序列4. ds- cDNA與載體DNA相連：1）人工接頭：要求具平端 ds- cDNA ,酶切時(shí)可能導(dǎo)致某些cDNA鏈斷裂2）同聚物加尾：可大大減少載體DNA自身連接3） cDNA的定向插入5. 重組cDNA分子的轉(zhuǎn)移和文庫的建立選用載體為質(zhì)粒，可直接轉(zhuǎn)化E.coli ;若為入載體，則需進(jìn)行體外包裝、感染等?；虻暮Y選方法1.遺傳互補(bǔ)法優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)便，快速，可靠，是首

27、選方法。獲得的基因一定是完整基因。缺點(diǎn)：適用范圍較窄。必備條件：外源基因不僅能在受體細(xì)胞表達(dá)，而且必須具備生物學(xué)活性。分離步驟 分離基因組文庫重組 DNA分子t轉(zhuǎn)化適當(dāng)宿主細(xì)胞 t涂布在選擇培養(yǎng)基上t隨機(jī)挑選 陽性克隆，分離重組DNA分子t再轉(zhuǎn)化相同受體細(xì)胞t高頻轉(zhuǎn)化子 t基因的進(jìn)一步證實(shí)和鑒定2. 核酸雜交法原理：利用核酸探針與待分離DNA的同源序列可進(jìn)行雜交的特點(diǎn)分離目的基因（同源序列不是完全相同序列） 優(yōu)點(diǎn)：不需要基因表達(dá) 必備條件：合適的核酸探針或有關(guān)資料，外源DNA能在宿主細(xì)胞中擴(kuò)增分離步驟：基因（基因組或cDNA）文庫t制備DNA樣品膜t與標(biāo)記探針雜交t雜交斑點(diǎn)（陽性克隆）t分離重組DNA分子 t 忙擁點(diǎn)雜交 H性戌降 Southern雜交以確認(rèn)雜交 結(jié)果 t DNA進(jìn)一步證實(shí)和鑒定：核酸序列分析，與蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)比較；分離插入片段 進(jìn)行基因表達(dá)，用免疫方法或其他方法檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物3. 免疫法原理：外源DNA引人宿主細(xì)胞后表達(dá)出蛋白質(zhì)，以此為抗原與相應(yīng)的抗體發(fā)生免疫反應(yīng)，然后利用二抗與一抗反應(yīng)，用二抗偶聯(lián)的酶反應(yīng)篩選目的DNA優(yōu)點(diǎn)：不依賴于基因表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)活性，只要抗原決定序列能被正確表達(dá)。分離步驟：基因文庫T蛋白質(zhì)樣品膜制備T免疫法