代謝組學研究進展

1、代謝物組學（metabonomics）一詞是英國倫敦大學帝同學院的Nicholson教授于1999年首次提出，指的是通過分析生物的體液、組織中的內源性代謝產物話（metabonome，代謝物組或代謝物圖譜）的變化來研究整體的生物學狀況和基因功能調節(jié)的現代生物醫(yī)學分支學科。與傳統的代謝研究相比，代謝物組學通過現代化學的儀器分析技術檢測機體整個代謝產物譜的變化，并通過多元統計分析方法研究整體的生物學功能狀況。代謝物組學與細胞代謝物組學（metabolomics）的區(qū)別是細胞代謝物組學研究單個細胞或一個相對獨立系統中的小分子成分因外界環(huán)境改變而發(fā)生的代謝變化，主要應用于植物生理和細胞學研究。其實早在

2、20世紀60年代，代謝物組學的核心技術核磁共振技術（NMR），就已經被應用到代謝研究中。但直到20世紀90年代，隨著模式識別分析技術的發(fā)展，代謝譜的定量分析才得以實現，并應用于藥物和基因功能的研究。利用代謝物組學研究藥物對整體的作用主要依賴于多參數檢測外源物質攻擊所導致的機體新陳代謝改變。這種方法也適合研究基因突變和轉基因所產生的代謝改變以及疾病診斷和療效評價。在藥物發(fā)現階段，它可以進行體內毒性研究、先導藥物的篩選和目標化合物的優(yōu)化及體內動物模型的藥效篩選。在藥物開發(fā)階段，它可以在臨床前安全性評價方面進行生物標志物的發(fā)現和毒性機制的研究，從而可有效地利用動物模型研究人類疾病的治療，發(fā)現與臨床安

3、全性和有效性有關的生物標志物。 1 研究的對象生物體液 許多生物體液都可以進行代謝物組學研究，包括唾液、血液、血漿、尿液、乳液、腦脊液、組織萃取液等。不同體液的器官分布及功能各不相同，因此包含的代謝產物成分也存在較大差異。每種體液都具有特異性的NMR指紋譜，其中可溶性物質的濃度和分子間的相互作用決定了峰譜的密度和分布。如血漿、腦脊液和尿液的代謝譜能夠反映某些藥物或某種發(fā)生在單一器官或多個器官的疾病所產生的代謝變化。NMR譜很適于體液的生化分析，因為其靈敏度高（檢測限達ng級），檢測速度快，樣品無需預處理，并且?guī)缀跛写x物都具有特有的1H NMR譜。利用特定的軟件可以很容易地把所有可溶性體液中

4、所存在的最大的障礙信號（水峰譜）除去而不影響結果分析。 藥物毒性篩選和臨床診斷中對體液的要求首先是量足、易得，且對機體不會產生損傷，這樣尿液和血漿都適合代謝物組學研究。利用血漿進行代謝物組學研究的樣品和常現生化分析以及藥動學研究是一致的，而尿液在代謝物組學的研究中有其自身的優(yōu)點。首先，如果不處死動物，通過靜脈血管采集血液將對動物產生損傷和一定程度的應激，影響結果。更為關注的是血液采集的時間和頻率的限制，大大影響了血漿大規(guī)模的使用；而尿液就不存在以上問題，通過代謝籠可以定時、隨時收集尿液，并不會對動物產生任何影響。尿液一維1HNMR譜圖（600MHz或更大）由成千上萬條線組成，其中包含了數千種代

5、謝物。尿液的1HNMR譜主要由低分子物質組成，因為NMR主要測定的是相對分子質量低于20×104的小分子物質。而血漿中含有大量的高分子物質，像蛋白質和脂蛋白將會產生較寬的信號峰，小分子物質的信號也有可能整合到大分子的信號峰上。這樣血漿樣品必須經過除蛋白處理，或通過自旋回波（Spinecho）處理以降低由于蛋白質或其他大分子產生的寬信號峰對實驗結果的影響，而這樣的處理也會對分析結果產生一定的影響。因此，代謝物組學研究中最常用的體液為尿液。在收集時應該使尿液保持低溫，并要添加一定量的防腐劑（一般選用疊氮鈉，因為在NMR分析中疊氮鈉不會產生有影響的信號）。 2 研究的核心核磁共振技術 早在

6、20世紀60年代，NMR就已經應用到代謝研究中，但當時質子工作頻率低（小于300MHz），能分析的內源性代謝產物較少；隨著質子工作頻率和測量靈敏度的提高（大于400MHz）以及模式識別技術的發(fā)展，NMR技術可分析測定更多的小分子物質，并發(fā)展成為代謝物組學研究的核心技術。對于疾病、毒性反應、基因突變等病理過程引起的復雜的代謝成分改變，NMR無疑是一種非常好的技術手段。首先，NMR是物質分子結構研究中的重要剖析工具，H，F等原子的原子核如同小磁體，當置于外界磁場中時，即按磁場方向取向。NMR譜就是以測定改變這種取向所需要的射頻能為基礎。其中最常用的是1HNMR，它能反映有機分子結構中處于不同位置的

7、H原子的信息。在外加磁場的作用下，分子中多個H原子所處的電子環(huán)境也完全不同，其共振頻率也不相同，因此，其原子就會有不同的化學位移。相反，在不同的分子中，處于相同電子環(huán)境的質子（也稱等性質子）都有大致相同的化學位移。通過辨析各種質子的吸收峰并根據各自的化學位移，就可初步推斷其分子結構。其次，魔角自旋核磁共振技術magic angle spinning（MASNMR）可用于研究完整組織和細胞的代謝變化，實驗后的樣品還可以被用于別的試驗研究。除NMR外，質譜（MS）、氣質聯用技術（GC/MS）、高效液相色譜（HPLC）和其他光譜分析技術都曾應用于代謝物組學研究。 從生物分析角度上看，MS和NMR都是

8、進行代謝物組學研究比較好的工具。但在鑒定完整的生物材料上，因為NMR對生物材料沒有任何損傷性，在復雜混合樣品分析時可以得到更豐富的生物學信息，所以被廣泛應用。與NMR相比，MS技術更加靈敏，但其產生的離子化抑制比較難消除，導致模式定量分析比較困難，并且試驗前樣品還需要進行萃取和衍生化處理。因為代謝物組研究中測定方法的發(fā)展方向最終將要實現大規(guī)模的樣品處理和數據的自動化分析，所以，一般選用比較方便的NMR技術，尤其是在藥物毒理和臨床研究中。最近研究表明，基于NMR技術的代謝物組學能夠在哺乳動物上區(qū)分出由于基因的突變而引起代謝表型的改變，鑒定出由于基因和環(huán)境因素作用而產生的特定的代謝型（metabo

9、types）。代謝物組學技術也可以鑒定出動物突變體和疾病狀態(tài)下人的一些異常的代謝變化。Griffin等利用基于NMR的代謝物組學技術研究了在基因突變情況下動物的代謝表型。Moolenaar等利用基于NMR的代謝物組學技術檢測尿液，研究疾病狀態(tài)下人的代謝表型。3 研究的支柱模式識別技術 生物體液NMR譜圖的復雜性是妨礙得到有用的生物學信息的限制因素，因為即使是一張一維1H NMR譜圖就可能含有幾千條可分辨的譜線，從中得到可以區(qū)分不同代謝狀態(tài)的信息是代謝物組研究的關鍵。顯然這幾千條譜線不可能都作為參數研究，所以代謝物組研究所要做的分析方法主要是數據降維。因為對于含有n個參量的模式矢量，每個關量是n

10、維空間中的一個點。如n=2或3，則可直接用圖形顯示這些模式矢量，人眼也可以直接對其進行區(qū)分判別。但n3時，這種直接顯示顯然是不可能的，這就涉及到數據降維的問題。如何將 n維空間的圖景在2維或3維空間顯示出來，并盡可能減少原n維空間中分類信息的丟失，是數據降維處理的核心所在。 數據降維的分析方法很多，大致可分為有監(jiān)督的（supervised）模式識別方法和無監(jiān)督的（unsupervised）的模式識別方法。屬于有監(jiān)督的模式識別方法有SIMCA（Soft Independent Modeling of Class Analogy），PLS（Partial Least Squares）和PLS-DA

11、 （PLS-Discriminant Analysis）方法等。無監(jiān)督的模式識別方法有PCA（Principal Component Analysis）法、非線性作圖（Nonlinear Mapping，NLM）和分層聚類分析（Hierarchical Cluster Analysis，HCA）等。通過數據降維模式識別分析方法的一般過程是首先對數據進行無監(jiān)督的模式分析，然后選定某一類樣本進行數據建模，再對變量進行加權處理，選定主成分建模的主成分數目，最后利用有監(jiān)督性統計的方法判別未知樣本。 目前，最常用的模式識別方法是PCA法。PCA 是一種將分散在一組變量上的信息集中到某幾個綜合指標（主成分

12、，PC）上的探索性統計分析方法，利用PC描述數據集內部結構，實際上也起著數據降維的作用。PC是由原始變量按一定的權重經線性組合而成的新變量。這些新變量具有以下性質： 每個PC之間都是正交的。第1個PC包含了數據集的絕大部分方差，第2個次之，依此類推。這樣，由頭2個PC作圖，就能夠很好地代表數據集所包含的生物學變化。這樣的PC圖能夠直觀地描述藥物作用到器官之后，根據其作用機制而表現內在的集束行為，每個樣本在PC圖上的位置完全由它的代謝反應所決定。這樣根據PC圖中所得到的發(fā)生改變的譜峰的位置，經過一定生物信息學分析得到發(fā)生改變的物質，從而可以了解發(fā)生毒性作用的機制。 基于NMR的代謝物組研究分析方

13、法的基本步驟是：首先測定一系列NMR譜圖，不用對譜峰進行指認，把譜看作是一個n維對象，直接將譜圖分解成 2501000個區(qū)域進行積分，得到積分強度；然后將這些簡化的數據輸入程序，利用PCA等方法進行分析，得到PC圖。處于相似生理狀態(tài)的樣本通常具有相似的組分，因此在PC圖中處于相鄰位置。通過生物信息學分析可以得到不同狀態(tài)下的生物標志物，然后再根據這些生物標志物進行機制或篩選研究。 4 研究的應用 4.1 在藥物毒理研究中的應用 通常情況下，藥物通過與遺傳物質直接作用而產生毒性，或通過誘導系統合成與藥物代謝有關的酶，從而產生有毒的產物。在這種情況下，用基因組和蛋白質組學方法來評價毒性是有用的。然而

14、，生物異源物質有可能只在藥理學水平上產生作用，因而可能不會影響基因的調節(jié)和表達。再者，某些毒理學效應可能與基因的改變和蛋白質的合成完全不相關。因此，在許多情況下，從基因組和蛋白質組角度考慮到的反應并不能預測藥物毒性。然而，藥物引起的生理紊亂都會產生直接的生化反應，或通過與控制代謝的酶相結合而引起內源性生化物質在比例、濃度、代謝通量等方面的改變。如果這種變化足夠大的話，就會影響整個生物體的功能。生物體液中的代謝物與細胞和組織中的代謝物處于動態(tài)平衡。因此，生物體中由于中毒或代謝損害而引起的細胞功能異常一定會反映在生物體液成分的變化上。這樣通過檢測血漿、尿液、膽汁等生物體液中的一些具有特殊意義的微量

15、物質，經過合適的分析方法就能區(qū)分出不同的代謝狀態(tài)，從而也能根據不同的代謝表型區(qū)分出不同的藥物作用。Anthony等利用NMR技術通過測定尿中代謝成分的變化研究不同腎毒性藥物的作用機制。 在藥物毒理研究中，由1HNMR譜檢測到的生物體液中的內源性代謝物模式完全依賴于藥物毒性的類型。每一種類型的藥物都會在生物體液中產生特征的內源代謝物濃度和模式變化，這種特征給我們提供了藥物毒性作用機制和毒性靶器官?？梢岳么x物組學進行毒性標志物研究、毒理機制研究和藥物毒性篩選。 因為尿液的收集不會對機體造成任何損傷，故通過測定尿液的代謝物組研究很適合藥物的篩選。進行藥物篩選需要滿足3個方面的信息：首先，要能夠鑒

16、定出單個或對照組的實驗動物是否為正常狀態(tài)；其次，通過模式識別分析與對照組和模型藥物產生的代謝譜相比較，能夠鑒定出受試化合物的“毒性狀態(tài)”；最后通過分析鑒定出毒性作用的生物標志物。很明顯，NMR技術能夠在復雜的混合物中檢測出小分子物質。因此，可以利用代謝物組學技術進行毒性標志物研究。Holmes等利用代謝物組學研究腎小管S3段損傷性化合物HgCl2和HCBD，結果隨腎小管S3段損傷的加劇，尿中葡萄糖、乳酸、羥丁酸鹽、馬尿酸鹽、肌酐和酮戊二酸顯著升高，表明尿中這些物質可以作為腎小管S3段損傷性藥物的生物標志物。硝酸雙氧鈾引起腎毒性的標志物為尿中高濃度的羥丁酸。 國際知名的制藥公司輝瑞、羅氏、諾和諾

17、德、百時美施貴寶以及禮來于2003年在英國倫敦大學的帝國學院成立了毒理代謝物組學國際研究協作組（The Consortium on Metabonomic Toxicology，COMET）。建立該協作組的目的是為在藥物發(fā)現階段應用代謝物組學對藥物進行毒性篩選，從而有效地降低藥物的不良反應，以提高研發(fā)成功率。 4.2 在基因功能研究中的應用 利用代謝物組技術檢測生物體液，根據其代謝表型可以把不同類動物（像大小鼠）區(qū)分開。動物種類不同，沉默基因（silent gene）所表現的功能就不同，從而影響了代謝過程，以致產生了不同的代謝表型。這樣的研究結果也許可以解釋藥物在不同種類動物中毒性的差異，由于

18、代謝產物和受體數量的不同，而造成內源代謝途徑活性的差異，從而引起藥物在動物體內產生的毒性不同。這也說明了利用代謝物組技術可以研究轉基因動物和動物突變體代謝的表型，進而可以研究基因的功能作用。Griffin等的研究表明，通過肝細胞轉染破壞宿主細胞膜可以引起明顯的代謝變化，這種干涉過程對細胞系統或機體本身所產生的作用也許引起一部分或一類基因的功能發(fā)生改變。結果表明可以應用代謝成分的改變研究基因的功能。Lonie等利用代謝成分的改變研究沉默基因突變所導致表型發(fā)生改變，結果表明代謝物組是研究基因功能的一個很好的途徑，因為機體在同種狀態(tài)下的基因和蛋白質數量要比代謝成分的數量多許多。代謝物組學還可以應用在疾病的診斷、發(fā)生過程的研究、植物代謝等方面。 5 結語 總之，代謝物組學已經作為一種獨立的技術被廣泛應用于藥物的毒性研究和基因功能研究中，還被幾家制藥公司納入其藥物研發(fā)方案中。許多生物化學、藥物毒理學和臨床化學的問題都可以用基于高分辨1HNMR的整體代謝物組學來加以闡述。從生物體液1HNMR譜圖可以得到大量的代謝物數據，并由此確定毒性的靶器官，推導出毒性的作用機制，損傷發(fā)生、發(fā)展和消失過程中的生物標記物。代謝物組學還能提供生物體的代謝指紋圖譜（“代謝型”），因而可以應用于藥物臨床研究的設計、疾病的終點、疾病發(fā)生機制等研究。但代謝物組學