細(xì)胞免疫熒光步驟

1、1. 首先需要把細(xì)胞養(yǎng)在玻璃片上（懸浮細(xì)胞需要用多聚賴氨酸包被過的玻璃片）2. 然后在 4PFA里面室溫下固定 30 分鐘， PBS洗兩次， % TX-100 室溫下作用 12 分鐘使 細(xì)胞膜通透。3. 接下來進(jìn)行熒光標(biāo)記， 需要在一個(gè)大的容器 （面積大， 扁平狀的， 比如大的培養(yǎng)皿） 里面， 放一張用水打濕的濾紙，以保持濕度。4. 剪一片合適大小的 parafilm ，在上面滴上稀釋在 1 BSA/TBS中的一抗（稀釋倍數(shù)依具體 抗體而定），每個(gè)玻璃片 30ul 足夠，把玻璃片蓋在上面（細(xì)胞面朝下），室溫下孵育 30 分鐘，然后在 PBS里洗三次。5. 接下來二抗孵育步驟同上。6. 最后，在

2、載玻片加上 mounting medium（大約每個(gè)玻璃片加 10ul ），把玻璃片放上去（細(xì) 胞面朝下）， 37 度 30 分鐘，然后就可以在熒光顯微鏡下觀察了。7. 抗體很重要，不能有非特異性結(jié)合。你可以先做WB檢測一下你的抗體，看看有沒有雜帶。8. 雙標(biāo)的話， 可以把兩個(gè)一抗一起加或者分別標(biāo)記兩次 （可以都試一下看看那種方法合適） 。 如果一個(gè)抗體需要二抗， 一個(gè)是直接熒光標(biāo)記的， 可以把熒光標(biāo)記的那個(gè)和另外一個(gè)的二 抗一起加。方法二：1. 選取一抗時(shí)要來源于兩種不同的動物，我用的是來源于 rabbit 和 rat 的抗體，二抗則是 不同熒光信號標(biāo)記 的 ，我 用的是 donkey an

3、ti-rabbit-FITC （綠）和 donkey anti-rat-Tex-Red （紅）。2. 我的做法是兩種一抗同時(shí)孵育， 然后兩種二抗同時(shí)孵育。 抗體濃度、 孵育時(shí)間要仔細(xì)摸索， 我感覺一抗 4 度孵育過 夜比較好，背景比較清晰。3. 我的陽性對照用的是陽性組織切片，陰性對照則分別是家兔和大鼠的 IgG ，熒光標(biāo)記物對 照是 PBS+熒光標(biāo)記物。4. 封閉血清與二抗來源動物一致，我用的是10%的正常 donkey 血清。5. 其余步驟同一般免疫熒光單標(biāo)操作。方法三：1. 片子的制作：可以做細(xì)胞爬片，細(xì)胞甩片，還有直接在 24well/12well/96well 中直接 染色2. 細(xì)胞

4、爬片的制作：直接購買公司的已經(jīng)處理過的細(xì)胞爬片，要是自己制作的話，就用無 菌的蓋玻片用多聚賴氨酸處理后讓細(xì)胞自己爬片3. 細(xì)胞甩片：需要甩片機(jī)將細(xì)胞懸液均勻甩到玻片上。4. 其實(shí)小的 well 的話，可以直接拿來染色，沒問題的。5. 固定：用 PBS 洗去培養(yǎng)液，用固定液(如甲醇和丙酮；4%多聚甲醛；酒精。 。)固定細(xì)胞。6. 內(nèi)源性過氧化物酶處理， 3%過氧化氫處理細(xì)胞(選作，二抗連HRP得必做，其他的如做免疫熒光染色不用做) 。7. 通透(胞漿蛋白和細(xì)胞核蛋白需要做；細(xì)胞膜蛋白不需要做) ，一般選用 Triton-X100 來做細(xì)胞通透，濃度和時(shí)間需要摸索，一般是%，處理時(shí)間為 1-30

5、分鐘，級個(gè)別需要到1-2 小時(shí)。8. 封閉：洗去通透液，用二抗同源的血清約10%的濃度 in PBS中封閉半小時(shí)，也可以選用5-10%脫脂奶粉。封閉結(jié)束后千萬不要洗，直接上一抗。9. 一抗：具體你想做什么樣的蛋白，咨詢抗體公司如 santa cruze,Abcam,sigma 。選取具體的抗體， 但是一抗的稀釋濃度也是要摸索， 抗體稀釋液可以購買抗體公司現(xiàn)成的， 對于新手還是挺好的。時(shí)間一般是 4 度過夜或者 37 度 1 小時(shí)。一抗最好還是選用外國 抗體公司的抗體。10. 洗去一抗。11. 上二抗，二抗一般抗體公司會給你推薦的，你在其中選上一個(gè)就行了，自己選國產(chǎn)的也 行，就是選在哪個(gè)動物體內(nèi)

6、做的一抗，二抗就選抗那個(gè)動物的就行了。二抗的濃度也是 需要摸索的，抗體稀釋液和一抗相同就行了。二抗的時(shí)間一般是 37 度半小時(shí)。12. 底物顯色(選作，二抗連得是酶的必做，按試劑盒的說明書添加就行了，顯色時(shí)間可能 需要摸索，以免顯色過度引起假陽性；二抗連得是熒光報(bào)告的不用做)13. 洗去二抗，染核14. DAPI 或者 Hoechst 染核15. 洗去染核液，加 PBS，上鏡觀察。方法四：(1) 細(xì)胞準(zhǔn)備。對單層生長細(xì)胞，在傳代培養(yǎng)時(shí)，將細(xì)胞接種到預(yù)先放置有處理過的蓋玻片的 培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞接近長成單層后取出蓋玻片， PBS洗兩次；對懸浮生長細(xì)胞，取對數(shù)生 長細(xì)胞， 用 PBS離心洗滌 (10

7、00rpm ，5min)2 次，用細(xì)胞離心甩片機(jī)制備細(xì)胞片或直接制備 細(xì)胞涂片。(2) 固定。 根據(jù)需要選擇適當(dāng)?shù)墓潭▌┕潭?xì)胞。 固定完畢后的細(xì)胞可置于含疊氮納的 PBS中 4保存 3 個(gè)月。 PBS洗滌 3×5 min 。(3) 通透。使用交聯(lián)劑 ( 如多聚甲醛 ) 固定后的細(xì)胞，一般需要在加入抗體孵育前，對細(xì)胞進(jìn)行 通透處理，以保證抗體能夠到達(dá)抗原部位。選擇通透劑應(yīng)充分考慮抗原蛋白的性質(zhì)。通透 的時(shí)間一般在 5-15min 。通透后用 PBS洗滌 3×5 min 。(4) 封閉。使用封閉液對細(xì)胞進(jìn)行封閉，時(shí)間一般為 30min。（5）一抗結(jié)合。室溫孵育 1h或者 4過

8、夜。 PBST漂洗 3 次，每次沖洗 5min。（6）二抗結(jié)合。 間接免疫熒光需要使用二抗。 室溫避光孵育 1h。PBST漂洗 3 次，每次沖洗 5min 后，再用蒸餾水漂洗一次。（7）封片及檢測。滴加封片劑一滴，封片，熒光顯微鏡檢查。方法五：1 漂洗血清蛋白， 37 度 PBS 2 小時(shí).2 -20 度甲醇固定 20 分鐘后，自然、干燥 10 分鐘3 PBS洗凈： 3min 34 1%Triton ： 25min-30min. 配成 50ultriton+5mlpBS5 PBS洗凈： 2 5min6 羊血清封閉： 37 度， 20分鐘7一抗， 4度過夜，一般要大于 18小時(shí)或者 37度1-2

9、 小時(shí)8 4 度 PBS 洗凈， min 5 次9 二抗 37 度小于一小時(shí)10 37 度 PBS洗凈， 3 3min11 涼干封片（封閉液）細(xì)胞免疫熒光步驟：1. 細(xì)胞爬片； 首先是玻片的處理， 普通的蓋玻片用砂輪劃成自己要的大小的小方塊， 先用洗 衣粉洗干凈， 用水沖靜烤干， 然后泡酸過夜， 撈酸后流水洗凈， 烤干， 置于器皿中高壓滅菌， 然后再烤箱中大約 8 小時(shí)烤干備用。爬片可以在培養(yǎng)皿 六孔板或 24 孔板中都可， 我選擇在培養(yǎng)皿中爬。 一為節(jié)約經(jīng)費(fèi) （培養(yǎng)皿可以重復(fù)利用） 二來覺得培養(yǎng)皿口大，操作比較方便。培養(yǎng)皿消毒同上，消毒時(shí)記得消兩把鑷子具體操作是：用胰酶消化好細(xì)胞，充分吹打，

10、使之成單細(xì)胞懸液（注意：這一點(diǎn)很重要，關(guān)系到將來爬出來片子的質(zhì)量），將玻片小心放入取出消毒的培養(yǎng)皿，可以先加少量培養(yǎng)基（以使玻片與培養(yǎng)皿緊密接觸）37 度 5 CO2擺放其中，然后將單細(xì)胞懸液一滴一滴的滴到玻片上。最后蓋上培養(yǎng)皿置于的暖箱中培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞生長狀況，24 小時(shí)或更長時(shí)間適時(shí)取出爬片。爬片置于 37 度 PBS中洗三次，每次 3到 5秒鐘，然后在 4多聚甲醛中固定 15 分鐘，然后 再用 37 度去離子水將甲醛沖干凈，注意手法輕柔，要不然掉片很厲害。同時(shí)操作過程中注 意玻片的正反面，要不然真的是前功盡棄。將做好的爬片置于濾紙上晾干， 然后用中性樹膠粘在載玻片上。 注意一定要等中性樹

11、膠徹底 干了之后才能做后續(xù)實(shí)驗(yàn)，要不然玻片會掉下來的，就又是前功盡棄了 做好的細(xì)胞爬片可 以放在 20 保存?zhèn)溆茫唧w能保存多長時(shí)間不太清楚，當(dāng)然盡量早用。%多聚甲醛固定 10min（ 固定細(xì)胞器用預(yù)冷的 70%甲醇+30%丙酮 ）；漂洗 5min；Triton 穿孔 15min（ 丙酮固定法不用透化處理 ）；漂洗 2 次，每次 5min；%BSA封閉 30min ；7. 加入 1%BSA稀釋的一抗，于 37雜交 2h；漂洗 2 次，每次 5min；9. 加入 1%BSA稀釋的二抗，于 37雜交 1h；漂洗 2 次，每次 5min；ml DAPI 染色 2min ；12. 抗淬滅封片劑封片?？勾銣绶馄瑒?: % DABCO (w/v) 50mM Tris 90%甘油細(xì)胞免疫熒光細(xì)胞爬片4%多聚甲醛固定 10min（ 固定細(xì)胞器用預(yù)冷的 70%甲醇 +30%丙酮 ）PBS漂洗 5min% Triton 穿孔 15min（ 丙酮固定法不用透化處理 ）PBS漂洗 2 次，每次 5min1%BSA封閉 30min加