論文正文百脈根

1、1前言土壤鹽堿化是人類面臨的一個世界性問題，開發(fā)和有效利用鹽漬化和具有重要的現(xiàn)實意義。提高植物的耐鹽是開發(fā)和利用大量鹽漬化土地最有效的方法之一，也是未來農(nóng)業(yè)發(fā)展的重大課題之一。采用傳統(tǒng)的方法選育耐鹽的植物品種固然簡便可行，但進(jìn)展緩慢，局限性大。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，一大批與植物耐鹽有關(guān)的基因相繼得到克隆，植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)有了重大突破，這為有效利用鹽堿地提高作物產(chǎn)量，治理鹽漬化土地提供了新的思路和方法。百脈根(Lotus corniculatus L)是豆科百脈根屬多年生牧草，又名牛角花、五葉草，蝶形花科多年生草本植物，產(chǎn)于歐亞溫暖地區(qū)，目前在世界各地廣泛種植，我國華東、華中、西南及西北均有分

2、布1。該牧草營養(yǎng)豐富，耐寒、抗旱、耐澇、蟲害少，花量大、自交結(jié)實、種子結(jié)實率高，較易得到穩(wěn)定遺傳的后代；其細(xì)胞再生性在豆科牧草中是最好的，遺傳轉(zhuǎn)化效率相對較高，且轉(zhuǎn)基因植株生長速度快。因此，百脈根是研究外源基因轉(zhuǎn)化、生物固氮機(jī)理、牧草品質(zhì)改良的豆科模式植物。盡管有許多優(yōu)點，但其大多數(shù)百脈根栽培品種苗期生長緩慢、抗逆性差，這給產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)帶來許多不便。因此，在常規(guī)育種的基礎(chǔ)上，利用生物技術(shù)對其加以遺傳改良，以培育出優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)的新品種，對改良和利用我國大面積的鹽堿地和荒漠化土地具有重要意義。液泡膜H+-PPase（V-H+-PPase）是分布于大多數(shù)陸生植物細(xì)胞中的一種獨特的酸化液泡的質(zhì)子泵2。H+

3、-PPase是植物液泡膜上普遍而豐富的成分,液泡膜H+轉(zhuǎn)運無機(jī)焦磷酸酶（H+-PPase）的主要功能有（1）具有質(zhì)子泵的功能。（2）能夠參與蔗糖的生物合成。（3）控制植物生長素的運輸。（4）在植物的抗鹽脅迫中發(fā)揮重要作用 3。孫艷香等人采用EST電子克隆和RACE技術(shù)從豆科模式植物百脈根中克隆到一個液泡膜H+-PPase基因的cDNA，命名為LcVP1。該cDNA長為2962bp，含2304bp的完整開放閱讀框，編碼767個氨基酸，其推測的氨基酸序列與綠豆、擬南芥等I類液泡膜H+-PPase的氨基酸序列同源性在80以上，且有很高的功能區(qū)段保守性4 。不同的V-H+-PPase異構(gòu)體在不同組織和

4、器官中特異性表達(dá)，這樣可以產(chǎn)生大量的V-H+-PPase?？梢?，植物不同器官組織V-H+-PPase含量受到有效調(diào)節(jié)，有利于提高適應(yīng)脅迫的能力。已有將LcVP1的同源基因AVP1的超表達(dá)提高了轉(zhuǎn)基因百脈根的耐鹽性 5，但至今還沒有將LcVP1基因轉(zhuǎn)入百脈根中改變植株V-H+-PPase活性以提高其耐鹽性的相關(guān)報道。本研究的目的就是將LcVP1基因轉(zhuǎn)入百脈根獲得的轉(zhuǎn)基因植株，其PCR檢測呈陽性，對植株鹽脅迫處理后，測定其耐鹽性。2材料與方法2.1 材料以野生型和經(jīng)PCR檢測陽性轉(zhuǎn)LcVP1基因百脈根為實驗材料2.2 方法首先對崔紅敏師姐得到的4株轉(zhuǎn)LcVP1基因百脈根進(jìn)行了擴(kuò)繁，將百脈根切斷后放

5、入分化培養(yǎng)基中促進(jìn)其長出叢生苗以達(dá)到擴(kuò)繁增加實驗材料的目的。然后進(jìn)行后續(xù)實驗。鹽脅迫處理分別取野生型和轉(zhuǎn)基因型的1 cm莖尖轉(zhuǎn)入生根MS無激素培養(yǎng)基。培養(yǎng)基設(shè)三個鹽濃度分別為0 mmol/L、50 mmol/L、100 mmol/L，每個組合做3個重復(fù)。在鹽脅迫期間測定相關(guān)指標(biāo)。2.2.2指標(biāo)測定2.2.2.1地上部分干重在每個處理下，分別取野生型植株和轉(zhuǎn)基因的地上部分，在80 下烘干48 h，稱重。2.2.2.2 葉片相對含水量的測定葉片相對含水量（RWC）的測定采用飽和稱重法，取百脈根葉片，用無菌水沖洗后，濾紙吸干表面水分，測定鮮重（FW），然后在4的無菌水中浸泡過夜，取出用濾紙吸干表面水

6、分，稱出飽和重（TW）,最后轉(zhuǎn)到80烘干至衡重，稱得干重（DW），葉片相對含水量=（FW-DW）/(TW-DW)100%2.2.2.3MDA含量的測定2.2.2.3.1 MDA含量測定的原理丙二醛(MDA)是常用的膜脂過氧化指標(biāo)，在酸性和高溫度條件下，可以與硫代巴比妥酸(TBA)反應(yīng)生成紅棕色的三甲川(3，5，5-三甲基惡唑-2，4-二酮)，其最大吸收波長在532 nm。但是測定植物組織中MDA時受多種物質(zhì)的干擾，其中最主要的是可溶性糖，糖與TBA顯色反應(yīng)產(chǎn)物的最大吸收波長在450 nm，但532 nm處也有吸收。植物遭受干旱、高溫、低溫等逆境脅迫時可溶性糖增加，因此測定植物組織中MDATBA

7、反應(yīng)物質(zhì)含量時一定要排除可溶性糖的干擾。低濃度的鐵離子能夠顯著增加TBA與蔗糖或MDA顯色反應(yīng)物在532 nm、450nm處的吸光度值，所以在蔗糖、MDA與TBA顯色反應(yīng)中需一定量的鐵離子，通常植物組織中鐵離子的含量為每克干重100300gg1，根據(jù)植物樣品量和提取液的體積，加入Fe3的終濃度為0.5 molL-1。（1）直線回歸法 MDA與TBA顯色反應(yīng)產(chǎn)物在450 nm波長下的吸光度值為零。不同濃度的蔗糖(025 mmolL1)與TBA顯色反應(yīng)產(chǎn)物在450 nm的吸光度值與532 nm和600 nm處的吸光度值之差成正相關(guān)，配制一系列濃度的蔗糖與TBA顯色反應(yīng)后，測定上述三個波長的吸光度值

8、，求其直線方程，可計算糖分在532 nm處的吸光度值。UV-120型紫外可見分光光度計的直線方程為：Y532-0.001980.088D450（2）雙組分分光光度計法 據(jù)朗伯一比爾定律：DkCL，當(dāng)液層厚度為1 cm時，kDC，k稱為該物質(zhì)的比吸收系數(shù)。當(dāng)某一溶液中有數(shù)種吸光物質(zhì)時，某一波長下的吸光度值等于此混合液在該波長下各顯色物質(zhì)的吸光度值之和。已知蔗糖與TBA顯色反應(yīng)產(chǎn)物在450nm和532nm波長下的比吸收系數(shù)分別為85.40和7.40。MDA在450nm波長下無吸收，故該波長的比吸收系數(shù)為0，532nm波長下的比吸收系數(shù)為155，根據(jù)雙組分分光度計法建立方程組，求解方程得計算公式：C

9、111.71D450 C26.45（D532D600）0.56D450 C1：可溶性糖的濃度(mmolL1)； C2：MDA的濃度(molL1)； D450、D532、D600分別代表450、532和600 nm波長下的吸光度值。2.2.2.3.2主要儀器設(shè)備 752紫外可見分光光度計；離心機(jī)；電子天平（0.0001）；研缽；2.2.2.3.3實驗試劑10三氯乙酸(TCA)；0.6硫代巴比妥酸：先加少量的氫氧化鈉(1 molL1)溶解，再用10的三氯乙酸定容；石英砂。2.2.2.3.4 實驗過程取各種處理的葉片0.5 g放入研缽中，加入少許石英砂和2 ml 10%的三氯乙酸（TCA）研成勻漿，

10、將勻漿轉(zhuǎn)移到試管中，再用3 ml 10%的三氯乙酸分兩次沖洗研缽，合并勻漿，在提取液中加入5 ml 0.6%的硫代巴比妥酸溶液，搖勻，然后將試管放入沸水中煮沸10 min（自試管中出現(xiàn)小氣泡開始記時），到時間后立即將試管放入冷水浴中，待試管冷卻后，過濾，量其體積，以0.3%的硫代巴比妥酸溶液為空白，用紫外分光光度計測450 nm，532 nm和600 nm處的吸光度值。2.2.2.3.5 結(jié)果計算按公式可直接求得植物樣品提取液中MDA的濃度。用雙組分分光光度法求得MDA的濃度，根據(jù)植物組織的重量計算測定樣品中MDA的含量：MDA含量(mol g-1)=MDA濃度(molL-1)提取液體積(ml

11、)植物組織鮮重(g) 3結(jié)果與分析3.1 LcVP1轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性高于野生植株由圖片（見附錄一）可知在沒有經(jīng)過NaCl脅迫生根培養(yǎng)基上的野生型(WT)和轉(zhuǎn)基因型(LcVP1)植株在形態(tài)上沒有區(qū)別，但是在不同濃度的鹽脅迫下，轉(zhuǎn)基因植株綠色粗壯，而野生型植株葉黃細(xì)高。表明轉(zhuǎn)因植株教野生型植株具有較高的耐鹽性。3.2 LcVP1轉(zhuǎn)基因植株的葉片相對含水量高于野生型植株葉片相對含水量的變化能反映出植株耐鹽性和抗旱性的強弱，變化較大的植株耐鹽性和抗旱性較弱，反之則較強。由圖1可以看出，在鹽脅迫期間，野生植株和轉(zhuǎn)基因植株的葉片相對含水量都呈下降趨勢，但轉(zhuǎn)基因植株葉片相對含水量的變化幅度小于野生型植株，

12、且葉片相對含水量在高鹽濃度脅迫下高于野生型。例如，在100 mmolL NaCl下，野生植株的葉片相對含水量下降了53，而轉(zhuǎn)基因植株僅下降了45；這說明，轉(zhuǎn)基因植株在受到鹽脅迫時具有較強的保水能力。圖1 NaCl脅迫下對野生型和轉(zhuǎn)基因型百脈根葉片相對含水量3.3LcVP1轉(zhuǎn)基因植株的地上部分干重下降趨勢高于野生型植株地上部分干重是顯示植物生長狀況的指標(biāo)之一，由圖2 可知在鹽脅迫期間，野生植株和轉(zhuǎn)基因植株的葉片相對含水量都呈下降趨勢，但轉(zhuǎn)基因植株葉片相對含水量的變化幅度小于野生型植株，且葉片相對含水量在高鹽濃度脅迫下高于野生型。在100 mmolL NaCl下，野生植株的地上部干重下降了40，而

13、轉(zhuǎn)基因植株的地上部干重僅下降了33。這表明轉(zhuǎn)基因植株在鹽脅迫和干旱脅迫下的生長狀況要明顯好于野生植株。圖2 NaCl脅迫對野生型和轉(zhuǎn)基因型百脈根地上部干重的影響3.4 LcVP1轉(zhuǎn)基因植株的細(xì)胞膜穩(wěn)定性高于野生型植株一般說來，耐鹽植株和抗旱植株細(xì)胞膜系統(tǒng)在鹽脅迫和干旱脅迫后受損程度較小，且主要表現(xiàn)在MDA含量較低，細(xì)胞膜透性較小，反之，細(xì)胞膜受損程度嚴(yán)重。在受到鹽脅迫后，野生植株和轉(zhuǎn)基因植株的MDA含量會有所增加，由圖3中數(shù)據(jù)可知，轉(zhuǎn)基因植株的增加幅度較野生植株平緩，且值低于野生型。在100 mmolL NaCl脅迫的處理下，轉(zhuǎn)基因植株的MDA含量增加2.3倍，而野生型植株的MDA含量增加了2

14、.5倍，表明轉(zhuǎn)基因植株細(xì)胞膜受損程度輕，其耐鹽性較野生型強。圖3 NaCl脅迫對野生型和轉(zhuǎn)基因型百脈根MDA含量的影響4 討論高鹽會對植物造成離子脅迫和滲透脅迫，嚴(yán)重影響了植物正常的生理生化反應(yīng)，導(dǎo)致植株生長緩慢甚至死亡，然而許多植物在長期鹽漬環(huán)境中會進(jìn)化出一系列機(jī)制對外界高鹽脅迫，在鹽漬生境中正常生長。植物器官衰老或在逆境下遭受傷害時，往往發(fā)生膜脂過氧化作用。膜脂過氧化作用的產(chǎn)物比較復(fù)雜，包括一些醛類、烴類等。其產(chǎn)物之一丙二醛(MDA) 從膜上產(chǎn)生的位置釋放出后，可以與蛋白質(zhì)、核酸反應(yīng)，改變這些大分子的構(gòu)型，或使之產(chǎn)生交聯(lián)反應(yīng)，從而喪失功能，還可使纖維素分子間的橋鍵松馳，或抑制蛋白質(zhì)的合成。

15、因此，研究中常以MDA含量來反映植物膜脂過氧化的水平和對細(xì)胞膜的傷害程度。 轉(zhuǎn)基因植株不僅要進(jìn)行分子檢測以確定其表型性狀，如耐鹽、抗旱、抗病、抗蟲。本研究發(fā)現(xiàn)，與野生型植株相比，轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性有所提高；隨著鹽脅迫濃度的增加，轉(zhuǎn)基因植株的MDA含量的增加較野生植株的增加平緩，葉片相對含水量的下降較野生植株的下降平緩。轉(zhuǎn)基因植株的這些優(yōu)越性是因為H+-PPase的過量表達(dá)，使液泡中積累Na+增加，維持了細(xì)胞離子平衡，特別是K+和Na+的平衡，并提高了液泡的滲透能力。目前有關(guān)液泡膜V-H+-PPase對鹽脅迫的響應(yīng)有以下兩種看法：一是Na+對V-H+-PPase有抑制作用，NaCl脅迫下的V-H

16、+-PPase活性下降。Matsumoto等報道，經(jīng)200mmol/LNaCl處理的大麥根V-H+-PPase活性是對照的50，類似現(xiàn)象也在400mmolL NaCl處理的冰葉日中花(Mesembryanthemum crystallinum)、100 mmolLNaCl處理的綠豆中觀察到6。外源Ca2+緩解NaCl對V-H+-PPase的抑制，5mmolL外源Ca2+使100mmolL NaCl脅迫的綠豆根V-H+-PPase活性完全恢復(fù)至對照的水平。另一觀點是NaCl誘導(dǎo)V-H+-PPase活性活性上升。Colombo等(1993)發(fā)現(xiàn)NaCl脅迫增加了胡蘿卜懸浮細(xì)胞的V-H+-PPase

17、活性7。Ballesteros等發(fā)現(xiàn)NaCl脅迫下向日葵幼苗根中的H+-PPase活性比對照略有增加。50 mmolL NaCl處理的胡蘿卜細(xì)胞V-H+-PPase在10d內(nèi)較對照增加l倍，80 mmolL NaCl處理的歐亞槭（Acer Pseudoplatanus)細(xì)胞H+-PPase也成倍增加8。比較耐鹽性不同的兩個大麥品種(鑒4和科品7號)V-H+-PPase對不同濃度NaCl(0、100、200 mmolL)的反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)耐鹽的鑒4在兩種鹽濃度下，根系、葉片V-H+-PPase水解活性均上升，而不耐鹽的科品7號根系、葉片V-H+-PPase水解活性均下降，顯示了V-H+-PPase的基

18、因型差異。在100和400 mmolL NaCl脅迫下，鹽地堿蓬葉片中V-H+-PPase活性較對照增加9。李平華10的研究表明，用400 mmolL NaCl處理鹽地堿蓬后，分離其葉片液泡膜微囊進(jìn)行Western blot分析發(fā)現(xiàn)鹽脅迫誘導(dǎo)了鹽地堿蓬V-H+-PPase蛋白表達(dá)并且其活性明顯增大，這與包華音11的研究結(jié)果一致。李圓圓121用100 mmolL NaCl處理鹽地堿蓬后，其幼葉和成熟葉中V-H+-PPase的水解活性均有所增加。此外，成熟葉中V-H+-ATPase的水解活性要高于幼葉，幼葉中V-H+-PPase水解活性要明顯高于成熟葉，這與V-H+-PPase在大多數(shù)的幼嫩組織中

19、是液泡膜上主要的質(zhì)子泵，而在成熟組織中V-H+-ATPase為液泡膜上主要的質(zhì)子泵的觀點一致。VeraEstrella等13用200mmolL NaCl處理鹽芥(The llungiella halophila)后，鹽芥葉片中H+-PPase水解活性是未做NaCl處理的1.3倍；Guo等14將鹽地堿蓬(Suaeda salsa)H+-PPase基因SsVP轉(zhuǎn)入擬南芥，400 mmolL NaCl處理能夠誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化植株葉中SsVP的表達(dá)。包愛科等3的研究表明高濃度的Na+通常會抑制V-H+-PPase的活性，而低濃度的Na+則會促進(jìn)V-H+-PPase的活性或提高其轉(zhuǎn)錄水平。Na+對V-H+-PP

20、ase活性的影響可能是由于Na+競爭酶中K+結(jié)合位點而造成的15。因此V-H+-PPase可以作為衡量作物耐鹽性的一個指標(biāo)。由于植物的耐鹽性是由多基因控制的復(fù)雜性狀16，因此同時過量表達(dá)多個基因可能比單個基因更能賦予轉(zhuǎn)基因植物更強的耐鹽性17。李平華的研究表明，同時過量表達(dá)鹽地堿蓬Na+H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因SsNHXl及擬南芥液泡膜焦磷酸酶基因AVPl的擬南芥植株比野生型擬南芥植株具有更強的抗鹽能力10。Zhao等17將鹽地堿蓬SsNHXl及擬南芥AVPl在水稻中同時過量表達(dá)，獲得的轉(zhuǎn)基因植株比單獨過量表達(dá)兩者之一的轉(zhuǎn)基因植株具有更強的耐鹽性； 本實驗獲得的轉(zhuǎn)基因植株是單獨過表達(dá)LcVP1基因

21、，植株的抗鹽性的提高不是很顯著，在后續(xù)試驗中可以同時轉(zhuǎn)入多個相關(guān)外源基因，可能會有賦予轉(zhuǎn)基因植物更強的抗鹽性。5.結(jié)論在鹽脅迫期間，轉(zhuǎn)基因植株的葉片相對含水量、細(xì)胞膜穩(wěn)定性、地上部分干重下降趨勢均高于野生型，綜上述表明轉(zhuǎn)LcVP1基因百脈根的抗鹽性有所提高。參考文獻(xiàn)1 孫艷香，楊紅梅，耿云紅，等根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的百脈根遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化研究J.南開大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2006，39(2)：51-572 Maeshima M Vacuolar H+-pyrophosphataseJ.Biochim Biophys Acta. 20001465：37-513 包愛科，張金林，郭正剛，等液泡膜H+

22、-PPase與植物耐鹽性J.植物生理學(xué)通訊,2006，42(4)：777-7834 孫艷香，王勇.百脈根液泡膜H+-PPase基因的cDNA克隆與分析.植物生理學(xué)通訊.2007.43(4):657-6635 程 星AVP1基因轉(zhuǎn)化百脈根及其轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽抗旱性研究.碩士學(xué)位論文甘肅：蘭州大學(xué)，20096 Matsumoto HChung G CIncrease in proton-transport activity of tonoplast vesicles as an adaptive response of barley roots to NaCl stressJ.Plant Cell

23、 Physiol，1988，29(7)：1133-11407 Colombo R，Cerana REnhanced activity of tonoplast pyrophosphatase in NaCIGrown cells of Daucus carotaJ.Journal ofplant physiology,1993，142：226-2298 Ballesteros E，Donaire J P，Belver AEffects of salt stress on H+-ATPase and H+-PPase activities of tonoplastenriched vesicle

24、s isolated from sunflower rootsJ.Plant Physiol，1 996，97：259-2689 Wang B S，Luttge U，Ratajczak REffects of salt treatment and osmotic stress on V-ATPase and V-PPaes in leaves of the halophyte Suaeda salsaJ.Exp Bot，2001，52(365)：2355-236510 李平華鹽脅迫下鹽地堿蓬液泡膜質(zhì)子泵表達(dá)分析及過量表達(dá)SsNHXl-AVPI對擬南芥耐鹽性的影響博士學(xué)位論文山東：山東師范大學(xué)，

25、200311 包華音NaCl脅迫對鹽地堿蓬根、莖、葉液泡膜H+-ATPase和H+-PPase活性的影響碩士學(xué)位論文山東：山東師范大學(xué)，200412 李圓圓KCl處理對鹽地堿蓬液泡膜H+-ATPase和H+-PPase活性的影響碩士學(xué)位論文山東：山東師范大學(xué)，200513 Vera-Estrella R，Barkla B J，et a1Salt stress in Thellungiella halophila activates Na+ transport mechanisms required for salinity toleranceJ.Plant Physiol，2005，139：1

26、507-1517.14 Guo S L，Yin H B，Zhang X，et al.Molecular cloning and characterization of avacuolar Wpyrophosphatase gene，SsVP，from the halophyte Suaeda salsa and its overexpression increases salt and drought tolerance of ArabidopsisJ.Plant Mol Biol，2006，60：41-5015 Zhen R G Kim E J，Rea P AAcidic residues necessary for pyrophosphate energized pumping and inhi