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文檔簡介

1、趨磁細菌磁小體與磁小體形成蛋白的應(yīng)用魏靜怡 生命科學(xué)學(xué)院 1400012136摘 要:趨磁細菌的磁小體因其優(yōu)良的性質(zhì),具有很大的合成和應(yīng)用價值。本文在介紹趨磁細菌和磁小體形成的基礎(chǔ)上, 重點研究磁小體和類磁小體納米顆粒的合成。由于趨磁細菌直接培養(yǎng)與合成磁小體的障礙頗多,所以文章轉(zhuǎn)向研究磁小體合成相關(guān)的蛋白研究,并重點考察了Mms6蛋白,對其在體外的礦化作用與合成的單分散納米磁顆粒(MNP)的性質(zhì)進行了探索。此外,文章還研究了Mms6蛋白合成MNP的方法,確定了較優(yōu)的反應(yīng)條件,具有良好的前景。關(guān)鍵詞:趨磁細菌 磁小體 Mms6 MNP1 趨磁細菌與磁小體1.1 趨磁細菌趨磁細菌(magnetot

2、actic bacteria,MTB) 是一類胞內(nèi)含有可感應(yīng)磁場的磁小體,在鞭毛的輔助下可沿磁場運動的革蘭氏陰性細菌。這類微生物分布很廣,常見于氧化還原過渡界面附近, 在酸性環(huán)境、海底、熱泉等特殊環(huán)境也有發(fā)現(xiàn)。系統(tǒng)發(fā)育分析表明,這類菌主要屬于Proteobacteria 門的 、亞屬。自養(yǎng)菌可以通過氧化鐵等無機物獲得能量,異養(yǎng)菌可以從酒石酸等有機酸中獲得能量。1.2 磁小體的性質(zhì)磁小體(magnetosome,MS)是指趨磁細菌細胞內(nèi)生成的由膜包圍的磁性顆粒。每個趨磁細菌細胞內(nèi)可包含有1 條至多條磁小體鏈, 位置靠近細胞壁, 一般沿細胞的長軸方向分布。磁小體大小一般35-120 nm、強磁性、

3、由生物膜包被、具有單磁疇、呈有序鏈狀排列于胞內(nèi)。磁小體主要成分是Fe3O4(magnetite)或Fe3S4(greigite),形態(tài)有八面體、立方體、棱柱體、球狀體、牙齒狀和子彈狀等。1.3 磁小體的優(yōu)點與應(yīng)用磁小體與一般人造磁性納米顆粒相比有許多優(yōu)點:(1)有生物膜包被,且處于超順磁性范圍,不易聚集,具有良好的分散性;(2)磁小體膜上帶有大量生物活性基團,可用于與其他分子的共價連接,且連接其他分子后可方便地通過外加磁場分離純化;(3)載藥磁小體在體內(nèi)通過降解磁小體外膜的方式即可實現(xiàn)藥物的釋放;(4)生物來源使其具有良好的生物相容性和安全性。所以,磁小體在多個領(lǐng)域有潛在的應(yīng)用價值。如細胞分離

4、、核酸提取與分離、核酸特異識別、磁介導(dǎo)熱療、藥物靶向傳送、生物分子載體、磁性探針、醫(yī)學(xué)成像和環(huán)境重金屬處理等領(lǐng)域。尤其值得注意的是磁小體在信息存儲中的應(yīng)用因為磁小體具有超微性(納米級)均勻性和無毒性,可生產(chǎn)品位高的磁性生物材料,可以進行高清晰、高保真的大容量超高密度磁記錄材料的開發(fā)。2. 趨磁細菌合成磁小體的研究與主要障礙 磁小體具有極高的應(yīng)用價值,故而利用趨磁細菌直接合成磁小體是一個自然的想法。事實上,有不少研究者已進行了趨磁細菌性質(zhì)的探索與應(yīng)用(如表1)。但是很少有大規(guī)模生產(chǎn)和商業(yè)化應(yīng)用的實例。這主要由以下原因造成:(1) 生長條件苛刻由于趨磁細菌主要在氧化還原過渡界面附近,所以它們的生長

5、需要特殊的氧化物與還原性物質(zhì)的濃度梯度。大多數(shù)趨磁細菌是厭氧的,少數(shù)趨磁細菌能在較低的氧氣濃度(10%-12%)條件下生存,但氧氣濃度太高或太低都會影響其生存,為實驗室大量培養(yǎng)造成了困難。(2) 磁小體的合成影響因素較多研究表明,營養(yǎng)物質(zhì)(鐵離子濃度,碳含量)和氧氣濃度都會影響磁小體的產(chǎn)量,甚至是磁小體的大小。這就為大規(guī)模統(tǒng)一生產(chǎn)磁小體造成了很大障礙。(3) 生物安全使用細菌進行磁小體生產(chǎn)并從其體內(nèi)提取磁小體,可能攜帶有生物膜,蛋白質(zhì),核酸等污染,這在醫(yī)藥中可能引起很大問題。表1、趨磁細菌相關(guān)研究成果直接利用趨磁細菌合成磁小體受到阻礙時,下一步就是研究磁小體合成中相關(guān)基因,試圖找到重要的可以在

6、其它工程菌中表達的基因,進行大規(guī)模生產(chǎn)。3 磁小體合成與Mms6蛋白3.1 磁小體的合成與相關(guān)基因趨磁細菌基因組上有一段特殊的區(qū)域“磁小體島”,該基因島與磁小體的合成密切相關(guān),負責(zé)細胞質(zhì)膜內(nèi)陷成為磁小體囊泡、磁小體蛋白的定位、磁小體排列成鏈、磁鐵礦的生物礦化等步驟,每個步驟分別有獨立的基因控制。研究表明,MagA 有助于趨磁細菌從外界環(huán)境中吸收鐵,膜蛋白MamB,MamQ,MamI 和MamL 在細胞質(zhì)膜內(nèi)陷成為磁小體囊泡的過程中發(fā)揮作用,磁小體可以沿著MamK 蛋白所形成的纖維結(jié)構(gòu)在胞內(nèi)排列成鏈,酸性蛋白MamJ 可以控制磁小體鏈的形成。另外,還有一種礦化蛋白Mms6,可以輔助磁小體形成與形

7、態(tài)調(diào)控。該蛋白在近年來研究很廣,以下具體分析Mms6蛋白性質(zhì)與應(yīng)用。3.2 Mms6蛋白Mms6蛋白是磁小體形成中起重要作用的蛋白。最先在趨磁螺菌Magnetospirillum magneticum AMB-1中被發(fā)現(xiàn),并能與AMB-1體內(nèi)的立方八面體MNP緊密結(jié)合。Mms6的N端疏水,可能與磁小體的脂膜結(jié)合有關(guān);其C端可能與鐵離子,磁小體前體或形成過程中的晶體表面結(jié)合(羧基的酸性),從而輔助了體內(nèi)MNP立方八面體性態(tài)的形成。3.3 Mms6蛋白在體外的礦化作用Arakaki 【2】等人發(fā)現(xiàn)Mms6在體外同樣可以輔助立方磁顆粒的形成,且這種體外形成的磁鐵礦呈現(xiàn)出立方八面體的晶體形態(tài),晶體顆粒

8、尺寸均勻,超順磁性,與AMB-1 中的磁小體非常相似,該發(fā)現(xiàn)就引發(fā)了后續(xù)對Mms6合成類磁小體的單分散納米磁顆粒(MNP)的研究。4. Mms6蛋白體外合成單分散納米磁顆粒(MNP)4.1 Mms6蛋白體外合成MNP的性質(zhì)Tanya Prozorov 【3】等研究者對Mms6在體外的礦化作用做了對比驗證。通過將Mms6,鐵結(jié)合蛋白,脂籠蛋白Lcn2和BSA放入Fe(III)和Fe(II)1:2的溶液,在室溫下進行共沉淀實驗 (RTCP),可以觀察到Mms6礦化效果的明顯優(yōu)勢納米顆粒形態(tài)規(guī)則,統(tǒng)一,大小合適(30nm)(圖 1B.)。而其他鐵結(jié)合蛋白形成的納米顆粒形態(tài)不一且大小偏小。(圖1)圖

9、1. TEM images of magnetite nanoparticles obtained by co-precipitation of FeCl2 and FeCl3:A) without protein, B) with Mms6, C) with ferritin (Note that ca 5 nm iron oxide nanoparticles seen as darker small dots appear embedded in surrounding globular bodies, most likely protein),D) with Lnc2, and E)

10、with BSA此外,Mms6合成的MNP還具有良好的磁學(xué)性質(zhì)。比較不同鐵結(jié)合蛋白形成的納米顆粒的磁滯回線,可得Mms6合成的MNP的優(yōu)勢:(1) 易磁化,易退磁 由Mms6合成的納米磁顆粒磁滯回線狹長,包圍面積小,磁滯損耗小,矯頑力小,說明其易磁化,退磁。 (2)超順磁性 由Mms6合成的納米磁顆粒在較低磁場時較快達到飽和,說明其磁矩較大,呈現(xiàn)強磁性。在阻隔溫度TB之上,磁滯現(xiàn)象幾乎消失,曲線都符合Langevin 方程, 說明其在阻隔溫度TB之上的超順磁性。(圖2)2所以,Mms6在體外合成MNP的可行性與優(yōu)越性已被證明。4.2 Mms6在體外合成MNP的方法研究在Tanya Prozor

11、ov的研究中,磁納米顆粒分散在溶液中,收集和應(yīng)用有一定困難。而現(xiàn)今科技(尤其是高通量的數(shù)據(jù)存儲)急需的是能結(jié)合在固定相上的單分散的MNP。所以,在2012年Johanna M Galloway等人對Mms6在體外合成納米磁顆粒的實驗方法進行了研究與優(yōu)化,完成了對Mms6表達,固定,與礦化這一系列的操作。(1) Mms6表達與純化在2007年,Tanya Prozorov等研究者已經(jīng)成功表達與提取了Mms6蛋白。他們通過選用AMB-1 趨磁細菌,設(shè)計Mms6基因編碼區(qū)的引物,用PCR法成功克隆出Mms6基因。將基因轉(zhuǎn)入pTrcHis TOPO質(zhì)粒,(在Mms6的N端加上多組氨酸標(biāo)簽)并選用大腸桿

12、菌作為載體,成功表達并提取了His-tagged Mms6。(相關(guān)序列如圖3)圖3、Mms6重組蛋白序列與堿基序列Johanna M Galloway等人在此基礎(chǔ)上進行了優(yōu)化。為了提高產(chǎn)率,研究者在蛋白后加入了N端麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP),以提高重組蛋白的溶解度。His-tag也被插入N端,使得提純更為方便。(用固定化金屬離子親和層析(IMAC)進行提純)。在Mms6序列和N端還加入了一個蛋白酶切位點,使得在加入His6-TEV 蛋白酶的情況下可以切去Mms6后的His8-MBP tag。(圖4)圖4、Mms6重組蛋白構(gòu)建(2) 固定相的構(gòu)建與Mms6蛋白附著研究人員使用了自組裝單分子層 (S

13、AM)進行操作,具體而言,在金表面加上烷硫醇構(gòu)建SAM。實驗使用了兩種SAM,分別為四乙二醇烷基硫醇(PEG)和一端含羧基的烷硫醇(PEG-COOH),PEG主要解決生物污損問題,即抵抗蛋白的結(jié)合;而PEG-COOH在碳化亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)存在的條件下可以形成酯鍵,能與蛋白的N端高效連接。所以,在加入Mms6后,即可進行蛋白的固定相附著。(如圖5)(注:圖5中聚二甲硅氧烷(PDMS)主要作為stamp起隔絕作用,與PEG一起構(gòu)建SAM的pattern) 圖5、SAM固定相的構(gòu)建與蛋白附著(3)Mms6礦化方法 回顧2007年已使用的RTCP法,發(fā)現(xiàn)MNP難以結(jié)合在固定

14、相上,這主要由于溶液中存在可移動的Mms6,在溫和條件下一旦滴入堿性液體,可以很快催化礦化反應(yīng),在液相表面就形成MNP,而在底部的固定相與堿性液體接觸較晚,礦化效果不佳。 所以研究者研究了氫氧化物法POFHK。該方法先用氫氧化鉀對鐵的氫氧化物進行了部分氧化,再利用Mms6進行礦化,原理圖如圖6。圖6、POFHK原理圖該方法的特點是氫氧化物反應(yīng)較慢,且需加熱,所以在反應(yīng)過程中所有反應(yīng)物都能進行充分混合和反應(yīng),這使得在固定相上的Mms6蛋白能與反應(yīng)物充分反應(yīng),控制一定實驗條件,可達到較好的礦化效果。(圖7)圖7、POFHK法Mms6礦化效果圖在不同實驗條件下操作,得到圖8所示各圖,可見圖8(a)效

15、果最佳,對應(yīng)條件為80°C ,2小時,試劑:共 10 mL: 50 mMFeSO4, 40 L 50-60% N2H4, 200 mL 26% NH4OH, 100 mM KNO3。圖8、不同方法下Mms6礦化效果圖通過研究,使用生物方法(Mms6蛋白)進行固定相上納米顆粒MNP的合成已有了較為完善的方案。4.3 Mms6蛋白合成MNP的優(yōu)缺點 (1)優(yōu)點:相比化學(xué)方法(如己烷,甲苯,氯仿,290°C反應(yīng))在試劑上更易獲得,且生物方法可以持續(xù)生產(chǎn)。反應(yīng)條件上相對溫和(80°C) (2) 缺點:實驗試劑的用量(比例)需嚴格調(diào)控,且仍有一些MNP附著在了PEG上(PE

16、G應(yīng)該是防止附著的),使得形成的pattern并不很理想。5、展望與設(shè)想 第一,從目前得到的研究成果看,關(guān)于趨磁細菌的研究還存在著巨大的挑戰(zhàn),尤其是趨磁細菌的培養(yǎng)和利用,還亟待進一步研究。下一步的研究重點應(yīng)是篩選較易培養(yǎng)的趨磁細菌并對其培養(yǎng)條件進行優(yōu)化。可以通過研究趨磁菌原始生活環(huán)境的理化參數(shù)來進行實驗室模擬培養(yǎng)或通過對其原始生境的改良以發(fā)展固體平板培養(yǎng)獲得單菌落,尤其可以改造現(xiàn)已研究較多的MSR-1、AMB-1 等大規(guī)模培養(yǎng)和生產(chǎn)磁小體。第二,可以考慮將趨磁細菌磁小體合成的相關(guān)基因(磁小體島)轉(zhuǎn)入其他工程菌(如大腸桿菌),進行磁小體的大規(guī)模生產(chǎn)。不過磁小體合成的相關(guān)基因研究尚不完全,整個基因

17、島的異源表達也未有研究,進展較為緩慢。第三,可以考慮重點利用Mms6蛋白合成類似磁小體的MNP,而且該方面已有較為深入的研究。Mms6蛋白的表達與體外礦化方法已較為成熟,且體現(xiàn)出生物方法的獨特優(yōu)勢。不過Mms6礦化還需在實驗條件上做進一步優(yōu)化,相信利用趨磁細菌磁小體合成的Mms6蛋白進行MNP合成前景光明。參考文獻1、Magnetotactic Bacteria: Performances andChallenges Abhilasha Singh Mathuriya, Kratika Yadav & B. D. Kaushik Geomicrobiology Journal (201

18、5) 32, 7807882、A Novel Protein Tightly Bound to Bacterial Magnetic Particles in Magnetospirillum magneticum Strain AMB-1, A. Arakaki, J. Webb, T. Matsunaga, J. Biol. Chem., 278 (2003) 8745-8750.3、Protein-Mediated Synthesis of Uniform SuperparamagneticMagnetite Nanocrystals ,Tanya Prozorov, Surya K. Mallapragada, Adv. Funct. Mater. 2007, 17, 9519574、Nanomagnetic Arrays Formed With the Biomineralization Protein Mms6,Gavin Bu

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