趨磁細(xì)菌磁小體與磁小體形成蛋白的應(yīng)用

1、趨磁細(xì)菌磁小體與磁小體形成蛋白的應(yīng)用魏靜怡 生命科學(xué)學(xué)院 1400012136摘 要：趨磁細(xì)菌的磁小體因其優(yōu)良的性質(zhì)，具有很大的合成和應(yīng)用價(jià)值。本文在介紹趨磁細(xì)菌和磁小體形成的基礎(chǔ)上, 重點(diǎn)研究磁小體和類(lèi)磁小體納米顆粒的合成。由于趨磁細(xì)菌直接培養(yǎng)與合成磁小體的障礙頗多，所以文章轉(zhuǎn)向研究磁小體合成相關(guān)的蛋白研究，并重點(diǎn)考察了Mms6蛋白，對(duì)其在體外的礦化作用與合成的單分散納米磁顆粒（MNP）的性質(zhì)進(jìn)行了探索。此外，文章還研究了Mms6蛋白合成MNP的方法，確定了較優(yōu)的反應(yīng)條件，具有良好的前景。關(guān)鍵詞：趨磁細(xì)菌 磁小體 Mms6 MNP1 趨磁細(xì)菌與磁小體1.1 趨磁細(xì)菌趨磁細(xì)菌（magnetot

2、actic bacteria，MTB） 是一類(lèi)胞內(nèi)含有可感應(yīng)磁場(chǎng)的磁小體，在鞭毛的輔助下可沿磁場(chǎng)運(yùn)動(dòng)的革蘭氏陰性細(xì)菌。這類(lèi)微生物分布很廣，常見(jiàn)于氧化還原過(guò)渡界面附近， 在酸性環(huán)境、海底、熱泉等特殊環(huán)境也有發(fā)現(xiàn)。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，這類(lèi)菌主要屬于Proteobacteria 門(mén)的 、亞屬。自養(yǎng)菌可以通過(guò)氧化鐵等無(wú)機(jī)物獲得能量，異養(yǎng)菌可以從酒石酸等有機(jī)酸中獲得能量。1.2 磁小體的性質(zhì)磁小體（magnetosome，MS）是指趨磁細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)生成的由膜包圍的磁性顆粒。每個(gè)趨磁細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)可包含有1 條至多條磁小體鏈, 位置靠近細(xì)胞壁, 一般沿細(xì)胞的長(zhǎng)軸方向分布。磁小體大小一般35-120 nm、強(qiáng)磁性、

3、由生物膜包被、具有單磁疇、呈有序鏈狀排列于胞內(nèi)。磁小體主要成分是Fe3O4（magnetite）或Fe3S4（greigite），形態(tài)有八面體、立方體、棱柱體、球狀體、牙齒狀和子彈狀等。1.3 磁小體的優(yōu)點(diǎn)與應(yīng)用磁小體與一般人造磁性納米顆粒相比有許多優(yōu)點(diǎn)：（1）有生物膜包被，且處于超順磁性范圍，不易聚集，具有良好的分散性；（2）磁小體膜上帶有大量生物活性基團(tuán)，可用于與其他分子的共價(jià)連接，且連接其他分子后可方便地通過(guò)外加磁場(chǎng)分離純化；（3）載藥磁小體在體內(nèi)通過(guò)降解磁小體外膜的方式即可實(shí)現(xiàn)藥物的釋放；（4）生物來(lái)源使其具有良好的生物相容性和安全性。所以，磁小體在多個(gè)領(lǐng)域有潛在的應(yīng)用價(jià)值。如細(xì)胞分離

4、、核酸提取與分離、核酸特異識(shí)別、磁介導(dǎo)熱療、藥物靶向傳送、生物分子載體、磁性探針、醫(yī)學(xué)成像和環(huán)境重金屬處理等領(lǐng)域。尤其值得注意的是磁小體在信息存儲(chǔ)中的應(yīng)用因?yàn)榇判◇w具有超微性（納米級(jí)）均勻性和無(wú)毒性，可生產(chǎn)品位高的磁性生物材料，可以進(jìn)行高清晰、高保真的大容量超高密度磁記錄材料的開(kāi)發(fā)。2. 趨磁細(xì)菌合成磁小體的研究與主要障礙 磁小體具有極高的應(yīng)用價(jià)值，故而利用趨磁細(xì)菌直接合成磁小體是一個(gè)自然的想法。事實(shí)上，有不少研究者已進(jìn)行了趨磁細(xì)菌性質(zhì)的探索與應(yīng)用（如表1）。但是很少有大規(guī)模生產(chǎn)和商業(yè)化應(yīng)用的實(shí)例。這主要由以下原因造成：（1） 生長(zhǎng)條件苛刻由于趨磁細(xì)菌主要在氧化還原過(guò)渡界面附近，所以它們的生長(zhǎng)

5、需要特殊的氧化物與還原性物質(zhì)的濃度梯度。大多數(shù)趨磁細(xì)菌是厭氧的，少數(shù)趨磁細(xì)菌能在較低的氧氣濃度（10%-12%）條件下生存，但氧氣濃度太高或太低都會(huì)影響其生存，為實(shí)驗(yàn)室大量培養(yǎng)造成了困難。（2） 磁小體的合成影響因素較多研究表明，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（鐵離子濃度，碳含量）和氧氣濃度都會(huì)影響磁小體的產(chǎn)量，甚至是磁小體的大小。這就為大規(guī)模統(tǒng)一生產(chǎn)磁小體造成了很大障礙。（3） 生物安全使用細(xì)菌進(jìn)行磁小體生產(chǎn)并從其體內(nèi)提取磁小體，可能攜帶有生物膜，蛋白質(zhì)，核酸等污染，這在醫(yī)藥中可能引起很大問(wèn)題。表1、趨磁細(xì)菌相關(guān)研究成果直接利用趨磁細(xì)菌合成磁小體受到阻礙時(shí)，下一步就是研究磁小體合成中相關(guān)基因，試圖找到重要的可以在

6、其它工程菌中表達(dá)的基因，進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)。3 磁小體合成與Mms6蛋白3.1 磁小體的合成與相關(guān)基因趨磁細(xì)菌基因組上有一段特殊的區(qū)域“磁小體島”，該基因島與磁小體的合成密切相關(guān)，負(fù)責(zé)細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)陷成為磁小體囊泡、磁小體蛋白的定位、磁小體排列成鏈、磁鐵礦的生物礦化等步驟，每個(gè)步驟分別有獨(dú)立的基因控制。研究表明，MagA 有助于趨磁細(xì)菌從外界環(huán)境中吸收鐵，膜蛋白MamB，MamQ，MamI 和MamL 在細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)陷成為磁小體囊泡的過(guò)程中發(fā)揮作用，磁小體可以沿著MamK 蛋白所形成的纖維結(jié)構(gòu)在胞內(nèi)排列成鏈，酸性蛋白MamJ 可以控制磁小體鏈的形成。另外，還有一種礦化蛋白Mms6，可以輔助磁小體形成與形

7、態(tài)調(diào)控。該蛋白在近年來(lái)研究很廣，以下具體分析Mms6蛋白性質(zhì)與應(yīng)用。3.2 Mms6蛋白Mms6蛋白是磁小體形成中起重要作用的蛋白。最先在趨磁螺菌Magnetospirillum magneticum AMB-1中被發(fā)現(xiàn)，并能與AMB-1體內(nèi)的立方八面體MNP緊密結(jié)合。Mms6的N端疏水，可能與磁小體的脂膜結(jié)合有關(guān)；其C端可能與鐵離子，磁小體前體或形成過(guò)程中的晶體表面結(jié)合（羧基的酸性），從而輔助了體內(nèi)MNP立方八面體性態(tài)的形成。3.3 Mms6蛋白在體外的礦化作用Arakaki 【2】等人發(fā)現(xiàn)Mms6在體外同樣可以輔助立方磁顆粒的形成，且這種體外形成的磁鐵礦呈現(xiàn)出立方八面體的晶體形態(tài)，晶體顆粒

8、尺寸均勻，超順磁性，與AMB-1 中的磁小體非常相似，該發(fā)現(xiàn)就引發(fā)了后續(xù)對(duì)Mms6合成類(lèi)磁小體的單分散納米磁顆粒（MNP）的研究。4. Mms6蛋白體外合成單分散納米磁顆粒（MNP）4.1 Mms6蛋白體外合成MNP的性質(zhì)Tanya Prozorov 【3】等研究者對(duì)Mms6在體外的礦化作用做了對(duì)比驗(yàn)證。通過(guò)將Mms6，鐵結(jié)合蛋白，脂籠蛋白Lcn2和BSA放入Fe（III）和Fe（II）1：2的溶液，在室溫下進(jìn)行共沉淀實(shí)驗(yàn) (RTCP)，可以觀(guān)察到Mms6礦化效果的明顯優(yōu)勢(shì)納米顆粒形態(tài)規(guī)則，統(tǒng)一，大小合適（30nm）(圖 1B.)。而其他鐵結(jié)合蛋白形成的納米顆粒形態(tài)不一且大小偏小。（圖1）圖

9、1. TEM images of magnetite nanoparticles obtained by co-precipitation of FeCl2 and FeCl3:A) without protein, B) with Mms6, C) with ferritin (Note that ca 5 nm iron oxide nanoparticles seen as darker small dots appear embedded in surrounding globular bodies, most likely protein),D) with Lnc2, and E)

10、with BSA此外，Mms6合成的MNP還具有良好的磁學(xué)性質(zhì)。比較不同鐵結(jié)合蛋白形成的納米顆粒的磁滯回線(xiàn)，可得Mms6合成的MNP的優(yōu)勢(shì)：（1） 易磁化，易退磁 由Mms6合成的納米磁顆粒磁滯回線(xiàn)狹長(zhǎng)，包圍面積小，磁滯損耗小，矯頑力小，說(shuō)明其易磁化，退磁。 (2)超順磁性 由Mms6合成的納米磁顆粒在較低磁場(chǎng)時(shí)較快達(dá)到飽和，說(shuō)明其磁矩較大，呈現(xiàn)強(qiáng)磁性。在阻隔溫度TB之上，磁滯現(xiàn)象幾乎消失，曲線(xiàn)都符合Langevin 方程, 說(shuō)明其在阻隔溫度TB之上的超順磁性。（圖2）2所以，Mms6在體外合成MNP的可行性與優(yōu)越性已被證明。4.2 Mms6在體外合成MNP的方法研究在Tanya Prozor

11、ov的研究中，磁納米顆粒分散在溶液中，收集和應(yīng)用有一定困難。而現(xiàn)今科技（尤其是高通量的數(shù)據(jù)存儲(chǔ)）急需的是能結(jié)合在固定相上的單分散的MNP。所以，在2012年Johanna M Galloway等人對(duì)Mms6在體外合成納米磁顆粒的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行了研究與優(yōu)化，完成了對(duì)Mms6表達(dá)，固定，與礦化這一系列的操作。(1) Mms6表達(dá)與純化在2007年，Tanya Prozorov等研究者已經(jīng)成功表達(dá)與提取了Mms6蛋白。他們通過(guò)選用AMB-1 趨磁細(xì)菌，設(shè)計(jì)Mms6基因編碼區(qū)的引物，用PCR法成功克隆出Mms6基因。將基因轉(zhuǎn)入pTrcHis TOPO質(zhì)粒，（在Mms6的N端加上多組氨酸標(biāo)簽）并選用大腸桿

12、菌作為載體，成功表達(dá)并提取了His-tagged Mms6。（相關(guān)序列如圖3）圖3、Mms6重組蛋白序列與堿基序列Johanna M Galloway等人在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了優(yōu)化。為了提高產(chǎn)率，研究者在蛋白后加入了N端麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP），以提高重組蛋白的溶解度。His-tag也被插入N端，使得提純更為方便。（用固定化金屬離子親和層析(IMAC)進(jìn)行提純）。在Mms6序列和N端還加入了一個(gè)蛋白酶切位點(diǎn)，使得在加入His6-TEV 蛋白酶的情況下可以切去Mms6后的His8-MBP tag。（圖4）圖4、Mms6重組蛋白構(gòu)建(2) 固定相的構(gòu)建與Mms6蛋白附著研究人員使用了自組裝單分子層 (S

13、AM)進(jìn)行操作，具體而言，在金表面加上烷硫醇構(gòu)建SAM。實(shí)驗(yàn)使用了兩種SAM，分別為四乙二醇烷基硫醇（PEG）和一端含羧基的烷硫醇（PEG-COOH），PEG主要解決生物污損問(wèn)題，即抵抗蛋白的結(jié)合；而PEG-COOH在碳化亞胺（EDC）和N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）存在的條件下可以形成酯鍵，能與蛋白的N端高效連接。所以，在加入Mms6后，即可進(jìn)行蛋白的固定相附著。（如圖5）(注：圖5中聚二甲硅氧烷（PDMS）主要作為stamp起隔絕作用，與PEG一起構(gòu)建SAM的pattern) 圖5、SAM固定相的構(gòu)建與蛋白附著（3）Mms6礦化方法 回顧2007年已使用的RTCP法，發(fā)現(xiàn)MNP難以結(jié)合在固定

14、相上，這主要由于溶液中存在可移動(dòng)的Mms6，在溫和條件下一旦滴入堿性液體，可以很快催化礦化反應(yīng)，在液相表面就形成MNP，而在底部的固定相與堿性液體接觸較晚，礦化效果不佳。 所以研究者研究了氫氧化物法POFHK。該方法先用氫氧化鉀對(duì)鐵的氫氧化物進(jìn)行了部分氧化，再利用Mms6進(jìn)行礦化，原理圖如圖6。圖6、POFHK原理圖該方法的特點(diǎn)是氫氧化物反應(yīng)較慢，且需加熱，所以在反應(yīng)過(guò)程中所有反應(yīng)物都能進(jìn)行充分混合和反應(yīng)，這使得在固定相上的Mms6蛋白能與反應(yīng)物充分反應(yīng)，控制一定實(shí)驗(yàn)條件，可達(dá)到較好的礦化效果。(圖7)圖7、POFHK法Mms6礦化效果圖在不同實(shí)驗(yàn)條件下操作，得到圖8所示各圖，可見(jiàn)圖8（a）效

15、果最佳，對(duì)應(yīng)條件為80°C ，2小時(shí)，試劑：共 10 mL: 50 mMFeSO4, 40 L 50-60% N2H4, 200 mL 26% NH4OH, 100 mM KNO3。圖8、不同方法下Mms6礦化效果圖通過(guò)研究，使用生物方法（Mms6蛋白）進(jìn)行固定相上納米顆粒MNP的合成已有了較為完善的方案。4.3 Mms6蛋白合成MNP的優(yōu)缺點(diǎn) (1)優(yōu)點(diǎn)：相比化學(xué)方法（如己烷，甲苯，氯仿，290°C反應(yīng)）在試劑上更易獲得，且生物方法可以持續(xù)生產(chǎn)。反應(yīng)條件上相對(duì)溫和（80°C） (2) 缺點(diǎn)：實(shí)驗(yàn)試劑的用量（比例）需嚴(yán)格調(diào)控，且仍有一些MNP附著在了PEG上(PE

16、G應(yīng)該是防止附著的)，使得形成的pattern并不很理想。5、展望與設(shè)想 第一，從目前得到的研究成果看，關(guān)于趨磁細(xì)菌的研究還存在著巨大的挑戰(zhàn)，尤其是趨磁細(xì)菌的培養(yǎng)和利用，還亟待進(jìn)一步研究。下一步的研究重點(diǎn)應(yīng)是篩選較易培養(yǎng)的趨磁細(xì)菌并對(duì)其培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。可以通過(guò)研究趨磁菌原始生活環(huán)境的理化參數(shù)來(lái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室模擬培養(yǎng)或通過(guò)對(duì)其原始生境的改良以發(fā)展固體平板培養(yǎng)獲得單菌落，尤其可以改造現(xiàn)已研究較多的MSR-1、AMB-1 等大規(guī)模培養(yǎng)和生產(chǎn)磁小體。第二，可以考慮將趨磁細(xì)菌磁小體合成的相關(guān)基因（磁小體島）轉(zhuǎn)入其他工程菌（如大腸桿菌），進(jìn)行磁小體的大規(guī)模生產(chǎn)。不過(guò)磁小體合成的相關(guān)基因研究尚不完全，整個(gè)基因

17、島的異源表達(dá)也未有研究，進(jìn)展較為緩慢。第三，可以考慮重點(diǎn)利用Mms6蛋白合成類(lèi)似磁小體的MNP，而且該方面已有較為深入的研究。Mms6蛋白的表達(dá)與體外礦化方法已較為成熟，且體現(xiàn)出生物方法的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。不過(guò)Mms6礦化還需在實(shí)驗(yàn)條件上做進(jìn)一步優(yōu)化，相信利用趨磁細(xì)菌磁小體合成的Mms6蛋白進(jìn)行MNP合成前景光明。參考文獻(xiàn)1、Magnetotactic Bacteria: Performances andChallenges Abhilasha Singh Mathuriya, Kratika Yadav & B. D. Kaushik Geomicrobiology Journal (201

18、5) 32, 7807882、A Novel Protein Tightly Bound to Bacterial Magnetic Particles in Magnetospirillum magneticum Strain AMB-1, A. Arakaki, J. Webb, T. Matsunaga, J. Biol. Chem., 278 (2003) 8745-8750.3、Protein-Mediated Synthesis of Uniform SuperparamagneticMagnetite Nanocrystals ，Tanya Prozorov, Surya K. Mallapragada, Adv. Funct. Mater. 2007, 17, 9519574、Nanomagnetic Arrays Formed With the Biomineralization Protein Mms6,Gavin Bu