離子交換色譜

1、離子交換層析的基本原理離子交換層析的基本原理離子交換介質(zhì)的基本性質(zhì)離子交換介質(zhì)的基本性質(zhì)離子交換介質(zhì)的選擇原則離子交換介質(zhì)的選擇原則 離子交換層析是以離子交換劑為固定相，以含特定離子的溶液為流動(dòng)相，利用離子交換劑上的可交換離子與溶液中離子發(fā)生交換作用，由于不同的離子交換能力不一樣，待分離的各種離子在樹脂柱中隨流動(dòng)相的移動(dòng)速度也不一樣，而將混合物中不同離子進(jìn)行分離的技術(shù)。離子交換劑亦稱離子交換介質(zhì)，通常是一種不溶性高分子化合物如樹脂，纖維素，葡聚糖，醇脂糖等；n 含可交換離子n 洗脫的可能性取決于交換反應(yīng)平衡常數(shù)n 吸附的蛋白質(zhì)可以通過(guò)改變pH值，使蛋白 質(zhì)分子電性發(fā)生改變，而洗脫下來(lái)。n 不同

2、蛋白質(zhì)形成離子鍵數(shù)目有差異的，及親和力不同。n離子交換劑的分類陽(yáng)離子交換劑：強(qiáng)酸型和弱酸型 可電離的基團(tuán) 磺酸基（-SO3H） 磷酸基（-PO3H2） 羧酸基（-COOH） 酚羥基（-OH）陰離子交換劑：強(qiáng)堿型和弱堿型 可電離的基團(tuán) 伯胺基（-NH2） 仲胺基（-NHCH3 ） 叔胺基（-N(CH3)2） 季胺基（-N+(CH3) 3 ）1 1 強(qiáng)酸型陽(yáng)離子交換樹脂強(qiáng)酸型陽(yáng)離子交換樹脂陽(yáng)離子交換樹脂具有酸性基團(tuán)，如應(yīng)用最廣泛的強(qiáng)酸性磺酸型聚苯乙烯樹脂，它是以苯乙烯和二乙烯苯聚合，經(jīng)濃硫酸磺化而制得的聚合物。 化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，510年，耐強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、氧化劑和還原劑,不溶于酸、堿及常見的有機(jī)溶劑。耐

3、熱超過(guò)100C。n強(qiáng)離子交換劑的電離率基本不受pH值影響，離子交換作用的pH范圍寬n弱離子交換劑的電離率受pH影響很大，離子交換作用的pH范圍小弱酸性陽(yáng)離子交換劑在pH值降低時(shí)，其電離率逐漸降低，離子交換能力逐漸減弱弱堿性陰離子交換劑在pH值升高時(shí)，其電離率逐漸降低，離子交換能力逐漸減弱常用的離子交換劑n離子交換樹脂：離子交換樹脂：離子交換纖維素：離子交換纖維素是攜帶功能基團(tuán)纖維素衍生物，具有松散的親水性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)以及較大的表面積，大分子可以自由通過(guò)，因而對(duì)生物大分子（如蛋白質(zhì)）的交換容量比離子交換樹脂大。陽(yáng)離子型離子交換纖維素包括羥甲基纖維素（CM纖維素）等陰離子型離子交換纖維素包括二乙基氨基

4、乙基纖維素（DEAE纖維素）離子交換纖維素 離子交換纖維素 離子交換纖維素離子交換纖維素 常用的離子交換劑離子交換葡聚糖： 離子交換葡聚糖是葡聚糖經(jīng)環(huán)氧氯丙烷交聯(lián)后形成的具有多孔三維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和離子交換功能基團(tuán)的多糖衍生物（Sephadex G）Sephadex的優(yōu)點(diǎn)如下： 親水性強(qiáng)、不會(huì)引起生物分子的變性和失活，母鏈對(duì)蛋親水性強(qiáng)、不會(huì)引起生物分子的變性和失活，母鏈對(duì)蛋白質(zhì)、核白質(zhì)、核酸酸及其它生物分子的非特異性吸附能力小及其它生物分子的非特異性吸附能力小 電離基團(tuán)在母體上取代程度高，交換容量大，裝柱方便電離基團(tuán)在母體上取代程度高，交換容量大，裝柱方便，流速快，流速快既有離子交換作用，又有分

5、子篩效應(yīng)既有離子交換作用，又有分子篩效應(yīng) 因而Sephadex是一類廣泛應(yīng)用的色譜分離介質(zhì)在pH7時(shí)可耐120的高熱 2105的蛋白質(zhì) 適用于 常用的離子交換劑常用的離子交換劑 常用的離子交換葡聚糖包括： 陽(yáng)離子交換劑CM-Sephadex C-25，CM-Sephadex C-50Sephadex C-25，Sephadex C-50陰離子交換劑DEAE-Sephadex A-25，DEAE- Sephadex A-50QAE-Sephadex A-25，QAE-Sephadex A-50 常用的離子交換劑離子交換瓊脂糖：離子交換瓊脂糖： 離子交換瓊脂糖是攜帶DEAE或CM基團(tuán)的Sephar

6、ose CL-6B DEAE-Sepharose（陰離子型）和CM-Sepharose（陽(yáng)離子型）的離子交換介質(zhì)具有硬度大、性質(zhì)穩(wěn)定，流速好，分離能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。尤其是介質(zhì)受pH和離子強(qiáng)度的影響所引起的膨脹和收縮效應(yīng)較小，因此具有穩(wěn)定的外形體積對(duì)pH及溫度的變化均較穩(wěn)定，可在pH310和070范圍內(nèi)使用，改變離子強(qiáng)度或pH時(shí)，床體積變化不大。 酸性物質(zhì)用陰離子交換劑分離堿性物質(zhì)用陽(yáng)離子交換劑分離反離子n氨基酸、核苷酸、蛋白質(zhì)等兩性電解質(zhì)，可根據(jù)其pI值及離子化曲線來(lái)選擇。n活性分子：親水性基質(zhì)的交換樹脂n具體：種類，離子形式、交換量、顏色、交聯(lián)度、理化性質(zhì)等。被分離物質(zhì)所帶的電荷性質(zhì) 12346

7、789105pH+-蛋白質(zhì)凈電荷等電點(diǎn)吸附陰離子交換劑吸附陽(yáng)離子交換劑pH pI（-）對(duì)pI=5的某酸性蛋白質(zhì)在pH5.5-9.0的范圍內(nèi)，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)為陰離子時(shí)，應(yīng)首選DEAE纖維素；在pH3.5-4.5的范圍內(nèi)，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)為陽(yáng)離子時(shí)，應(yīng)首選CM纖維素離子交換劑的分類離子交換劑的分類強(qiáng)離子交換劑的電離率基本不受pH值影響，離子交換作用的pH范圍寬弱離子交換劑的電離率受弱離子交換劑的電離率受pH影響很大，離子交換作用的影響很大，離子交換作用的pH范范圍小圍小弱酸性陽(yáng)離子交換劑在弱酸性陽(yáng)離子交換劑在pHpH值降低時(shí)，其電離率值降低時(shí)，其電離率逐漸降低，離子交換能力逐漸減弱逐漸降低，離子交換能力逐漸減弱

8、弱堿性陰離子交換劑在弱堿性陰離子交換劑在pHpH值升高時(shí)，其電離率逐漸降低值升高時(shí)，其電離率逐漸降低，離子交換能力逐漸減弱，離子交換能力逐漸減弱酸堿處理的次序決定了離子交換劑攜帶反離子的類型。酸堿處理的次序決定了離子交換劑攜帶反離子的類型。 交換容量的50，陰離子一般為10-20%。小于5床體積（1分析）。n洗脫：用蒸餾水洗去多余的（沒(méi)吸附的）樣品，然后用洗脫液（緩沖液，pH,離子強(qiáng)度）淋洗，方法有等度，梯度等。補(bǔ)充層析柱平衡平衡緩沖液的用量至少為柱體積的 2 倍平衡緩沖液的流速可略高于正常操作流速平衡終點(diǎn)以流出液的離子濃度、導(dǎo)電性、pH值與緩沖液一致為準(zhǔn)，其中pH值最重要 補(bǔ)充補(bǔ)充補(bǔ)充樣品洗脫恒定洗脫恒定洗脫階段洗脫階段洗脫梯度洗脫梯度洗脫102030405060708090離子強(qiáng)度pH值CC2（C2C1）（）（1V）A2/A1A1 C1 V為流出體積對(duì)總體積之比 A2 C2 當(dāng)當(dāng)A1A2時(shí)為線性梯度，當(dāng)時(shí)為線性梯度，當(dāng)A1A2時(shí)為凹形梯度，時(shí)為凹形梯度，A1A2時(shí)為凸形梯度。時(shí)為凸形梯度。 n若有脂溶性物質(zhì)則可用非離子型去污劑洗柱后再生，也可用乙醇洗滌，其順序?yàn)椋?.5mol/L NaOH-水-乙醇-水-20NaOH-水。n保存離子交換劑時(shí)要加