體外試驗(yàn)與新生物技術(shù)在毒理學(xué)中的應(yīng)用

1、第八章毒理學(xué)評價(jià)的分子生物學(xué)方法分子毒理學(xué)固然應(yīng)主要著眼于生物大分子，但也應(yīng)當(dāng)看到這些大分子是存在于細(xì)胞膜上、細(xì)胞器內(nèi)，乃至細(xì)胞間隙液中的。它們與細(xì)胞是不可分離的。因此，對亞細(xì)胞組分的研究也是毒理學(xué)分子生物學(xué)評價(jià)的重要組成部分。第一節(jié)亞細(xì)胞組分的制備現(xiàn)代毒理學(xué)中使用最多的亞細(xì)胞組分是細(xì)胞膜、微粒體及線粒體?，F(xiàn)就細(xì)胞膜、微粒體及線粒體的制備方法加以介紹。一、細(xì)胞膜的制備細(xì)胞膜指細(xì)胞外層質(zhì)膜，厚度約610nmi它將細(xì)胞與外環(huán)境分隔，且參與細(xì)胞的生命活動，細(xì)胞內(nèi)各種細(xì)胞器也是由質(zhì)膜分隔，稱為細(xì)胞器膜，兩者統(tǒng)稱為生物膜。它是常用的研究模型，用以從細(xì)胞和亞細(xì)胞水平研究外源化合物的中毒機(jī)制。1 肝細(xì)胞膜的

2、制備其基本原理是：首先，將肝組織在含有鈣離子的低滲碳酸氫鈉緩沖液中溫和勻漿，使細(xì)胞膜保持較大的膜片；其次，應(yīng)用低速離心使細(xì)胞膜片與細(xì)胞核一起從勻漿中分離，再利用細(xì)胞膜與細(xì)胞核之間的密度差異，用密度梯度離心將細(xì)胞膜從低速離心獲得的粗核部分中分離出來。2 紅細(xì)胞膜的制備哺乳動物紅細(xì)胞不含任何細(xì)胞器，故其紅細(xì)胞膜是較純凈的細(xì)胞膜。（1） 紅細(xì)胞血影膜常用的制備方法是在低滲條件下，紅細(xì)胞膨脹，由雙面盤狀變成近乎球形，隨后細(xì)胞內(nèi)容物因胞膜破裂而釋放，20000g離心。洗滌去除血紅蛋白，即獲紅細(xì)胞膜。此種膜最接近整體系統(tǒng)，仍保留著原有膜的生物化學(xué)和生物物理學(xué)等特性，毒理學(xué)試驗(yàn)常用簡易模型研究外源化合物對細(xì)

3、胞膜離子轉(zhuǎn)運(yùn)及相關(guān)酶類、膜脂流動性和細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)等方面的影響，并探討其可能的機(jī)制。但它不能控制細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的環(huán)境，在應(yīng)用上有一定的局限性。此外，低滲制備的紅細(xì)胞膜雖然去除了細(xì)胞內(nèi)質(zhì)，但膜的封閉性差，有許多泄漏的空穴。（2） 再封血影近年發(fā)現(xiàn)，在一定條件下，脹破了的紅細(xì)胞可以重新封閉，對K'等離子不通透，給研究紅細(xì)胞膜提供了另一模式。其制備的方法有：向低滲脹破的紅細(xì)胞加入濃鹽溶液，成為等滲溶液，置于37溫育20min，期間可緩慢地?cái)嚢瑁吹靡欢ū壤脑俜庋?。將低滲脹破的紅細(xì)胞在0c條件下，過Bio-gelA柱，柱上部的1/3pH為7.6,以利膜與血紅蛋白分離，其下的2/3pH為6.0,有利

4、于隨后紅細(xì)胞空泡的重新封閉，當(dāng)膜從柱上流出后再用一定濃度的Kcl調(diào)節(jié)為等滲液，在37c溫育1h,即獲得重新封閉的血影。（3） 封閉的紅細(xì)胞膜囊泡有時(shí)為了深入研究，需要將膜的內(nèi)、外層翻過來。紅細(xì)胞溶血后，在不含一價(jià)離子的堿性低離子強(qiáng)度介質(zhì)中，膜能自發(fā)地凹陷（無Mg"存在）或外凸（有Mg“存在），形成小囊泡，通過實(shí)驗(yàn)可制備封閉的紅胞膜囊泡。其特點(diǎn)是不受胞漿內(nèi)容物的干擾，可采用勻漿，等密度梯度離心或屏障分離等技術(shù)制備胞漿面在外的翻轉(zhuǎn)泡（其內(nèi)、外層正好與血影膜相反）或胞漿面仍在內(nèi)的正轉(zhuǎn)泡（即與紅細(xì)胞膜內(nèi)外側(cè)相同的囊泡）。（4） 脂質(zhì)體的制備脂質(zhì)體是雙層脂質(zhì)包圍一些水溶液的小滴，呈球形。它是最

5、常用的人工膜之一，是較為理想的生物膜模擬系統(tǒng)。大脂質(zhì)體制備可將適量的磷脂溶于氯仿等有機(jī)溶劑，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸發(fā)至干，使玻璃壁上附有一層極薄的磷脂膜，然后加水溶液，并振搖，即可形成多層大脂質(zhì)體。用超聲波法和微量注射法、去垢劑法可獲得單層脂質(zhì)體。4突觸體膜的制備制備突觸體膜的基本原理是將腦組織在預(yù)冷的蔗糖溶液中進(jìn)行勻漿，再利用腦突觸體膜的蛋白質(zhì)與脂的比例、電荷性質(zhì)、顆粒大小、形狀等不同于其他的細(xì)胞器膜進(jìn)行蔗糖密度梯度離心，將其分離出來。二、微粒體的制備微粒體是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在細(xì)胞勻漿過程中形成的碎片，并非獨(dú)立的細(xì)胞器。由于微粒體含有代謝外源化合物的混合功能氧化酶，在毒理學(xué)研究中有著重要地位，是較常見的試

6、驗(yàn)?zāi)Ｐ?。制備肝微粒體的方法有超速離心法、鈣沉淀法、凝膠過濾法及等電點(diǎn)沉淀法?；静襟E為：將肝組織勻漿后，2500g離心；棄去沉淀（主要是細(xì)胞核及碎片），取上清液9000g離心；棄去沉淀（主要是線粒體），取上清液，100000g離心，得到的沉淀即為線粒體，上清液為胞漿。所得微粒體用緩沖液懸浮后，貯存在一20一70c冰箱中。除超速離心法制備微粒體外，用凝膠過濾、鈣沉淀法和等電點(diǎn)沉淀法也可以制得微粒體。三、線粒體的制備1肝臟線粒體的制備所有操作應(yīng)在低溫條件下進(jìn)行。全部器械如勻漿器、燒杯、離心管等，以及緩沖液應(yīng)放4冰箱內(nèi)預(yù)冷。2亞線粒體顆粒的制備亞線粒體顆粒是指經(jīng)特殊處理，除去線粒體外膜和基質(zhì)部分后形

7、成的小囊泡。它含有氧化磷酸化過程所有的酶類，是觀察呼吸鏈氧化反應(yīng)、ATP酶活性及其他一些特殊反應(yīng)的模型。亞線粒體顆粒制備的原理是利用超聲波作用，破壞線粒體外膜，再經(jīng)超速離心獲得僅有內(nèi)膜的亞線粒體顆粒。在超聲處理過程中應(yīng)注意保持線粒體制備物溫度，不要升高，維持在4以下。第二節(jié)核酸的提取與制備核酸的提取是分子生物學(xué)中很重要的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)，也是其他分子生物學(xué)分析方法的前提條件。核酸樣品的提取質(zhì)量將直接關(guān)系到有關(guān)分析檢測的成敗。分離純化核酸總的原則是應(yīng)保證核酸一級結(jié)構(gòu)的完整性及排除其他分子的污染。為了保證孩酸結(jié)構(gòu)與功能的研究，完整的一級結(jié)構(gòu)是最基本的要求，因?yàn)檫z傳信息全部貯存在一級結(jié)構(gòu)之內(nèi)。核酸的一級

8、結(jié)構(gòu)還決定著其高級結(jié)構(gòu)的形式以及和其他生物大分子結(jié)合的方式。經(jīng)純化的核酸樣品中不應(yīng)存在對酶有抑制作用的有機(jī)溶劑和過高濃度的金屬離子，其他生物大分子如蛋白質(zhì)、多糖和脂類分子的污染應(yīng)降低到最低程度，此外還要排除其他核酸分子的污染，如提取DN6子時(shí)，應(yīng)去除RN后子，反之亦然。為了保證分離核酸的完整性和純度，在實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)注意：盡量簡化操作步驟，縮短提取過程，以減少各種有害因素對核酸的破壞。減少化學(xué)因素對核酸的降解，為避免過酸、過堿對核酸鏈中磷酸二酯鍵的破壞，操作多在DH4-10的條件下進(jìn)行。減少物理因素對核酸的降解。物理降解因素主要是機(jī)械剪切力，其次是高溫。機(jī)械剪切力包括強(qiáng)力高速的溶液震蕩、攪拌，使

9、溶液快速地通過狹長的孔道，細(xì)胞突然置于低滲液中，細(xì)胞爆炸式的破裂以及DNA羊品的反復(fù)凍貯。機(jī)械剪切作用的主要危害對象是對分子質(zhì)量大的線性DNAb子，如真核細(xì)胞的染色體DNA對分子質(zhì)量小的環(huán)狀DNA分子，如質(zhì)粒DNA及RNA分子，威脅相對小一些。高溫，如長時(shí)間的煮沸，除水沸騰帶來的剪切力外，高溫本身對核酸分子中的有些化學(xué)鍵也有破壞作用。核酸提取過程中，常規(guī)操作溫度為04，此溫度環(huán)境可降低核酸酶的活性與反應(yīng)速率，減少對核酸的生物降解。防止核酸的生物降解。細(xì)胞內(nèi)或外來的各種核酸酶消化核酸鏈中的磷酸二酯鍵，直接破環(huán)核酸的一級結(jié)構(gòu)。其中DNA酶需要金屬二價(jià)離子Mg“，ca”的激活，使用金屬二價(jià)離子螯合劑

10、乙二胺四乙酸（EDTA）、檸檬酸鹽基本上可以抑制DNA酶的活性。而RNAB不但分布廣泛、吸易污染樣品，而且耐高溫、耐酸、耐堿、不易失活，所以生物降解是RN碾取過程中的主要危害習(xí)素。總的來說，核酸提取的主要步驟就是破碎細(xì)胞，去除與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)以及多糖、脂類等生物大分子，去除其他不需要的核酸分子，沉淀核酸，去除鹽類、有機(jī)溶劑等雜質(zhì)，純化核酸等。核酸提取的方案，應(yīng)根據(jù)具體生物材料和待提取的核酸分子的特點(diǎn)而定。一、DNA勺提取與制備從細(xì)胞中提取DNA要用盡可能溫和的細(xì)胞破碎法，以免DNA被機(jī)械破碎。操作時(shí)還需要有EDTA的存在，以螯合鎂離子，鎂離子是DNA酶降解DNA所必需的。如果有細(xì)胞壁，要用酶

11、進(jìn)行消除，如用溶菌酶處理細(xì)菌，對于細(xì)胞膜要用去污劑溶解。對于不同來源的細(xì)胞、組織應(yīng)使用不同的裂解液，如果必須使用物理破碎，一定要盡可能地輕緩。細(xì)胞破碎以及其后的操作都要在4cIC條件下進(jìn)行，所用的玻璃器皿和溶液都要經(jīng)過高壓滅菌以破壞DNA!。上述方法只適用于細(xì)胞總DNA的提取。不同來源的樣品，處理時(shí)有不同的注意事項(xiàng)。對于新鮮動物組織臟器等提取材料，由于含有較豐富的DNAB,應(yīng)迅速冷凍保存?zhèn)溆?，以減少DNA的降解；石蠟包埋組織塊中DNAZ先進(jìn)行脫蠟處理；培養(yǎng)細(xì)胞裂解之前應(yīng)用相應(yīng)的緩沖液進(jìn)行洗滌；質(zhì)粒DN砒取之前先要經(jīng)過細(xì)菌培養(yǎng)，獲得對數(shù)生長后期的細(xì)胞后進(jìn)行離心集菌收集，再通過堿性裂解法、去污劑法

12、或煮沸法等進(jìn)行提取，純化過程也可使用酚氯仿萃取法，對于小分子DNA。、于10kb），可用渦旋混合器以保證溶液中有機(jī)相與水相混合均勻，當(dāng)純化DNA分子介于1030kb時(shí)，應(yīng)輕微振蕩，避免DNA被機(jī)械剪切，小于30kh的DNA分子純化時(shí)應(yīng)更小心。二、RN砒取與制備RNA提取技術(shù)與上述DNA取技術(shù)相似。由于RN冊子相對較短，不易被剪切力損傷，因此細(xì)胞破碎可以用較強(qiáng)有力的方法。RNA寸RNA®敏感，而RNA酶在自然界廣泛存在，不僅各種細(xì)胞內(nèi)都有RNAM,操作者的手指上也有RNAB,因此操作者必須帶手套，并且提取液中要有較強(qiáng)的去污劑存在，以便快速滅活RNABo接下來的去蛋白操作須特別強(qiáng)有力，因

13、為RNA常常和蛋白質(zhì)緊密結(jié)合在一起。用DNA酶去除DNA用乙酉|沉淀RNARNA提取要用硫鼠酸月瓜.它既是較強(qiáng)的RNA酶抑制劑，又是蛋白變性劑。制備RNA寸所用物品應(yīng)完全無RNAB。第三節(jié)基因突變分析與PCR僉測一、基因突變分析基因突變（genemutation）包括堿基置換、移碼突變和片段突變（參見第五章第二節(jié)）?；蛲蛔兪欠肿铀降淖兓诠鈱W(xué)顯微鏡下無法看見，一般是以表型（如生長、生化、形態(tài)等）的改乏為基礎(chǔ)進(jìn)行檢測的，也可通過DNA測序、DNA單鏈構(gòu)象多態(tài)分析（sscP）、基因差異分析及基因芯片檢測等分子生物學(xué)方法檢測DNA列的改變來確定。1.PCR-SSCP術(shù)聚合酶鏈反應(yīng)單鏈構(gòu)象多態(tài)性

14、分析在能夠檢測單個(gè)堿基變化的技術(shù)中，單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析因其簡單而有效已成為最常用的技術(shù)。（1）PCRSSCP的基本原理PCKSSCP分析技術(shù)是一種DNA單鏈凝膠電泳技術(shù)，它根據(jù)形成不同構(gòu)象的等長DNA單鏈在中性聚丙烯酰胺凝膠中的電泳遷移率變化來檢測基因變異。首先PCRT增特定靶序列，然后將擴(kuò)增產(chǎn)物變性為單鏈，在不含變性劑的中性聚丙烯酰胺凝膠電泳中電泳。此時(shí)，DNA單鏈的遷移率除與DNAB1的長短有關(guān)外，更主要的是取決于DNA鏈所形成的構(gòu)象。在非變性條件下，DNAM鏈可自身折疊形成具有一定空間結(jié)構(gòu)的構(gòu)象。這種構(gòu)象由DNAII鏈的堿基順序決定，其穩(wěn)定性靠分子內(nèi)局部順序的相互作用（主要為氫鍵）來維持

15、。相同長度的DNA單鏈，其順序不同，甚至單個(gè)堿基不同，所形成的構(gòu)象不同，電泳遷移率也不同。靶DNA中如含單堿基置換或數(shù)個(gè)堿基插入、缺失等改變時(shí)因遷移率變化會出現(xiàn)泳動變位（mobilityshift）,從而可將發(fā)生突變的DNAf正常DNAE分開。經(jīng)典的PCR-SSCP技術(shù)采用放射性同位素標(biāo)記引物或核甘，再通過放射性自顯影顯示結(jié)果。但由于放射性同位素的污染及半衰期的問題，限制其推廣應(yīng)用?，F(xiàn)已發(fā)展多種PCR-SSC啦術(shù)，各有其優(yōu)勢及適用領(lǐng)域。例如，使用熒光素代替核素進(jìn)行標(biāo)記，也可以在電泳后用銀染（銀染顯示法也稱冷sscp）。銀染法利用對單鏈DNAH和力較強(qiáng)的特點(diǎn)，大大提高了分辨率劑檢測的敏感性，且技

16、術(shù)操作簡單、可重復(fù)性好，單鏈帶型清晰，帶與帶之問易于識別，既避免了污染，又提高了靈敏性。此外，使用RNA分子來做SSCP會提高其靈敏度，尤其是對大于200.b.p的片段檢測更顯優(yōu)勢。RN酚子形成的構(gòu)象穩(wěn)定、種類多，對單堿基置換等改變敏感，RNA的sscP分析可檢出多條單鏈帶，提高基因變異檢出率，是PCR-SSC限術(shù)又一發(fā)展方向。（2） PCR-SSCP勺優(yōu)缺點(diǎn)PcRsscP優(yōu)點(diǎn)包括：技術(shù)原理明確，操作簡單，不需特殊儀器，技術(shù)容易掌握；實(shí)驗(yàn)步驟少、速度快、周期短；檢測靈敏度高，一般無假陽性結(jié)果；可運(yùn)用于大樣本篩查；可有效檢測單堿基置換和多堿基插入、缺失等基因突變類型。但PCR-SSCFfe存在一

17、些不足之處：1 ）、該方法最突出的問題是不能檢測出所有的突變，由各實(shí)驗(yàn)室報(bào)道的突變檢出率從35%99%不等，且分析片段太小，可能呈假陰性結(jié)果。由于隨DNA片段大小的增加遷移率的改變明顯減少，故該方法只適用于檢測150200bp的DNM段。一般來說，小于200bp片段的檢出率可達(dá)90，而大至400bp的片段，其檢出率只有7080，片段越小，檢出率越高。2）、SSCP分析影響因素較多。凝膠濃度和交聯(lián)度、電泳溫度、凝膠中甘油的濃度、電泳緩沖液的離子強(qiáng)度等均可通過影響DNA單鏈構(gòu)象從而影響DNA單鏈的電泳遷移率，一種PcR產(chǎn)物單鏈的良好的電泳條件需要反復(fù)試驗(yàn)摸索。3）、PCR-SSCP分析只能發(fā)現(xiàn)是否

18、有突變或堿基序列組成方面的變化，并不能了解DN際列變化的性質(zhì)及位點(diǎn)。解決問題的方法是將已知有改變的樣本的PCFT物進(jìn)行DN附列分析.即PCRSSCPDNA1序三種方法的聯(lián)用（PCR-SSCP-DNA-Sequencing技術(shù)）。2.DNA1序基因突變檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”是直接進(jìn)行DNA測序，一些基因突變篩選方法得出的結(jié)論往往還需DNA測序來證實(shí)。經(jīng)典的DNA1序就其原理來說主要分為化學(xué)降解法和Sanger雙脫氧鏈終止法。在此基礎(chǔ)上又發(fā)展了一些基于非放射物質(zhì)標(biāo)記和自動化測序的方法，近年來還發(fā)展了一些全新的DNA測序方法，如毛細(xì)管凝膠電泳法、陣列毛細(xì)管凝膠電泳法、超薄層凝膠板電泳法等以及不用電泳分離直

19、接測序技術(shù)，如雜交法、質(zhì)譜法、原子探針法、流動式單分子熒光檢測法等。（1）化學(xué)降解法1977年.Maam和Gilb。rt報(bào)道了通過化學(xué)降解測定DNA序列的方法，即化學(xué)降解法(chem。lcl。a。gem。thod，也叫MdxamGilbert法)。它的原理是用一些特殊的化學(xué)試劑處理具末端放射性標(biāo)記的DNM段，分另J作用于DNA序列中4種不同的堿基，使其在核甘酸序列中形成的糖昔鍵連接變?nèi)?，易從DNA1上脫落下來。丟失了堿基的核甘酸鏈再經(jīng)適當(dāng)處理，就可在缺失堿基處斷裂。在進(jìn)行這些反應(yīng)時(shí)，將反應(yīng)條件控制在每條DNA鏈斷開一處，因此經(jīng)過處理可產(chǎn)生一系列長短不等的DNA段。根據(jù)所用的試劑不同，其末端分別

20、為G,A,C,T,再對一系列這樣的片段進(jìn)行電泳及放射自顯影，綜合分析，就可測得DNA分子中的核甘酸排列順序。(2) 酶促雙脫氧鏈終止法酶促雙脫氧鏈終止法又叫Sanger法或鏈終止法(chainterminationmethod)。由于這種方法要求使用一種單鏈DNA莫板和一種合適的DNA合成引物，因此有時(shí)也叫引物合成法或酶催引物合成法。其基本原理是利用了DNA聚合酶所具有的兩種酶催反應(yīng)的特性：第一，DNAm合酶能夠利用單鏈的DNA為模板，合成出準(zhǔn)確的DNA互補(bǔ)鏈；第二，DNA聚合酶能夠利用2'3一雙脫氧核苷三磷酸作底物，使之參與到寡核苷酸鏈的3一末端，從而終止DNA鏈的生長。在同一反應(yīng)管

21、中加入鏈終止劑2，3一雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)中的某一種，以及引物、模板、dNTP&ddNTP能隨機(jī)摻人合成的DNA,一旦摻入，DNA合成即終止，于是各種不同大小的片段起始端相同，而末端核苷酸必定為該種核苷酸。經(jīng)電泳及放射自顯影可從圖譜上直接讀出DNA列。雙脫氧法極適于大規(guī)模測序。(3) 自動化測序法Sanger雙脫氧鏈終止法和Maxanri-Gilbert化學(xué)修個(gè)法在DNAIU序原理上是公認(rèn)的兩大成就但兩者也都存在著一些共同的問題有待解決。例如，這兩種方法都需要使用放射性核素作為標(biāo)記物，盡管靈敏度很高，但存在輻射危害，而且放射性材料在保藏、處理和運(yùn)輸方面也是相當(dāng)麻煩的。再如，這

22、兩種DN際列分析法都存在著操作步驟繁瑣、效率低、速度慢等缺點(diǎn)(特別是在結(jié)果的判斷環(huán)節(jié)中)。自DNA列分析技術(shù)問世不久，為適應(yīng)大規(guī)模測序的需要，許多科學(xué)家開始致力于DNA分析自動化方面的研究。自動測序儀的原理沿用Sanger等建立的雙脫氧鏈終止法.DN咪合酶催化延伸反應(yīng)產(chǎn)生的DNA片段仍需通過序列膠電泳分離，采用熒光標(biāo)記取代放射性標(biāo)記，通過激光激發(fā)熒光，并與電子計(jì)算機(jī)程序的自動化技術(shù)相結(jié)合，達(dá)到自動檢測堿基的目的。而在熒光染料標(biāo)記方式上，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司ABI公司(appliedbiosystem)的自動DNA列測定儀采用4種熒光基團(tuán)標(biāo)記，而歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室(EMBL)與瑞典Pharma

23、ciaILKB公司聯(lián)手推出的全自動激光序列分析儀(ALF，automatedlaserfluorescentsequencer)則采用了單種熒光素標(biāo)記。使用DNA自動測序儀，熟練的操作者一天可以測1000個(gè)以上的堿基，而其他測序方法一般1人1年只能測50000個(gè)堿基。這種方法因采用電子計(jì)算機(jī)控制，自動化操作，大大縮短了測定時(shí)間，而且結(jié)果準(zhǔn)確可靠，是目前最優(yōu)越的測序方法。(4)DNA測序的新方法分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展日新月異，除了上述DNA測序方法，近年來又發(fā)展了一些全新的DNAM序方法。以凝膠電泳為基礎(chǔ)的測序方法在傳統(tǒng)聚丙烯酰胺凝膠電泳的基礎(chǔ)上又發(fā)展了毛細(xì)管電泳激光熒光法、超薄層板電泳激光熒光法

24、等技術(shù)。毛細(xì)管凝膠電泳比傳統(tǒng)凝膠電泳分離速度提高了25倍，但1只毛細(xì)管只能分離1個(gè)樣品，因此分析效率并未提高。陣列毛細(xì)管電泳新方法的出現(xiàn)提高了分析效率。1992年，美國科學(xué)家采用激光聚焦熒光掃描檢測裝置，25只毛細(xì)管并列電泳，每只毛細(xì)管在15h內(nèi)可讀出350bp,DNA列分析效率可達(dá)到6000bp/h。1994年，日本科學(xué)家提出的另一種測序裝置，20只毛細(xì)管并列電泳，采用激光熒光電荷耦合陣列檢測器(ccD)檢測，有較高的靈敏度。采用ccD檢測器，100只毛細(xì)管陣列電泳裝置，可同時(shí)檢測100只毛細(xì)管的DNA分離樣品。使用超薄層凝膠板電泳進(jìn)行測序，凝膠板厚度僅為50100斗m,配備流水冷卻裝置，場

25、強(qiáng)提高到250Vzcm,大幅度地提高了電泳速率。而一般的電泳膠厚度為200400肛m,電場強(qiáng)度較低(75v/cm),限制了測序的速度。在此基礎(chǔ)上如采用激光熒光ccD檢測器檢測，則可比常規(guī)電泳測序速度提高9倍，達(dá)到8000bph以上。不用電泳分離的測序新方法DNA測序方法研究的一個(gè)熱點(diǎn)是不用電泳分離的技術(shù)。這一類嘗試主要包括：雜交法(sequencingbyhybridization,SBH),這是有希望用于快速DNA測序分析的一種新技術(shù)。它應(yīng)用一套已知序列的寡核甘酸探針，與待測DNA羊品進(jìn)行雜交，尋找靶DNA鏈上的互補(bǔ)序列，形成完全互補(bǔ)的雙鏈，根據(jù)雜交情況排列出樣品的序列信息。目前SBH技術(shù)用

26、于同源序列的比較測定、點(diǎn)突變的檢測已日趨成熟。SBH作為一種快速、自動化的測序方法，相信未來幾年中會有迅速發(fā)展，在今后的大規(guī)模測序以及分子生物學(xué)和基因診斷中發(fā)揮重要的作用。質(zhì)譜法中發(fā)展較快的是基體協(xié)助激光解析離子化(MALDI)一時(shí)問飛行質(zhì)譜法用來檢測雙脫氧循環(huán)產(chǎn)生的DNA片段的序列，相關(guān)的延遲離子抽提技術(shù)(delayedionexlraclion,DJMALDI),可提高M(jìn)ALDl分析精度，還有MALDI'FOFDNA測序方法。這一類技術(shù)提供了一種新的非凝膠堿基DNA測序方法，最終有可能比傳統(tǒng)的方法學(xué)更加快速，并為將來的大規(guī)模質(zhì)譜DNAM序提供了可能。原子探針顯微鏡、掃描隧道顯微鏡(

27、sTM)和原子力顯微鏡(AFM)新技術(shù)的發(fā)展，使快速、高分辨直接觀測DN肪子構(gòu)象成為可能。流動式單分子熒光檢測法也在發(fā)展中。3 熒光原位雜交原位雜交(ISI,insituhybridization),是一種在保持組織、細(xì)胞或染色體原有形態(tài)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，對其內(nèi)部特殊核苷酸順序進(jìn)行檢測及定位的分子生物學(xué)手段，可用于染色體畸變分析。其原理是將已標(biāo)記或經(jīng)特殊修飾的核酸探針與已固定的組織、細(xì)胞或染色體中的DNARNA雜交，繼而通過分析標(biāo)記探針在被檢對象中的顯示狀況而達(dá)到對特殊目標(biāo)順序進(jìn)行檢測、定位的目的：用放射性同位素標(biāo)記探針和放射自顯影曾一度作為惟一、高度敏感的IsH手段。近年來，利用化學(xué)修飾合成核甘

28、酸(如diguTP,duTP及ddUTF。等)，并將這些核甘酸摻入可與被檢目標(biāo)序列雜交的RNADNA寡核甘酸片段中，雜交后通過熒光法、酶沉淀法或發(fā)色團(tuán)檢測來鑒定目標(biāo)序列是否存在及其位置。熒光原位雜交(fluorescenceinsituhybridization，F(xiàn)IsH)是目前最常用的ISH手段之一。(1) 熒光原位雜交的原理和特點(diǎn)熒光原位雜交的基本原理為：只要兩個(gè)核酸分子的堿基序列互補(bǔ)，就可在適宜條件下形成穩(wěn)定的雜交分子。FISH就是利用這一原理將標(biāo)記探針同組織、細(xì)胞核或染色體DNA進(jìn)行雜交，在下改變其結(jié)構(gòu)和分布格局的情況下進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)DNARNA某特定序列的測定。FISI-I可用于染色體精

29、細(xì)結(jié)構(gòu)分析，非整倍體檢測，中期、間期細(xì)胞染色體數(shù)目分析，微核來源鑒定及精子非整倍唪檢測。熒光原位雜交技術(shù)具有操作及觀察分析簡便、立體分辨率高、信號明亮清晰以及安全風(fēng)險(xiǎn)性小等優(yōu)點(diǎn)。此外，利用不同熒光物質(zhì)所修飾的核苷酸標(biāo)記不同探針，可在同一樣品中同時(shí)識別和分析多個(gè)目標(biāo)順序。特別是20世紀(jì)90年代發(fā)展起來的多色FISH計(jì)術(shù)，在同一細(xì)胞核或中期染色體中顯示出不同的顏色，從而可同時(shí)檢測2種以上DNA的二維結(jié)構(gòu)，制備出染色體的光譜核型，使全染色體的自動化分析得以實(shí)現(xiàn)，大大拓寬了FSH的應(yīng)用范圍。而20世紀(jì)90年代出現(xiàn)的DNAfibre。一FISH，除顯著提高了FISH的空間分辨率外，也使FlsH靈敏度進(jìn)一

30、步提高。(2) 熒光原位雜交技術(shù)一般程序一般包括探針制備、組織或細(xì)胞的處理、雜交以及信號的顯示與分析。其流程如下：DNA探針標(biāo)記（利用化學(xué)修飾合成的核甘酸進(jìn)行缺口平移、隨機(jī)引物或PcR擴(kuò)增標(biāo)記）已經(jīng)固定的組織、細(xì)胞或染色體與探針的變性處理D37qC濕盒內(nèi)雜交272h熒光顯微鏡下直接檢測雜交信號（探針上的信號分子可被激發(fā)熒光）以熒光標(biāo)記抗體與探針信號分子結(jié)合D熒光顯微鏡下觀察雜交信號具體操作步驟包括：制備和標(biāo)記探針在遺傳毒理學(xué)研究中一般用DN琳針。目前識別畸變的FIsH探針大致可分為染色體序列探針、由許多DNA大片段組成的全染色體探針和著絲點(diǎn)探針。現(xiàn)在主要通過質(zhì)粒重組、PcR擴(kuò)增和人工合成等3種

31、途徑制備探針。常用的探針信號標(biāo)記方法有2種：直接標(biāo)記法。將熒光分子直接標(biāo)記于探針DN"RNA±,雜交后可直接在熒光顯微鏡下檢測，這種方式快速簡捷，背景干擾很少，但雜交信號較弱，且不能進(jìn)一步放大，目前已較少采用；間接標(biāo)記法。采用一個(gè)中間分子標(biāo)記探針，雜交后再用生物素或地高辛等熒光分子標(biāo)記的中間分子的親和物或抗體進(jìn)行檢測。染色體原位雜交雜交前變性處理染色體標(biāo)本，使染色體DNA變?yōu)椴糠謫捂湥⑷サ舾街腞NA及蛋白質(zhì)，變性處理生物素或地高辛修飾的探針。變性常用加熱或堿變性，變性的溫度和時(shí)間隨探針和組織類型的不同而變化，目的是為了保存組織的完整性和最大的雜交效率。變性后的探針與變性

32、后的染色體單鏈DNAS適合的溫度、鹽濃度等條件下復(fù)性雜交成雙鏈。此后，經(jīng)一系列洗滌，將標(biāo)本中未結(jié)合的探針或非特異性雜交的探針全部洗凈。熒光檢測清洗后的標(biāo)本用熒光標(biāo)記的試劑進(jìn)行檢測，對生物素標(biāo)記的探針一般用熒光標(biāo)記的卵白素檢測，而其他中間分子，主要采用熒光標(biāo)記的相應(yīng)抗體來檢測。常用的熒光標(biāo)記分子有AMCA麓光）、異硫鼠熒光素（綠光）、羅丹明（紅光）、德州紅（深紅）等。染色體顯帶通常在雜交后顯帶，如先進(jìn)行常規(guī)顯帶，再進(jìn)行FISH會明顯降低雜交信號的檢出率。常用的顯帶方法包括：Actinomycin/DAPI顯示G帶、經(jīng)澳月尿口密咤處理后再由Hoechest顯示R帶。或采用Alu或Line重復(fù)序列與

33、探針同時(shí)進(jìn)行雜交，亦可得出顯示G帶或R帶的效果。熒光顯微鏡檢測熒光染料受到特定波長的光波激發(fā)便會在其所排布的位置上發(fā)光。此時(shí)選擇合適的濾色鏡，可在同一分裂相上觀察到不同顏色的標(biāo)記物。熒光鏡檢時(shí)顯微鏡的質(zhì)量及濾片的選擇至關(guān)重要，特別是濾片系統(tǒng)，應(yīng)嚴(yán)格按照相應(yīng)熒光分子的熒光激發(fā)發(fā)射光波長，選擇最適的激發(fā)阻擋濾片組合。攝影記錄系統(tǒng)由于固態(tài)電荷耦聯(lián)掃描裝置及圖像分析儀的應(yīng)用，可以使背景著色很大程度地減低。應(yīng)用激光共軛聚焦顯微鏡，可通過對染色片標(biāo)本的不同平面進(jìn)行斷層掃描，并將得到的結(jié)果經(jīng)計(jì)算機(jī)處理，獲得高質(zhì)量的圖像結(jié)果。4 基因差異分析分子生物學(xué)的許多雜交、擴(kuò)增技術(shù)都依賴于特定的探針或引物，才可檢測到基

34、因改變的情況。而某一基因的探針或引物的設(shè)計(jì)是在對該基因序列有一定了解的前提下進(jìn)行的。對于未知序列的分析，此類方法往往無用武之地。各種化學(xué)毒物和環(huán)境危害因素引起的基因改變或新基因的出現(xiàn)大多是未知的。對于此類基因的分析更多應(yīng)用的是差異分析技術(shù)。目前應(yīng)用較多的是mRNA1異顯示法以及新近發(fā)展的cDNA代表性差異分析法。（1）mRNA差異顯示法IJiang和Pardee等于1992年最早報(bào)道了差別顯示法(DDRTPCR，mRNAdifferentialdis-play)。其一般原理是，對mRNA®行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA在此基礎(chǔ)上對每一類cDNA的PC砒擇性擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析，尋找差異片段

35、。該方法主要由以下三部分組成：用3'錨定引物對DNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄；用3,錨定引物及若干數(shù)量一定長度的5'隨機(jī)引物對逆轉(zhuǎn)錄后的cDNAffl彳tPCR擴(kuò)增，以獲得代表不同mRNA勺cDNA片段；用測序膠分離PCRF增后的cDN*段，得出的差異片段在相同條件下再進(jìn)行PCR擴(kuò)增、分離、純化、克隆和測序，即可得到差異片段的序列。差別顯示技術(shù)的不足之處主要是高頻率的假陽性，有時(shí)甚至高達(dá)70以上。為了消除假陽性，應(yīng)嚴(yán)格設(shè)置對照。Sompayrac(1995)曾提出一些降低假陽性的策略。近幾年來隨著此項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用日益廣泛，其方法也在不斷改進(jìn)之中。(2)cDNA代表性差異分析法1994年Huba

36、nk等建立cDNA代表性差異分析(cDNARDAcDNArepresentationaldiffer。.d。卜。i。)。該技術(shù)的基本原理是將差減雜交與PCR有機(jī)結(jié)合，利用雙鏈DNM模板時(shí)可通過PCR指數(shù)擴(kuò)增，而單鏈DNW模板時(shí)呈線性擴(kuò)增的原理，首先制備cDNA并用限制性內(nèi)切酶消化成平均長度為256bp的cDNA段，隨后利用PC叱術(shù)使cDNM段得以富集。接著連續(xù)進(jìn)行3次差減雜交，最后再利用PCR技術(shù)富集特異表達(dá)基因。差減雜交法的工作過程是：從基因表達(dá)特異的組織中提取mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA然后與基因無特異表達(dá)的組織中提取的mRNA±量雜交，在基因特異表達(dá)的組織與基因無特異表達(dá)的組織中均

37、表達(dá)的基因產(chǎn)物形成了cDN”mRN破鏈雜交分子，而特異mRNA專錄的cDNA仍保持單鏈狀態(tài)，將這種單鏈cDNA分離出來即為差異表達(dá)的序列。由于。DNARDA能發(fā)現(xiàn)與表型相關(guān)的基因異常，并能隨基因表達(dá)的時(shí)效性不同而分離出表達(dá)差異的基因，從而對基因的結(jié)構(gòu)和功能有更多的了解。與mRN麻異顯示法相比，由于RDA進(jìn)行了消減雜交，從而大大地減少了mRNA1異顯示中易于出現(xiàn)的假陽件結(jié)果。同時(shí)，由于消減富集和PC網(wǎng)力學(xué)富集的牛I點(diǎn)，可使mRNA1異顯示法中難以顯示的稀有mRNA的cDNA得以富集并予篩選和克隆。在毒理學(xué)領(lǐng)域，基因差異分析用于尋找外源化合物或環(huán)境誘導(dǎo)基因的研究才剛剛開始，但由于其在尋找未知新基因

38、方面的獨(dú)特優(yōu)勢，必將為分子毒理學(xué)的深入研究做出貢獻(xiàn)。5 基因芯片檢測基因芯片(genechip),又稱DNA5片?；蛐酒夹g(shù)是新近出現(xiàn)的將計(jì)算機(jī)科學(xué)、核技術(shù)、物理學(xué)、數(shù)學(xué)等學(xué)科的多種理論和技術(shù)有機(jī)結(jié)合而發(fā)展起來的具有劃時(shí)代意義的新的基因分析方法。它將成千上萬個(gè)寡核苷酸固定在厘米大小的硅片上，將待測的材料用熒光素或核素標(biāo)記，在基因芯片上與探針雜交，通過激光共聚焦顯微鏡對芯片進(jìn)行掃描獲取雜交探針的熒光信號。其制作方法包括：原位合成法(insitusy。nthesis)、離片合成法(offchipsynthesis)及大規(guī)模的cDNA微排列?；蛐酒耐怀鎏攸c(diǎn)是可準(zhǔn)確地確定突變位點(diǎn)及突變類型，尤其

39、是可以同時(shí)檢測成千上萬個(gè)基因乃至整個(gè)基因組的所有突變。它將核酸樣品制備、核酸擴(kuò)增和定性定量檢測等一系列繁復(fù)的過程連續(xù)化和微型化，使其高度集中在一塊數(shù)英寸大的固相支持物上，可用于DNA1序、轉(zhuǎn)錄情況分析、基因診斷與基因藥物分析設(shè)計(jì)、突變及多態(tài)性檢測遺傳作圖等方面的研究。二、有害微生物的PCR僉測PcR(I)olyITleIasjchainreaction)即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的一種在體外快速擴(kuò)增特定基因或DN際列的方法，故又稱為基因的體外擴(kuò)增法，也稱為無細(xì)胞克隆系統(tǒng)。它可以在試管中建立反應(yīng)，數(shù)小時(shí)后能將極其微量的目的基因或某一特定的DNA片段擴(kuò)增數(shù)十萬倍，乃至千百萬倍，并

40、且無須通過煩瑣費(fèi)時(shí)的基因克隆程序便可以獲得足夠數(shù)量的精確的DNA隨著人們對食品安全性要求的不斷提高，PcR技術(shù)以其特異性強(qiáng)、靈敏度高和快速準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)在食品有害微生物檢測領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。(1) .PCR勺技術(shù)原理根據(jù)已知的待擴(kuò)增DNA片段序列，人工合成與該DNA兩條鏈末端互補(bǔ)的兩段寡核昔酸引物，在體外將待檢DNAJ列(模板)在酶促作用下進(jìn)行擴(kuò)增，這種方法也就是PcR技術(shù)。擴(kuò)增過程中高溫變性(denaturation)、低溫退火(annealing)和適溫延伸(extension)等3步反應(yīng)作為一個(gè)周期，反復(fù)循環(huán)，從而達(dá)到迅速擴(kuò)增特異性DNA勺目的。高溫變性是在體外將含有需擴(kuò)增目的基因的模板雙

41、鏈DNA經(jīng)高溫處理，分解成單鏈模板；低溫退火降低反應(yīng)系統(tǒng)溫度，使人工合成的寡聚核甘酸引物與目的DNAM補(bǔ)結(jié)合，形成部分雙鏈；適溫延伸是將反應(yīng)循環(huán)系統(tǒng)的溫度調(diào)至適溫，在TaqDNAm合酶的作用下，有4種核甘酸存在時(shí)，引物鏈將沿著5一3方向延伸，形成與模板互補(bǔ)的新鏈，新鏈又可作為下一次反應(yīng)的模板，如此周而復(fù)始使目的基因的數(shù)量呈幾何級數(shù)擴(kuò)增。在擴(kuò)增初期，目的DNA分子呈幾何級數(shù)2”(n為循環(huán)次數(shù))增加，隨著循環(huán)次數(shù)增加，模板DNA斷增加和酶分子的消耗，擴(kuò)增效率下降，DNA子呈線性(1+x)”增加(x為DNA分子實(shí)際增長率)，經(jīng)過2030次循環(huán)，單一拷貝的基因可擴(kuò)增10'2X10'倍。

42、PcR技術(shù)檢測的主要步驟為：運(yùn)用化學(xué)手段對目標(biāo)DNA提取；設(shè)計(jì)并合成引物，引物設(shè)計(jì)與合成的好壞直接決定PcR擴(kuò)增的成效，通常要求引物位于待分析基因組中的高度保守區(qū)域，長度為1530個(gè)堿基為宜；進(jìn)行PCRT增；克隆并篩選鑒定PcR產(chǎn)物，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳、染色，在紫外光照射下可見擴(kuò)增特異區(qū)段的DNA帶，根據(jù)該帶的不同即可鑒定不同的DNADNA序列分析，不同的對象如擴(kuò)增DNA片斷序列全知、半知或未知，其PcR參數(shù)、退火溫度、時(shí)間、引物等都有較大的差別，將限制片長多態(tài)性(RELP，。restrictionfragment，lengthpoly-一morphysm)、序列測定(Sequenc：)、反轉(zhuǎn)

43、錄PcR(RTPCR)等技術(shù)相結(jié)合，形成了眾多的衍生技術(shù)，如巢式PCR(nestedPCR)、定量PCR(quantitatjveP(：R)、競爭PCR(competitiveP(：R)、單鏈構(gòu)型多態(tài)性PcR(SS(：PPcR)等。這些技術(shù)的產(chǎn)生將使PcR技術(shù)在食品中的應(yīng)用潛力更加廣泛。(2) .PCR在食品有害微生物檢測方面的應(yīng)用在食品有害微生物檢測方面，PcR常用于鑒定某些人工培養(yǎng)困難、不能活體檢查或分離困難且菌數(shù)較少的細(xì)菌疾病的檢測。PcR用于DNA病毒的檢測一般無需提取DNA可直接取少量樣品，煮沸變性后進(jìn)行PcR測定。PcR用于RNAW毒的檢測，必須提純病毒RNA在PcR擴(kuò)增前需轉(zhuǎn)錄成

44、cDNA再加入與cDNAM補(bǔ)的另一引物，用PcR擴(kuò)增出嵌合分子即逆轉(zhuǎn)錄PCR(RTPCR)。傳統(tǒng)方法檢測食品中致病菌的步驟煩瑣費(fèi)時(shí)，需經(jīng)富集培養(yǎng)、分離培養(yǎng)、形態(tài)特征觀察、生理生化反應(yīng)、血清學(xué)鑒定以及必要的動物試驗(yàn)等過程，并且傳統(tǒng)方法無法對那些難以人工培養(yǎng)的微生物進(jìn)行檢測。而應(yīng)用PcR技術(shù)，只需數(shù)小時(shí)就可以電泳法檢測出0.1mgDNA中僅含數(shù)個(gè)拷貝的模板序列。用PcR擴(kuò)增細(xì)菌中保守的rDNA片段，還可對那些人工無法培養(yǎng)的微生物進(jìn)行檢測。用PcR檢測食品中的致病菌，首先要富集細(xì)菌細(xì)胞，通常經(jīng)離心沉淀、濾膜過濾等方法可從樣品中獲得細(xì)菌細(xì)胞，然后裂解細(xì)胞，使細(xì)胞中的DNA釋放，純化后經(jīng)PCFT增細(xì)胞靶

45、DNA勺特異性序列，最后用電泳法或特異性核酸探針檢測擴(kuò)增的DNA列。對于食品體系的微生物檢測，通?？刹捎妙A(yù)增菌培養(yǎng)程序，既增加了目標(biāo)微生物的量，又去除了食品體系中存在的抑制因子，大大提高了檢出率。(1)檢測單核細(xì)胞增生李斯特菌單核細(xì)胞增生李斯特菌是食品衛(wèi)生中的重要病原菌，多通過食品經(jīng)口感染，被列為20世紀(jì)90年代食品中的4大病原菌之一。有關(guān)單核細(xì)胞增生李斯特菌污染乳制品、肉、禽、蔬菜的研究國內(nèi)外均有報(bào)道。該菌可誘發(fā)食物中毒，導(dǎo)致李斯特菌病，主要引起人類腦膜炎、菌血癥等，發(fā)病率雖低，死亡率卻高達(dá)30%70%。在食品李氏桿菌的檢測中，過去一直缺乏簡單快速的分離鑒定技術(shù)，傳統(tǒng)方法從食品中分離、鑒定該

46、菌約需12周才能得出結(jié)果，免疫學(xué)方法和基因探針已用于該菌的快速檢測，但前者可達(dá)到屬水平的特異性，后者敏感性差。PcR技術(shù)的引入可使檢測過程大為縮短。李氏溶血素0基因與內(nèi)化素基因是單核細(xì)胞增生李斯特菌最主要的致病因子與侵襲因子，針對其毒力基因可設(shè)計(jì)特異性高的引物，快速擴(kuò)增。有報(bào)道對食品中李氏桿菌的溶血?；蜻M(jìn)行PcR擴(kuò)增，結(jié)果可在12h內(nèi)完成整個(gè)檢測過程，對食品樣品中李氏桿菌的檢測限可達(dá)550個(gè)細(xì)菌。(3) 檢測金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌是各種類型感染和食物中毒的病原菌，能在食物內(nèi)增殖并產(chǎn)生體外毒素腸毒素、內(nèi)毒素中毒休克綜合癥毒素和脫皮毒素。目前金黃色葡萄球菌腸毒素D的鑒定主要依賴于免疫學(xué)技術(shù)

47、，該技術(shù)需要細(xì)菌純培養(yǎng)和制備腸毒素，實(shí)驗(yàn)周期長、步驟繁多，使其在食品衛(wèi)生學(xué)鑒定時(shí)受到限制。近年來PCRa術(shù)的發(fā)展為食品病原微生物的鑒定提供了新的途徑。(4) 檢測沙門菌沙門菌是一種人畜共患的傳染性病原菌，近年來，對沙門菌快速診斷的方法已有了很大進(jìn)展，如應(yīng)用ELlsA法、EIA技術(shù)、間接血凝抑制試驗(yàn)、HRP-SPA染色法和PcR技術(shù)等。PCR技術(shù)由于具備高度特異、靈敏和快速的特點(diǎn)，已引起越來越廣泛的重視。(5) 柃測致病性大腸桿菌腸毒素大腸桿菌是弓I起嬰幼兒和幼畜腹瀉的主要病原菌之一。該菌可產(chǎn)生2種腸毒素：熱敏性腸毒素和耐熱性腸毒素，它們均能引起腸黏膜細(xì)胞水與電解質(zhì)的代解紊亂并導(dǎo)致腹瀉。腸毒素大

48、腸桿菌引起的腹瀉主要是食入了被該菌污染的食品所致。PCRa術(shù)為臨床和實(shí)驗(yàn)室提供了一個(gè)更為快速靈敏的檢測手段。(6) 檢測志賀氏菌該菌的致病性主要由其質(zhì)粒決定，而傳統(tǒng)方法的選擇性富集培養(yǎng)易丟失質(zhì)粒。PcR技術(shù)克服了這一缺。PCRT增及凝膠電泳分析檢測中心質(zhì)粒DNA的分離，可在67h完成，而從抽樣到最后出結(jié)果也不到1天時(shí)間。(7) 檢測肉毒梭狀芽孢桿菌肉毒梭狀芽孢桿菌產(chǎn)生的肉毒神經(jīng)毒素，在天然物質(zhì)中毒力最強(qiáng)。依據(jù)抗原性不同，肉毒毒素分為A,B,C,D,E,F和G7型，分別由AG型肉毒梭菌(clostridiumb。tulinum)產(chǎn)生，其中A，B,E和F型能引起人類肉毒中毒，致死率很高。肉毒梭菌一

49、直缺乏有效的快速檢測方法，用常規(guī)方法從食物中分離鑒定出肉毒梭菌至少需要4d，不能達(dá)到快速監(jiān)測食品的目的。經(jīng)設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增持異片段，實(shí)現(xiàn)了對食品中肉毒梭菌的快速、敏感、特異性地檢測。3存在的問題及展望PCR技術(shù)雖為一種快速、特異、靈敏、簡便、高效的檢測新技術(shù)，但其在食品中致毒、致病性微生物檢測的實(shí)際應(yīng)用中也存在不少問題，必須認(rèn)真分析各種具體情況，采取必要的措施，以提高反應(yīng)的特異性和敏感性，避免假陽性或假陰性結(jié)果。(1) 污染問題。PCR是一種極為靈敏的反應(yīng)，一旦有極少量外源性DNA污染，就可能出現(xiàn)假陽性結(jié)果，所以在操作時(shí)必須加以注意。(2) 假陽性問題。食品是復(fù)雜的反應(yīng)基質(zhì)，影響PCR反應(yīng)的因素很

50、多，如果不能有效排除各影響因素的干擾，很可能出現(xiàn)假陰性結(jié)果。此外，如果在PCFB作過程中各種實(shí)驗(yàn)條件控制不當(dāng)，很容易導(dǎo)致產(chǎn)物突變，也會導(dǎo)致假陰性結(jié)果。對于這些問題必須有充分的考慮和排除措施。(3) 引物設(shè)計(jì)及靶序列選擇。引物的設(shè)計(jì)及靶序列的選擇是決定PCR吉果的關(guān)鍵因素，引物不同則擴(kuò)增物不同，如果引物的設(shè)計(jì)不當(dāng)，則直接影響對關(guān)鍵靶序列的選擇，降低PCR僉測的靈敏度和特異性，甚至完全失敗。因而必須對擴(kuò)增序列有充分的了解，并規(guī)范PCR實(shí)驗(yàn)室操作計(jì)術(shù)。(4) 模板DNA勺制備方法。肉類等食品增菌液中含有的油脂等雜質(zhì)可抑制Taq酶活性，影響PC阪應(yīng)的正常進(jìn)行。如用煮沸裂解法直接制備DNAI板，油脂等雜

51、質(zhì)難以除去，會影響檢測結(jié)果。因此，必須采用適當(dāng)?shù)哪０錎NA制備方法。有研究發(fā)現(xiàn)，采用快速裂解吸附法制備DNA莫板，經(jīng)過2次清洗步驟可有效去除雜質(zhì)，反應(yīng)干擾小，穩(wěn)定性好，所獲得的模板可保存較長時(shí)間。(5) 靈敏度問題。食品的成分極為復(fù)雜，其中許多成分都對PC或應(yīng)產(chǎn)生干擾作用，從而降低PCR僉測的靈敏性。為了提高檢測的靈敏度，在PCRF增前往往需要進(jìn)行增菌培養(yǎng)。如果不進(jìn)行增菌培養(yǎng)而直接對樣品進(jìn)行檢測，其檢出限可相差5個(gè)數(shù)量級。結(jié)合PC叱術(shù)與免疫磁性分離技術(shù)建立的MIPA方法，可不經(jīng)增菌程序，提高可利用模板數(shù)量，去除食品成分干擾，達(dá)到較好的檢測靈敏度。(6) 檢測效果。PCR方法只能檢測微生物的存在

52、與否，而不能檢測微生物產(chǎn)生的毒素，因而PcR技術(shù)用于致毒性微生物污染的食品的安全性檢測方面，尚存在兩個(gè)問題。其一，致毒性微生物檢測結(jié)果為陰性的食品并不能排除存在毒素的可能，因此檢測結(jié)果為陰性的食品并不一定是食用安全的食品；其二，致毒性微生物檢測結(jié)果為陽性的食品中不一定都含有微生物毒素。對前一種情況，PcR檢測不具診斷價(jià)值，需用小鼠致死試驗(yàn)或免疫學(xué)方法檢測毒素。對后一種情況，PcR檢測具有參考價(jià)值，因?yàn)槭称分写嬖谝鹗澄镏卸镜臐撛谝蛩亍＿@表明，對于致毒性微生物安全性的檢測，不能僅以PcR的檢測結(jié)果為依據(jù)，還需要結(jié)合對毒素物質(zhì)的檢測結(jié)果進(jìn)行綜合判斷。盡管PcR技術(shù)在食品的微生物安全性檢測方面還存在

53、著一些問題，但相信隨著研究的深入，這項(xiàng)技術(shù)必將得以完善，并迅速成為可以信賴的快速檢測手段。三、轉(zhuǎn)基因食品PCR僉測自1983年世界上試驗(yàn)成功第一棵轉(zhuǎn)基因植物以來，以轉(zhuǎn)基因技術(shù)為核心的現(xiàn)代生物技術(shù)迅猛發(fā)展。近年來，利用重組DNA技術(shù)研究開發(fā)的轉(zhuǎn)基因食品快速發(fā)展，有些商品已經(jīng)被批準(zhǔn)商業(yè)化，并且開始進(jìn)入普通消費(fèi)者的餐桌。盡管多數(shù)學(xué)者認(rèn)為轉(zhuǎn)基因食品是安全的，但在過敏性、毒性、致癌性、食品營養(yǎng)品質(zhì)改變以及環(huán)境等方面，仍存在不少爭議。目前，對轉(zhuǎn)基因食品各國普遍的態(tài)度是：對相關(guān)食品必須給消費(fèi)者真實(shí)而明確的信息，大多數(shù)國家要求對轉(zhuǎn)基因食品進(jìn)行標(biāo)識。挪威是世界上第一個(gè)要求對轉(zhuǎn)基因食品進(jìn)行標(biāo)識的國家，規(guī)定轉(zhuǎn)基因成

54、分的標(biāo)識限量為2，歐盟和日本分別為1和5。我國政府規(guī)定，凡是列入標(biāo)識管理目錄并用于銷售的農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物，應(yīng)當(dāng)進(jìn)行標(biāo)識；未標(biāo)識和不按規(guī)定標(biāo)識的，不得進(jìn)口和銷售。因此必須對轉(zhuǎn)基因食品進(jìn)行有效的檢測。從轉(zhuǎn)基因技術(shù)建立之日起，轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)亦隨之建立。目前主要有兩類轉(zhuǎn)基因檢測方法：基于特異性DNA片段的PCR檢測技術(shù)和基于牛!異性蛋白的EuSA(enzyme：linkedimmunosorbentassays)檢測方法。兩種方法的出發(fā)點(diǎn)不同，各有優(yōu)缺點(diǎn)。ELIsA分析法檢測的特異性蛋白主要是外源目的蛋白和一些報(bào)告基因所表達(dá)的蛋白，尤其適用于無需加工的原料性食品，但對于加工品則有局限性。因?yàn)橹亟M基因產(chǎn)物

55、會因加工(特別是高溫)處理而失活、分解或消失而使檢測的不確定性增加，假陰性率增高。PcR法檢測特異性DN*段包括外源啟動子、終止子、報(bào)告基因和目的基因。PcR法也不完全適用，因?yàn)楹怂嵋矔唤到?，但其靈敏度高、適用范圍最廣，目前仍是對轉(zhuǎn)基因食品最常用的檢測方法。轉(zhuǎn)基因食品(GMQgeneticallymodifiedorganism)的PcR檢測分成三個(gè)層次：首先要求檢測出是否含有轉(zhuǎn)入的外源基因，判斷是否為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品，即定性檢測。一旦確定為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品后，需要進(jìn)一步明確兩個(gè)問題，首先要確定是哪種轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品，特別是要確認(rèn)是否為已批準(zhǔn)的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品，即要進(jìn)行轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品品系的檢測鑒定；鑒定了轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品品系，并確認(rèn)為已批難的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品后，往往還要檢測出其中轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的含量，以明確是否達(dá)到需標(biāo)識的含量(閾值)，即需要進(jìn)行定量檢測。目前，對轉(zhuǎn)基因食品的檢測主要有以下幾種PcR方法。1 .定性PC破術(shù)由于定性PCR所需設(shè)備簡單，試劑也相對便宜，因此是目前轉(zhuǎn)基因檢測中最為常用的方法之一，一些國家將其作為有關(guān)食品法規(guī)的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法。定性PcR常以啟動子、終止子、報(bào)告基因、目的基因等特異性DNA片段作為檢測目標(biāo)。統(tǒng)計(jì)表明，實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈反應(yīng)(PcR)檢測技術(shù)CaMv35S啟動子、FMV35S啟動子、Nos終止子、唧£n、c,),3A、Bar和Pat這7種基因片段用做