載體構(gòu)建流程

1、一、簡介慢病毒（ Lentivirus）載體 是以 HIV-1 （人類免疫缺陷I 型病毒）為基礎(chǔ)發(fā)展起來的基因治療載體。 區(qū)別一般的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，它對分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均具有感染能力。慢病毒載體的研究發(fā)展得很快，研究的也非常深入。該載體可以 將外源基因有效地整合到宿主染色體上 ，從而達(dá)到持久性表達(dá)。目前慢病毒也被廣泛地應(yīng)用于表達(dá)RNAi 的研究中。由于有些類型細(xì)胞脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 效果差，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)的siRNA 半衰期短，體外合成siRNA 對基因表達(dá)的抑制作用通常是短暫的，因而使其應(yīng)用受到較大的限制。采用事先在體外構(gòu)建能夠表達(dá)siRNA的載體 , 然后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄siRNA 的策略，不但

2、使脂質(zhì)體有效轉(zhuǎn)染的細(xì)胞種類增加，而且對基因表達(dá)抑制效果也不遜色于體外合成siRNA ，在長期穩(wěn)定表達(dá)載體的細(xì)胞中，甚至可以發(fā)揮長期阻斷基因表達(dá)的作用。慢病毒載體能夠產(chǎn)生表達(dá) shRNA的高滴度的慢病毒，在周期性和非周期性細(xì)胞、干細(xì)胞、受精卵以及分化的后代細(xì)胞中表達(dá)shRNA ，實(shí)現(xiàn)在多種類型的細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因小鼠中特異而穩(wěn)定的基因表達(dá)的功能性沉默，為在原代的人和動物細(xì)胞組織中快速而高效地研究基因功能，以及產(chǎn)生特定基因表達(dá)降低的動物提供了可能性。慢病毒作為siRNA的攜帶者，不但具備特異性地使基因表達(dá)沉默的能力，而且充分發(fā)揮了慢病毒載體自身所具備的優(yōu)勢，為基因功能的研究提供了更強(qiáng)有力的工具。在所構(gòu)建

3、的siRNA表達(dá)載體中，是由RNA聚合酶啟動子來指導(dǎo)RNA合成的，這是因?yàn)?RNA 聚合酶 有明確的起始和終止序列，而且合成的RNA 不會帶 poly A 尾。當(dāng) RNA聚合酶遇到連續(xù)4 個或 5 個 T 時，它指導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄就會停止，在轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物3端形成 14個U。 U6 和 H1 RNA 啟動子 是兩種 RNA 聚合酶依賴的啟動子，其特點(diǎn)是啟動子自身元素均位于轉(zhuǎn)錄區(qū)的上游，適合于表達(dá)21ntRNA 和 50ntRNA 莖環(huán)結(jié)構(gòu)（ stem loop ）。在siRNA 表達(dá)載體中，構(gòu)成 siRNA 的正義與反義鏈，可由各自的啟動子分別轉(zhuǎn)錄,然后兩條鏈互補(bǔ)結(jié)合形成 siRNA ；也可由載體直接表達(dá)小

4、發(fā)卡狀 RNA (small hairpin RNA, shRNA),載體包含位于 RNA 聚合酶啟動子和4 5T轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)之間的莖環(huán)結(jié)構(gòu)序列，轉(zhuǎn)錄后即可折疊成具有 14個 U 3 突出端的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)一步加工成siRNA 。 構(gòu)建載體前通常要通過合成siRNA 的方法，尋找高效的siRNA ，然后從中挑選符合載體要求的序列，將其引入siRNA表達(dá)載體（篩選） 。二、實(shí)驗(yàn)流程（大致的簡單過程）慢病毒表達(dá)載體包含了包裝、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定整合所需要的遺傳信息。慢病毒包裝質(zhì)?？商峁┧械霓D(zhuǎn)錄并包裝RNA 到重組的假病毒載體所需要的所有輔助蛋白。為產(chǎn)生高滴度的病毒顆粒，需要利用表達(dá)載體 (自己構(gòu)建

5、 )和包裝質(zhì)粒（購入）同時共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，在293T 細(xì)胞 (購入 )中進(jìn)行病毒的包裝，包裝好的假病毒顆粒分泌到細(xì)胞外的培養(yǎng)基中，離心取得上清液后， 可以直接用于宿主細(xì)胞的感染，目的基因進(jìn)入到宿主細(xì)胞之后，經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄，整合到基因組，從而高水平的表達(dá)效應(yīng)分子。大致的實(shí)驗(yàn)流程：1. 根據(jù) 目的基因 相關(guān)信息（序列，序列號等），構(gòu)建含有外源基因或siRNA的重組載體；（即質(zhì)粒構(gòu)建，已構(gòu)建好，質(zhì)粒可以永久保存）2. 對于測序正確的 重組質(zhì)粒 ，提取和純化高質(zhì)量的 不含內(nèi)毒素 的重組質(zhì)粒；3. 使用高效 重組載體 和病毒包裝質(zhì)粒（購入） 共轉(zhuǎn)染 293T 細(xì)胞 1 ，進(jìn)行病毒包裝和生產(chǎn)，收集病毒液；4. 濃

6、縮、純化病毒液；5. 用高質(zhì)量的病毒液感染細(xì)胞 (293T 細(xì)胞 )；6. 通過定量PCR 精確測定病毒滴度（高精確滴定方法）和Western分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果；7. 用高質(zhì)量的病毒液感染宿主細(xì)胞；檢測基因功能或者 siRNA 的沉默效率以及使用藥物進(jìn)行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的篩選，通常狀況下， 篩選的細(xì)胞克隆株具有長期的表達(dá)穩(wěn)定性。病毒液足夠用于一般的動物活體實(shí)驗(yàn)。三、重組質(zhì)粒構(gòu)建流程1.基因的獲得 : shRNA 寡核苷酸序列的設(shè)計和合成 (將正確序列克隆入載體中，退火形成雙鏈， PCR 擴(kuò)增 )2.回收A 酶切產(chǎn)物的膠回收：一般做50-100ul體系，然后 跑電泳回收 ，回收量一般為30ul 。B P

7、CR 擴(kuò)增產(chǎn)物的膠回收原理 ：首先利用 低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳DNA 片段，分離目的條帶DNA ，然后紫外光下切割含目的DNA 條帶的膠塊，利用膠回收試劑盒回收純化DNA 片段。試劑盒的膠回收柱采用特殊硅基質(zhì)材料在一定的高鹽緩沖系統(tǒng)下高效、專一地吸附DNA 、RNA 的原理，配備設(shè)計獨(dú)特的離心吸附柱式結(jié)構(gòu)，使用常規(guī)臺式高速離心機(jī)，在幾分鐘之內(nèi)即可以高效回收核酸片段。實(shí)驗(yàn)儀器 ：1、瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)2、紫外觀察分析儀3、離心機(jī)4、單面刀片5、恒溫水浴鍋試劑： 1、 DNA 回收試劑盒 2 2、 50×TAE 3（電泳緩沖液Tris- 乙酸） 3 、 ddH 2O4、瓊脂糖凝膠 4步驟：

8、1）使用 TAE 緩沖液制作瓊脂糖凝膠，然后對目的DNA 進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳 （分離 DNA作用） 5 。2）在紫外燈下切分含DNA 的瓊脂糖塊， 盡可能除去多余的瓊脂糖。放入 1.5ml 離心管中。3）按每置 55水浴100mg 瓊脂糖加入 300 600 l溶膠液 10 分鐘，使瓊脂糖塊完全溶化，期間每6 的比例加入溶膠液 （本實(shí)驗(yàn)加2 分鐘顛例混勻一次促溶。500ul ），4）將溶化后的瓊脂糖液移入吸附柱，12000rpm室溫離心1 分鐘，倒掉收集管中的液體。再將吸附柱放入同一個收集管中。5）在吸附柱中加入500uI 漂洗液，室溫靜置1 分鐘后，12000rpm室溫離心30 秒，倒掉收集

9、管中的液體，將吸附柱放入同一個收集管中。6）再在吸附柱中加入500uI漂洗液，12000rpm室溫離心15 秒，倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一個收集管中。7）12000rpm室溫空離心1 分鐘。8）將吸附柱放入一個干凈的1.5ml 的離心管中，在吸附膜中央加入30ul 洗脫緩沖液，室溫靜置2 分鐘后，12000rpm 室溫離心1 分鐘（為提高回收效率可再洗脫一次），將 1.5ml離心管 (DNA) 貯存于 -20。9）瓊脂糖凝膠電泳（鑒定作用）檢測回收產(chǎn)物。注意事項 ：1）切膠時應(yīng)快速操作，在紫外燈下時間長容易傷害到眼睛；2）溴化乙錠染色后的DNA易受紫外光破壞，故盡量放置于暗室，切帶時

10、應(yīng)使用長波長紫外燈，切膠時間盡量短。3）膠塊一定要充分融化，否則將會嚴(yán)重影響DNA 的回收率。4） 把洗脫液加熱，使用時有利于提高洗脫液效率3連接器材： 旋渦混合器，微量移液取樣器，移液器吸頭，1.5ml 微量離心管，雙面離心管架，臺式離心機(jī)，干式恒溫氣浴。試劑： T 載體， T4 DNA連接酶，連接酶緩沖液，無菌dd Water 。操作步驟： PCR 產(chǎn)物（已純化回收）與T 載體直接連接：（ 1） 事先將干式恒溫儀（或冰盒里的水）溫度設(shè)定在1416° C。（ 2） 取 4 個滅菌的200ul 微量離心管，加入： （需要調(diào)整） 4ml 目的基因； 1ml T載體； 0.5ml T4

11、DNA連接酶（ TAKARA, 350U/ul）； 1ml 連接酶緩沖液10 x buffer；3.5 ml dd Water，總量10ml體系。（ 3）上述混合液輕輕震蕩后再短暫離心，然后置于14°C干式恒溫儀（或14°C水中）中保溫過夜（12-16h）。（ 4） 連接后的產(chǎn)物可以立即用來轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞或置4°C冰箱備用。4. 轉(zhuǎn)化原理 ：目前， 感受態(tài)細(xì)胞 的制備常用冰預(yù)冷的CaCl2 處理細(xì)菌的方法制備，即用低滲CaCl 2 溶液在低溫（0）時處理快速生長的細(xì)菌，從而獲得感受態(tài)細(xì)菌。此時細(xì)菌膨脹成球形，外源 DNA 分子在此條件下易形成抗DNA 酶的羥基鈣磷

12、酸復(fù)合物粘附在細(xì)菌表面，通過熱激作用促進(jìn)細(xì)胞對DNA 的吸收。在一定條件下，經(jīng)過連接后的片段與感受態(tài)細(xì)胞混合保溫， 可以進(jìn)入感受態(tài)細(xì)胞。進(jìn)入感受態(tài)細(xì)胞的分子通過復(fù)制、表達(dá)，實(shí)現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移， 使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。將經(jīng)過轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞在選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)，即可篩選出轉(zhuǎn)化體，即帶有異源DNA 分子的受體細(xì)胞。目的：連接上目的基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌是為了讓目的基因在大腸桿菌里擴(kuò)增，然后提取質(zhì)粒。器材 ：恒溫?fù)u床 ,電熱恒溫培養(yǎng)箱,臺式高速離心機(jī),無菌工作臺 ,低溫冰箱 , 恒溫水浴鍋 ,制冰機(jī) , 分光光度計 ,微量移液槍。試劑 ： 1.LB 固體和液體培養(yǎng)基7 2. 含特定抗生素的LB 固

13、體培養(yǎng)基3.100mM CaCl2 溶液。 4.待轉(zhuǎn)化質(zhì)粒大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備步驟：1）從大腸桿菌平板上挑取一個單菌落于3mlLB 液體培養(yǎng)基，37 振蕩培養(yǎng)過夜（12h左右），直至對數(shù)生長期。2）取 0.4ml 菌液轉(zhuǎn)接到40mlLB 液體培養(yǎng)基中，37振蕩培養(yǎng)23h，至 OD600 值達(dá)到0.5-0.6 之間。3）菌液轉(zhuǎn)移到50ml 離心管中，冰上放置10min 。4） 4離心 10min （ 4000r/min ）5）倒出培養(yǎng)液，將管口倒置以便培養(yǎng)液流盡6）用冰浴的0.1mol/L 氯化鈣 10ml 懸浮細(xì)胞，立即冰浴30min7） 4離心 10min （ 4000r/min ）8）倒

14、出上清液，用冰浴的0.1mol/L 氯化鈣 2ml 懸浮細(xì)胞（冰上放置）9）分裝細(xì)胞， 200ul 一份， 4保存。暫且不用的貯存于-70可保存半年。取其中一份進(jìn)行轉(zhuǎn)化。質(zhì)粒 DNA 的轉(zhuǎn)化1）取 200ul 新鮮制備的感受態(tài)細(xì)胞，加入質(zhì)粒DNA2ul 混勻，冰浴30min2）離心管放到42水浴鍋中保溫90s（ 90s 一定要精確，不要搖動試管）3）將試管迅速轉(zhuǎn)移到冰浴，冷卻1-2min4）每管加800u l LB液體培養(yǎng)基，37培養(yǎng)1h5）取適當(dāng)體積（100ul ）的復(fù)蘇細(xì)胞，涂布在含有適當(dāng)抗生素的LB固體培養(yǎng)基上，用滅過菌的玻璃棒涂布均勻，室溫正置30min6）倒置平皿37， 1216h，

15、出現(xiàn)菌落為了提高轉(zhuǎn)化效率, 實(shí)驗(yàn)中要考慮以下幾個重要因素：1. 細(xì)胞生長狀態(tài)和密度 : 細(xì)胞生長密度以剛進(jìn)入對數(shù)生長期時為好， 可通過監(jiān)測培養(yǎng)液的 OD600 來控制。2. 質(zhì)粒的質(zhì)量和濃度 : 用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒 DNA 應(yīng)主要是超螺旋態(tài) DNA(cccDNA) 。一般情況下 ,DNA 溶液的體積不應(yīng)超過感受態(tài)細(xì)胞體積的5 。3. 試劑的質(zhì)量 : 所用的試劑 ,如 CaCl2 等均需是最高純度的 (GR.或 AR.), 并用超純水配制,最好分裝保存于干燥的冷暗處。4. 防止雜菌和雜 DNA 的污染：整個操作過程均應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行。5抽提質(zhì)粒 （堿裂解法提取質(zhì)粒DNA)原理 ： 本實(shí)驗(yàn)采用堿裂解

16、法進(jìn)行質(zhì)粒的小量制備。十二烷基磺酸鈉（離子表面活性劑，它既能使細(xì)菌細(xì)胞裂解，又能使一些蛋白質(zhì)變性。SDS）是一種陰1）用SDS 處理細(xì)菌后，會導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞破裂，釋放出質(zhì)粒DNA和染色體DNA 。兩種DNA在強(qiáng)堿環(huán)境都會變性。2）當(dāng)加入pH4.8 的酸性乙酸鉀降低溶液pH值后，質(zhì)粒DNA將迅速復(fù)性，而染色體DNA 分子巨大，難以復(fù)性。3）通過離心，大部分細(xì)胞碎片、染色體DNA 、 RNA 及蛋白質(zhì)沉淀（SDS 的作用下）除去，而質(zhì)粒DNA 留在上清中。4）再用異丙醇沉淀、乙醇洗滌，可得到純化的質(zhì)粒DNA 。純化質(zhì)粒DNA 的方法 通常是利用了質(zhì)粒DNA 相對較小及共價閉環(huán)兩個性質(zhì)。例如，氯化銫

17、-溴化乙錠梯度平衡離心、離 子交換層析、 凝膠過濾層析、 聚乙二醇分級沉淀等方法，但這些方法相對昂貴或費(fèi)時。對于小量制備的質(zhì)粒DNA ，經(jīng)過 苯酚、氯仿 抽提， RNA 酶消化和乙醇沉淀等簡單步驟去除殘余蛋白質(zhì)和RNA ，所得純化的質(zhì)粒DNA 已可滿足細(xì)菌轉(zhuǎn)化、 DNA 片段的分離和酶切、常規(guī)亞克隆及探針標(biāo)記等要求，故在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室中常用。試劑：1. 溶液 : 50mM (mmol/L) 葡萄糖， 25mMTris-HCl(pH8.0) ， 10mM EDTA(pH8.0）。1M Tris-HCl(pH 8.0 ）12.5ml ，0.5M EDTA（ pH 8.0 ）10ml，葡萄糖 4.

18、730g，加 ddH2O 至 500ml 。在 10 lbf/in2 高壓滅菌 15min ，貯存于 4。2. 溶液 ： 0.2N NaOH ， 1% SDS。 2N NaOH 1ml ， 10%SDS 1ml ，加 ddH2O 至 10ml 。使用前臨時配置（ NaOH 作用是使細(xì)胞裂解） 。3. 溶液 ：醋酸鉀（ KAc ）緩沖液， pH 4.8 。5M KAc 300ml ，冰醋酸 57.5ml ，加 ddH2O至 500ml 。 4保存?zhèn)溆谩?. TE ：10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0) 。1M Tris-HClEDTA （ pH 8.0 ）

19、 0.2ml，加 ddH2O 至 100ml 。15 lbf/in2 高壓濕熱滅菌5.苯酚 /氯仿 /異戊醇（ 25： 24： 1）6.乙醇（無水乙醇、70%乙醇）（ pH 8.0）1ml ，0.5M 20min ，4保存?zhèn)溆谩?. 5×TBE ：Tris 堿 54g，硼酸 27.5g， EDTA-Na2·2H2O 4.65g ，加 ddH2O 至 1000ml。 15 lbf/in2 高壓濕熱滅菌 20min ， 4保存?zhèn)溆谩?溴化乙錠（EB）： 10mg/ml9.RNase A （ RNA 酶 A）：不含 DNA 酶 (DNase-free) RNase A 的 10m

20、g/ml ，TE 配制，沸水加熱 15min ，分裝后貯存于 -20。10. 6×loading buffer （上樣緩沖液） ：0.25%溴酚藍(lán)， 0.25%二甲苯青 FF，40%（ W/V ）蔗糖水溶液。11. 1% 瓊脂糖凝膠：稱取1g 瓊脂糖于三角燒瓶中，加100ml 0.5TBE× ，微波爐加熱至完全溶化，冷卻至60左右，加EB 母液（ 10mg/ml ）至終濃度0.5 g/ml（注意： EB 為強(qiáng)誘變劑，操作時帶手套），輕輕搖勻。緩緩倒入架有梳子的電泳膠板中，勿使有氣泡，靜置冷卻30min 以上，輕輕拔出梳子，放入電泳槽中（電泳緩沖液0.5 ×TBE

21、），即可上樣。儀器： (1)塑料離心管架（30 孔）；(2) 10、 100、1000L 微量加樣器；(3) 1.5mL 塑料離心管（又稱EPPendorf 離心管）；(4) 低溫高速離心機(jī)（20 000 r min ）一臺； (5)無菌工作臺(6) 高壓鍋， (7) 常用玻璃儀器及滴管等。質(zhì)粒提取步驟：1. 挑取 LB 固體培養(yǎng)基上生長的單菌落，接種于2.0ml LB （含相應(yīng)抗生素）液體培養(yǎng)基中，37、 250g 振蕩培養(yǎng)過夜（約 12-14hr）。2.取 1.5ml 培養(yǎng)物入微量離心管中，室溫離心8000g ×1min ，棄上清，將離心管倒置，使液體盡可能流盡。3.將細(xì)菌沉淀重

22、懸于 100 l預(yù)冷的溶液（ 50mM葡萄糖， 25mM Tris-HCl(pH 8.0)， 10mMEDTA(pH 8.0 ）中，劇烈振蕩，使菌體分散混勻，（且不至于沉淀） 。4. 加 200 l新鮮配制的溶液，顛倒數(shù)次混勻（不要劇烈振蕩），并將離心管放置于冰上2-3min ，使細(xì)胞膜裂解（溶液為裂解液，故離心管中菌液逐漸變清）。5.加入 150 l預(yù)冷的溶液（醋酸甲AcK ），將管溫和顛倒數(shù)次混勻，見白色絮狀沉淀，可在冰上放置 3-5min 。溶液為中和溶液，此時質(zhì)粒DNA 復(fù) 性，染色體和蛋白質(zhì)不可逆變性，形成不可溶復(fù)合物，同時K+ 使 SDS-蛋白復(fù)合物沉淀。6.加入 450 l的苯酚

23、 /氯仿 /異戊醇，振蕩混勻，4 離心 12000g× 10min 。沒有用 PDS 沉淀干凈的蛋白質(zhì)置于下層7.小心移出上清于一新微量離心管中，加入2.5倍體積預(yù)冷的無水乙醇，混勻，室溫放置2-5min ， 4離 心 12000g ×15min 。8.1ml 預(yù)冷的 70%乙醇洗滌沉淀 1-2次， 4離心8000g ×7min ，棄上清，將沉淀在室溫下晾干。9. 沉淀溶于 20 l TE（含 RNase A 20 g/ml）， 37水浴 30min 以降解 RNA 分子， -20保存?zhèn)溆谩?重組質(zhì)?？寺〉蔫b定1）通過 PCR方法鑒定：以重組質(zhì)粒為模板，PCR產(chǎn)物

24、的特異性引物或載體的通用引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增后電泳鑒定。2 ）酶切鑒定：雙酶切鑒定時只要出現(xiàn)質(zhì)粒條帶和你的插入片段的目的條帶就行了7. 質(zhì)粒 DNA的含量及純度鑒定實(shí)驗(yàn)材料： 質(zhì)粒 DNA儀器： (1) 穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(2)可調(diào)微量移液器(3) 水平電泳槽（4）紫外分光光度計(5) 紫外透射儀等試劑：（ 1）電泳緩沖液：Tris-硼酸（ 1× TBE） pH8.0 。（ 2）加樣緩沖液（6×）：0.25%溴酚藍(lán)， 40%蔗糖（ 3)溴化乙錠（ EB）溶液： 10mg/ml含量測定：紫外吸收法溴化乙錠熒光強(qiáng)度法純度鑒定：紫外吸收法和瓊脂糖凝膠電泳測定 DNA濃度的方法有兩種：

25、紫外光吸收法：核酸在260nm 處具有強(qiáng)吸收峰，所以通過測定260nm 的吸收峰即可對DNA進(jìn)行定量。但有時也會因?yàn)樗幦芤旱膒H 值不同而導(dǎo)致吸光系數(shù)的不同。因此，一般在中性 pH 值左右的環(huán)境中進(jìn)行測定。這種方法常用于測定比較純的樣品。溴化乙錠熒光強(qiáng)度法：當(dāng) DNA含量很低以及樣品中雜質(zhì)含量高時，會影響紫外光吸收值的測定，這時， 可以采用測定嵌入DNA中溴化乙錠分子受紫外光激發(fā)而發(fā)射出的熒光強(qiáng)度，因?yàn)檫@種熒光的強(qiáng)度與DNA總質(zhì)量數(shù)成正比。測定質(zhì)粒DNA純度的方法瓊脂糖凝膠電泳四、慢病毒包裝流程4.1 實(shí)驗(yàn)材料、細(xì)胞株 ： 293T ，慢病毒的包裝細(xì)胞，為貼壁依賴型成上皮樣細(xì)胞，生長培養(yǎng)基為

26、 DMEM 8( 含 10% FBS) 。貼壁細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)生長增殖形成單層細(xì)胞。、菌株 ：大腸桿菌菌株DH5 。用于 擴(kuò)增慢病毒載體和輔助包裝載體質(zhì)粒。、病毒載體系統(tǒng)組成a) pGC-LV 重組載體（已制備好的）； b) pHelper 1.0 ； c) pHelper 2.0DNA 溶液的制備（見上面具體步驟）：質(zhì)粒 DNA 溶于除菌的TE 中，以紫外光吸收法測定其濃度及純度，保證所提質(zhì)粒DNA的 A260/A280 在 1.8 2.0 之間。、試劑臺盼蘭、胎牛血清FBS、 DMSO 、 DMEM、胰酶、Lipofectamine 2000、儀器熒光顯微鏡、CO2 培養(yǎng)箱、生物安全柜、Plus

27、-20離心超濾裝置4.2 病毒包裝細(xì)胞293T 的培養(yǎng)、活細(xì)胞計數(shù)（臺盼藍(lán)染色）用無血清培養(yǎng)基 把細(xì)胞懸液稀釋到200 2000 個 /ml ( 一般稀釋倍數(shù)為100 倍 )，在 0.1ml的細(xì)胞懸液中加入0.1 ml 的 0.4%的臺盼蘭溶液。輕輕混勻，數(shù)分鐘后，用血球計數(shù)板計數(shù)細(xì)胞。活細(xì)胞排斥臺盼蘭，因而染成藍(lán)色的細(xì)胞是死細(xì)胞。、細(xì)胞株的凍存672 在 1 ml 細(xì)胞凍存管中加入0.5 ml 細(xì)胞懸液， 0.4 ml 小牛血清和0.1 ml 二甲基亞砜9( 或甘油 )，混勻后密封。置4 1 小時， -20 2 小時，然后直接放入液氮中或置液氮蒸汽上過夜后浸入液氮中。、細(xì)胞復(fù)蘇1 從液氮罐中

28、取出細(xì)胞凍存管，應(yīng)帶有防護(hù)眼睛和手套。2 迅速放入盛有37水的水浴中，并不時搖動，盡快解凍 。3 用 70%酒精擦拭消毒后，移至凈化臺上，吸出細(xì)胞懸液至培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)加3 ml 含10% FBS （胎牛血清）的DMEM 培養(yǎng)基，置溫箱培養(yǎng)。4 次日更換一次培養(yǎng)液后再繼續(xù)培養(yǎng)。、細(xì)胞傳代1 棄去舊培養(yǎng)液，加入5 ml 滅菌 PBS 溶液，輕輕晃動，洗滌細(xì)胞生長面，然后棄去PBS溶液。2 加入 2 ml 胰酶消化液，消化1- 2 min 直到細(xì)胞完全消化下來。3 加入含 10%胎牛血清和100 U/ml 雙抗的 DMEM 培養(yǎng)基 5 ml ，用刻度吸管吹打數(shù)次，將瓶壁上的細(xì)胞沖洗下來。4 混勻細(xì)胞后

29、分至兩個新的培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)。4.3慢病毒包裝細(xì)胞轉(zhuǎn)染1) 轉(zhuǎn)染前 24 h，用胰蛋白酶消化 對數(shù)生長期的 293T 細(xì)胞，以含 10% 血清的培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為 1.2 x 10 7 細(xì)胞 /20 ml ，重新接種于 15 cm 細(xì)胞培養(yǎng)皿， 37 、 5% CO2 培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。24 h 待細(xì)胞密度達(dá) 70% 80%時即可用于轉(zhuǎn)染。 細(xì)胞狀態(tài)對于病毒包裝至關(guān)重要，因此 需要保證良好的細(xì)胞狀態(tài)和較少的傳代次數(shù)。2) 轉(zhuǎn)染前 2 h 將細(xì)胞培養(yǎng)基更換為無血清培養(yǎng)基。3) 向一滅菌離心管中加入所制備的各DNA 溶液 (pGC-LV 載體 20 g ，pHelper 1.0 載體 15 g，p

30、Helper 2.0 載體 10 g)，與相應(yīng)體積的Opti-MEM 10 混合均勻， 調(diào)整總體積為2.5 ml ，在室溫下溫育5 分鐘。4) 將 Lipofectamine 2000 試劑輕柔搖勻，取100 l Lipofectamine 2000試劑在另一管中與 2.4 ml Opti-MEM混合，在室溫下溫育5 分鐘。5) 把稀釋后的 DNA 與稀釋后的 Lipofectamine 2000 進(jìn)行混合， 輕輕地顛倒混勻，不要振蕩。 必須在 5 分鐘之內(nèi)混合。6) 混合后，在室溫下溫育 20 分鐘，以便形成 DNA 與 Lipofectamine 2000 稀釋液的 轉(zhuǎn)染復(fù)合物。7) 將

31、DNA 與 Lipofectamine 2000 混合液轉(zhuǎn)移至 293T 細(xì)胞的培養(yǎng)液中， 混勻，于 37 , 5% CO2 細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。8) 培養(yǎng) 8 h 后倒去含有轉(zhuǎn)染混和物的培養(yǎng)基，每瓶細(xì)胞加入20 ml 的 PBS 液，輕輕左右晃動一下培養(yǎng)瓶以洗滌殘余的轉(zhuǎn)染混和物，然后倒去。9) 每瓶細(xì)胞中加入含10% 血清的細(xì)胞培養(yǎng)基25 ml ，于 37 、5% CO2 培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)48 小時。4.4 病毒的收獲及濃縮1收集轉(zhuǎn)染后 48小時（轉(zhuǎn)染即可為 0 小時計起）的 293T細(xì)胞上清液。2于 4 ， 4000 g 離心 10 min ，除去細(xì)胞碎片。3以 0.45 m 濾器過濾上清液

32、于 40 ml 超速離心管中。4把病毒粗提液樣品加入到過濾杯中（最多19 ml ），蓋上蓋子。將過濾杯插到濾過液收集管中。5組合好后，做好平衡，放在轉(zhuǎn)頭上。6在 4000 × g 離心，至需要的病毒濃縮體積。通常需要的時間為10-15 分鐘。7離心結(jié)束后，取出離心裝置，將過濾杯和下面的濾過液收集杯分開。8將過濾杯倒扣在樣品收集杯上。9離心力不超過1000g,時間為 2 分鐘。過高轉(zhuǎn)速會導(dǎo)致樣品損失。把離心杯從樣品收集杯上移開。樣品收集杯中的即為病毒濃縮液。10 將病毒濃縮液移出，分裝后保存在病毒管中，-80度長期保存。取其中一支進(jìn)行病毒生物學(xué)滴度測定。4.5 慢病毒滴度測定1) 孔稀

33、釋法測定滴度1測定前一天，為測定滴度所需的細(xì)胞（英茂盛業(yè)公司用的293T細(xì)胞：貼壁生長）鋪板， 96 孔板，每個孔加4×104 個細(xì)胞，體積為100l 。2根據(jù)病毒的預(yù)期滴度， 準(zhǔn)備 710 個無菌的 Ep 管。在每個管中加入90 l 的無血清培養(yǎng)基。3取待測定的病毒原液 10 l 加入到第一個管中，混勻后，取10 l 加入到第二個管中。繼續(xù)相同的操作直到最后一管。4選取所需的細(xì)胞孔，吸去90 l 培養(yǎng)基，丟棄。加入90 l 稀釋好的病毒溶液。放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。5 24 小時后，加入完全培養(yǎng)基100 l。小心操作，不要吹起細(xì)胞。6 4 天后，觀察熒光表達(dá)情況。熒光細(xì)胞數(shù)隨稀釋倍數(shù)的增加

34、而減少。說明：第一個 Ep 管中加入 10ul 病毒原液，記為1E+1 l ；第二個 Ep 管中進(jìn)行了第一次十倍稀釋,所得病毒原液為第一個Ep 中的 1/10，記為 1E+0l ；第三個 Ep 管中進(jìn)行了第二次十倍稀釋，所得病毒原液為第二個Ep 中的 1/10，記為 1E-1 l；依次類推第七個 Ep 管中進(jìn)行了第六次十倍稀釋，所得病毒原液為第六個Ep 中的 1/10，記為 1E-5 l；第八個 Ep 管中進(jìn)行了第七次十倍稀釋，所得病毒原液為第七個Ep 中的 1/10，記為 1E-6 l；2) Realtime 定量 PCR 法測定滴度樣品制備1.檢測前一天，對 293T 細(xì)胞傳代，每個 24

35、 孔中加1× 105 個細(xì)胞，體積為 500 l；2.次日，準(zhǔn)備 710 個無菌的 Ep 管，在每個管中加入90 l 的培養(yǎng)基（ DMEM+10%FBS）；3.取待測定的病毒原液 10 l 加入到第一個管中， 混勻后， 取 10 l 加入到第二個管中。繼續(xù)相同的操作直到最后一管；4. 選取所需的細(xì)胞孔， 吸去 90 l 培養(yǎng)基。加入稀釋好的病毒溶液。 放入 37 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；5. 48 小時后，加入新鮮培養(yǎng)基 500 l。小心操作，不要吹起細(xì)胞；6. 4 天后， 抽提 RNA 準(zhǔn)備做 RT-qPCR。總 RNA 抽提說明：根據(jù)Invitrogen 公司的1.去細(xì)胞上清，

36、每孔加入TRIZOL 操作說明書進(jìn)行，均為RNase-free 操作。l TRIZOL吹打，室溫靜置5 min ，后轉(zhuǎn)移至另一新的1.5ml移液管中。2.每管加入200 l氯仿，用力震蕩15s，室溫靜置15 min 。3. 4， 12000 rpm ，離心 15min 。4. 從每管中吸取上清至另一新的 1.5 ml 移液管。加入等體積 -20預(yù)冷的異丙醇，混勻后 -20沉淀 10 min 。5. 4， 12000 rpm 離心 10 min 后，去上清。6. 加入至少 1 ml 4預(yù)冷的 75%乙醇，洗滌沉淀及離心管壁。7. 4， 10000 rpm 離心 5 min ，棄上清。8.4， 1

37、0000 rpm 再次離心 5 min，吸去殘液，室溫干燥（不需完全干燥） 。9.加入 20 lRNase-free 水 11 ，至完全溶解，紫外分析測定所抽提RNA 的濃度。五、 慢病毒感染目的細(xì)胞慢病毒感染目的細(xì)胞預(yù)實(shí)驗(yàn)注意事項A測定慢病毒對目的細(xì)胞的親嗜性時，需要同時設(shè)置對慢病毒親嗜性較高的細(xì)胞(HEK293T ， Hela ）作為平行實(shí)驗(yàn)的對照細(xì)胞。B在進(jìn)行慢病毒感染實(shí)驗(yàn)時,可以用完全培養(yǎng)基（培養(yǎng)目的細(xì)胞用）稀釋；理論上，含有血清，雙抗或者其他營養(yǎng)因子的完全培養(yǎng)基不影響慢病毒的感染效率。慢病毒幾乎可以感染所有種類的細(xì)胞。加入puromycin12 可以篩選穩(wěn)定表達(dá)shRNA的細(xì)胞系。p

38、uromycin最優(yōu)濃度篩選:每種細(xì)胞對puromycin的敏感性不同，因此，準(zhǔn)備建立穩(wěn)定細(xì)胞系之前，需要確定能夠在 3-5 天殺死細(xì)胞的最優(yōu)puromycin濃度。方法如下：1. 在 6 孔板內(nèi)種植細(xì)胞，約 2x10 5/孔，共十孔， CO2 孵箱過夜培養(yǎng)。2. 第二天，觀察細(xì)胞密度為80%-90% 融合。稀釋 puromycin至培養(yǎng)基，按照從 1 g/ ml到 10 g/ ml ，每隔 1g/ ml 遞增的濃度，加至培養(yǎng)孔內(nèi)。3. 第三天觀察細(xì)胞，每隔一天換一次培養(yǎng)基，最優(yōu)濃度為在3-5 天內(nèi)殺死所有細(xì)胞的濃度。慢病毒感染細(xì)胞和穩(wěn)定細(xì)胞系篩選第一天：在 60mm 培養(yǎng)皿內(nèi)種植細(xì)胞，細(xì)胞密

39、度為第二天細(xì)胞融合能達(dá)到70%-80% ，CO2 孵箱過夜培養(yǎng)。第二天：準(zhǔn)備 3ml 培養(yǎng)基，加入Polybrene13 ，終濃度為 8 g/ ml 。將步驟五制備的病毒顆粒 0.5 ml 加至上述培養(yǎng)基，輕吹混勻。去除60mm 培養(yǎng)皿內(nèi)的舊的培養(yǎng)基，加入含病毒培養(yǎng)基 （Polybrene 能夠增加病毒感染的效率，然而，有時候 Polybrene 對細(xì)胞有毒性。這時，可以用 Protamine Sulfate 代替 Polybrene）第三天：病毒感染后 24 小時，可以換用含最優(yōu)濃度puromycin 的培養(yǎng)基。如果病毒對細(xì)胞有毒性，可以減少感染時間至4-6 小時，然后換用新鮮培養(yǎng)基， 24-48小時后換加含 puromycin 的培養(yǎng)基。最好設(shè)立一個對照皿，不加病毒液，加入Ploybrene ，觀察 Polybrene 是否對細(xì)胞有毒性；如果Polybrene沒有毒性，還可以加入 puromycin ，作為 puromycin 是否有效的對照。第四天以后：每隔一天換用新鮮含puromycin的培養(yǎng)基，以替換含大量死細(xì)胞的培養(yǎng)基。