常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理及應(yīng)用

1、目目 錄錄常用分子生物學(xué)技術(shù)常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理及應(yīng)用的原理及應(yīng)用The Popular Technology in Molecular Biology: Principle and Application目目 錄錄第第 一一 節(jié)節(jié)分子雜交與印跡技術(shù)分子雜交與印跡技術(shù)Molecular Hybridization & Blotting Technology目目 錄錄核酸分子雜交核酸分子雜交 (nucleic acid hybridization ) 在在DNA復(fù)性過程中，如果把不同復(fù)性過程中，如果把不同DNA單鏈分單鏈分子放在同一溶液中，或把子放在同一溶液中，或把DNA與與RNA放

2、在一起，放在一起，只要在只要在DNA或或RNA的單鏈分子之間有一定的的單鏈分子之間有一定的堿基堿基配對(duì)配對(duì)關(guān)系，就可以在不同的分子之間形成關(guān)系，就可以在不同的分子之間形成雜化雙雜化雙鏈鏈(heteroduplex) 。一、分子雜交與印跡技術(shù)的原理一、分子雜交與印跡技術(shù)的原理目目 錄錄復(fù)性復(fù)性RNADNA目目 錄錄（一）印跡技術(shù)（一）印跡技術(shù)（二）探針技術(shù)（二）探針技術(shù) 探針探針 (probe) 一小段用同位素、生物素或熒光染料標(biāo)標(biāo)記一小段用同位素、生物素或熒光染料標(biāo)標(biāo)記其末端或全鏈的已知序列的多聚核苷酸，與固定其末端或全鏈的已知序列的多聚核苷酸，與固定在在NC膜上的核苷酸結(jié)合，判斷是否有同源的

3、核膜上的核苷酸結(jié)合，判斷是否有同源的核酸分子存在。酸分子存在。 目目 錄錄二、印跡技術(shù)的類別及應(yīng)用二、印跡技術(shù)的類別及應(yīng)用（一）（一）DNA印跡技術(shù)印跡技術(shù) (Southern blotting) 用于基因組用于基因組DNA、重組質(zhì)粒和噬菌體的分析。、重組質(zhì)粒和噬菌體的分析。（二）（二）RNA印跡技術(shù)印跡技術(shù) (Northern blotting) 用于用于RNA的定性定量分析。的定性定量分析。（三）蛋白質(zhì)的印跡分析（三）蛋白質(zhì)的印跡分析 (Western blotting) 用于蛋白質(zhì)定性定量及相互作用研究。用于蛋白質(zhì)定性定量及相互作用研究。 目目 錄錄 其他其他斑點(diǎn)印斑點(diǎn)印跡跡 (dot

4、blotting) 原位雜交原位雜交 (in situ hybridization)DNA點(diǎn)陣點(diǎn)陣 (DNA array) DNA芯片技術(shù)芯片技術(shù) (DNA chip)目目 錄錄三種印跡技術(shù)的比較三種印跡技術(shù)的比較分子雜交實(shí)驗(yàn)分子雜交實(shí)驗(yàn)?zāi)磕?錄錄放放射射自自顯顯影影照照片片目目 錄錄目目 錄錄DNA點(diǎn)陣點(diǎn)陣目目 錄錄目目 錄錄第第 二二 節(jié)節(jié) 聚聚 合合 酶酶 鏈鏈 反反 應(yīng)應(yīng)Polymerase Chain Reaction5 Primer 15 Primer 2Cycle 2Cycle 15 5 5 5 5 5 Template DNA5 5 5 5 5 5 5 5 一、基本工作原理一、

5、基本工作原理目目 錄錄Cycle 35 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2530 次循環(huán)后，模板次循環(huán)后，模板DNA的的含量可以擴(kuò)大含量可以擴(kuò)大100萬倍以上。萬倍以上。目目 錄錄目目 錄錄n模板模板DNAn 特異性引物特異性引物n耐熱耐熱DNA聚合酶聚合酶n dNTPsn Mg2+ 二、二、PCRPCR體系基本組成成分體系基本組成成分目目 錄錄三、三、PCR的基本反應(yīng)步驟的基本反應(yīng)步驟變性變性95C延伸延伸72C退火退火Tm-5C目目 錄錄（一）目的基因的克?。ㄒ唬┠康幕虻目寺。ǘ┗虻捏w外突變（二）基因的體外突變（三）（三）DNA和和RNA的微量分析的微量分

6、析（四）（四）DNA序列測(cè)定序列測(cè)定（五）基因突變分析（五）基因突變分析四、四、PCR的主要用途的主要用途目目 錄錄三、幾種重要的三、幾種重要的PCR衍生技術(shù)衍生技術(shù)（一）反轉(zhuǎn)錄（一）反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)技術(shù)（二）原位（二）原位PCR技術(shù)技術(shù)（三）實(shí)時(shí)（三）實(shí)時(shí)PCR技術(shù)技術(shù)實(shí)時(shí)實(shí)時(shí)PCRPCR技術(shù)原理技術(shù)原理目目 錄錄目目 錄錄第第 三三 節(jié)節(jié) 核核 酸酸 序序 列列 分分 析析Nucleic Acid Sequence Analysis目目 錄錄核酸序列分析的基本原理核酸序列分析的基本原理化學(xué)裂解法化學(xué)裂解法 (Maxam-Gillbert法法)DNA鏈的末端合成終止法鏈的末端合成終止法 (s

7、anger法法)目目 錄錄一、化學(xué)裂解法一、化學(xué)裂解法( (Maxam-Gillbert法法) )基本原理基本原理基于某些化學(xué)試劑可以使基于某些化學(xué)試劑可以使DNADNA鏈在鏈在1 1個(gè)或個(gè)或2 2個(gè)個(gè)堿基處發(fā)生專一性斷裂的特性，精確地控制反應(yīng)堿基處發(fā)生專一性斷裂的特性，精確地控制反應(yīng)強(qiáng)度，使一個(gè)斷裂點(diǎn)僅存在于少數(shù)分子中，不同強(qiáng)度，使一個(gè)斷裂點(diǎn)僅存在于少數(shù)分子中，不同分子在不同位點(diǎn)斷裂，從而獲得一系列大小不同分子在不同位點(diǎn)斷裂，從而獲得一系列大小不同的的DNADNA片段，將這些片段經(jīng)電泳分離。片段，將這些片段經(jīng)電泳分離。分析前，用同位素標(biāo)記分析前，用同位素標(biāo)記DNADNA的的5 5 末端，經(jīng)放

8、末端，經(jīng)放射自顯影即可在射自顯影即可在X膠片上讀出膠片上讀出DNADNA鏈的序列。鏈的序列。目目 錄錄二、二、DNA鏈末端合成終止法鏈末端合成終止法目目 錄錄目目 錄錄目目 錄錄三、三、DNA自動(dòng)測(cè)序自動(dòng)測(cè)序采用熒光替代放射性核素標(biāo)記是實(shí)現(xiàn)采用熒光替代放射性核素標(biāo)記是實(shí)現(xiàn)DNA序列序列分析自動(dòng)化的基礎(chǔ)。用不同熒光分子標(biāo)記四種雙脫分析自動(dòng)化的基礎(chǔ)。用不同熒光分子標(biāo)記四種雙脫氧核苷酸，然后進(jìn)行氧核苷酸，然后進(jìn)行Sanger測(cè)序反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)電泳（平板電泳或毛細(xì)管電泳）分離后，通過四種電泳（平板電泳或毛細(xì)管電泳）分離后，通過四種激光激發(fā)不同大小激光激發(fā)不同大小DNA片段上的熒光

9、分子使之發(fā)片段上的熒光分子使之發(fā)射出四種不同波長熒光，檢測(cè)器采集熒光信號(hào)，并射出四種不同波長熒光，檢測(cè)器采集熒光信號(hào)，并依此確定依此確定DNA堿基的排列順序。堿基的排列順序。 目目 錄錄DNA自動(dòng)測(cè)序結(jié)果舉例目目 錄錄目目 錄錄基基 因因 文文 庫庫Gene Library第第 四四 節(jié)節(jié)目目 錄錄基因組基因組DNA文庫文庫 (genomic DNA library)cDNA文庫文庫 (cDNA library) 基因文庫基因文庫 (gene library)是指一個(gè)包含了某一生物體全部是指一個(gè)包含了某一生物體全部DNADNA序列的克隆群體。序列的克隆群體。目目 錄錄基因組基因組DNA文庫文庫

10、目目 錄錄目目 錄錄第一輪篩選第二輪篩選第三輪篩選基因組文庫篩選結(jié)果舉例基因組文庫篩選結(jié)果舉例目目 錄錄疾病相關(guān)基因的克隆與鑒定疾病相關(guān)基因的克隆與鑒定Cloning and Identification of Disease Relative Genes第第 五五 節(jié)節(jié)目目 錄錄克隆疾病相關(guān)基因的策略克隆疾病相關(guān)基因的策略（一）功能性克隆（一）功能性克隆( (functional cloning) )（二）定位克?。ǘ┒ㄎ豢寺?positional cloning)（三）非定位候選基因克隆策略（三）非定位候選基因克隆策略(position- independent candidate ge

11、ne approaches)（四）定位候選基因克隆策略（四）定位候選基因克隆策略(positional candidate gene approaches )目目 錄錄定義定義 從對(duì)一種致病基因的功能的了解出發(fā)，從對(duì)一種致病基因的功能的了解出發(fā)，克隆該致病基因?？寺≡撝虏』?。（一）功能性克?。ㄒ唬┕δ苄钥寺?yīng)用應(yīng)用 生化機(jī)制已明確、基因表達(dá)產(chǎn)物較易得生化機(jī)制已明確、基因表達(dá)產(chǎn)物較易得到部分純化的遺傳性疾病。到部分純化的遺傳性疾病。目目 錄錄克隆方式克隆方式 利用特異性抗體篩選表達(dá)型利用特異性抗體篩選表達(dá)型cDNA文庫；文庫； 根據(jù)已知的部分氨基酸序列合成寡核苷酸作根據(jù)已知的部分氨基酸序列合成

12、寡核苷酸作探針，篩選探針，篩選cDNA文庫。文庫。 功能互補(bǔ)試驗(yàn)功能互補(bǔ)試驗(yàn) (functional complementation assay)利用酵母系統(tǒng)從功能學(xué)角度鑒定致病基因。利用酵母系統(tǒng)從功能學(xué)角度鑒定致病基因。 目目 錄錄（二）定位克?。ǘ┒ㄎ豢寺《x定義從一種致病基因的染色體定位出發(fā)逐步從一種致病基因的染色體定位出發(fā)逐步縮小范圍，最后克隆該基因?？s小范圍，最后克隆該基因。系統(tǒng)的定位克隆工作系統(tǒng)的定位克隆工作 遺傳學(xué)分析遺傳學(xué)分析( (確定致病基因染色體定位確定致病基因染色體定位) )交換分析、連鎖不平衡分析交換分析、連鎖不平衡分析 分子生物學(xué)分析分子生物學(xué)分析染色體異常染色體異

13、常( (缺失、易位等缺失、易位等) )分析、基分析、基因文庫的篩選與基因克隆因文庫的篩選與基因克隆目目 錄錄（三）非定位候選基因克隆策略（三）非定位候選基因克隆策略 由于基因組作圖的完成和分子病理學(xué)的由于基因組作圖的完成和分子病理學(xué)的發(fā)展，人們可以不依靠染色體定位，直接根發(fā)展，人們可以不依靠染色體定位，直接根據(jù)病理學(xué)變化和對(duì)各種基因產(chǎn)物功能的了解，據(jù)病理學(xué)變化和對(duì)各種基因產(chǎn)物功能的了解，預(yù)測(cè)出候選致病基因。預(yù)測(cè)出候選致病基因。目目 錄錄（四）定位候選基因克隆策略（四）定位候選基因克隆策略當(dāng)致病基因的染色體定位確認(rèn)后，當(dāng)致病基因的染色體定位確認(rèn)后，人們可以利用因特網(wǎng)上的基因網(wǎng)站人們可以利用因特網(wǎng)

14、上的基因網(wǎng)站所提供基因序列數(shù)據(jù)，鑒定出候選所提供基因序列數(shù)據(jù)，鑒定出候選致病基因。致病基因。目目 錄錄第第 六六 節(jié)節(jié)遺傳修飾動(dòng)物模型的建立遺傳修飾動(dòng)物模型的建立及應(yīng)用及應(yīng)用The Establishment and Application of Heredity-Modified Animal Model 目目 錄錄轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)基因技術(shù)采用基因轉(zhuǎn)移技術(shù)使目的基因整合入采用基因轉(zhuǎn)移技術(shù)使目的基因整合入受精卵細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞，然后將細(xì)胞導(dǎo)受精卵細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞，然后將細(xì)胞導(dǎo)入動(dòng)物子宮，使之發(fā)育成個(gè)體。入動(dòng)物子宮，使之發(fā)育成個(gè)體。 轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)基因被導(dǎo)入的目的基因被導(dǎo)入的目的基因轉(zhuǎn)基因動(dòng)物轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(

15、 (transgenic animal)目的基因的受體動(dòng)物目的基因的受體動(dòng)物一、轉(zhuǎn)基因技術(shù)一、轉(zhuǎn)基因技術(shù)目目 錄錄核轉(zhuǎn)移技術(shù)核轉(zhuǎn)移技術(shù) 即即動(dòng)物整體克隆技術(shù)動(dòng)物整體克隆技術(shù)，將動(dòng)物，將動(dòng)物體細(xì)胞核全部導(dǎo)入另一個(gè)體的去體細(xì)胞核全部導(dǎo)入另一個(gè)體的去胞核的受精卵內(nèi)，使之發(fā)育成個(gè)胞核的受精卵內(nèi)，使之發(fā)育成個(gè)體，即克隆體，即克隆( (clone)。 二、核轉(zhuǎn)移技術(shù)二、核轉(zhuǎn)移技術(shù)目目 錄錄目目 錄錄基因剔除技術(shù)基因剔除技術(shù)也稱也稱基因靶向基因靶向( (gene targeting) )滅滅活，有目的去除動(dòng)物體內(nèi)某種基因活，有目的去除動(dòng)物體內(nèi)某種基因的技術(shù)。的技術(shù)。三、基因剔除技術(shù)三、基因剔除技術(shù)目目 錄錄

16、四、基因轉(zhuǎn)移和基因剔除技術(shù)在四、基因轉(zhuǎn)移和基因剔除技術(shù)在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用建立動(dòng)物模型建立動(dòng)物模型 單基因決定疾病模型單基因決定疾病模型 基因剔除基因剔除獲得性突變獲得性突變(gain-of-function mutation) 多基因決定疾病模型多基因決定疾病模型目目 錄錄第第 七七 節(jié)節(jié) 生生 物物 芯芯 片片 技技 術(shù)術(shù)Biological Chip Technology目目 錄錄DNA芯片芯片(DNA chip) cDNA芯片芯片(cDNA chip)是指將許多特定的是指將許多特定的DNA片段或片段或cDNA片片段作為探針，有規(guī)律地緊密排列固定于單位段作為探針，有規(guī)律地緊密排列固

17、定于單位面積的支持物上面積的支持物上 。一、基因芯片一、基因芯片(gene chip)目目 錄錄目目 錄錄目目 錄錄是將高度密集排列的蛋白分子作為探針是將高度密集排列的蛋白分子作為探針點(diǎn)陣固定在固相支持物上，當(dāng)與待測(cè)蛋白樣點(diǎn)陣固定在固相支持物上，當(dāng)與待測(cè)蛋白樣品反應(yīng)時(shí)，可捕獲樣品中的靶蛋白，再經(jīng)檢品反應(yīng)時(shí)，可捕獲樣品中的靶蛋白，再經(jīng)檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)靶蛋白進(jìn)行定性和定量分析的一種測(cè)系統(tǒng)對(duì)靶蛋白進(jìn)行定性和定量分析的一種技術(shù)。技術(shù)。二、蛋白質(zhì)芯片二、蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)芯片(protein chip)目目 錄錄第第 八八 節(jié)節(jié)蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù)蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù)Research Techno

18、logy of Interaction of Protein目目 錄錄蛋白質(zhì)之間相互作用以及通過相互作用而蛋白質(zhì)之間相互作用以及通過相互作用而形成的蛋白復(fù)合物是細(xì)胞各種基本功能的主形成的蛋白復(fù)合物是細(xì)胞各種基本功能的主要完成者。幾乎所有的重要生命活動(dòng)，包括要完成者。幾乎所有的重要生命活動(dòng)，包括DNADNA的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)的合成與分泌、的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)的合成與分泌、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和代謝等等，都離不開蛋白質(zhì)之間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和代謝等等，都離不開蛋白質(zhì)之間的相互作用。的相互作用。 蛋白質(zhì)之間相互作用研究的重要性蛋白質(zhì)之間相互作用研究的重要性目目 錄錄酵母雙雜交酵母雙雜交各種親和分析（親和色譜、免疫共沉淀等）各種親和分析（親和色譜、