綠色熒光蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)分子實驗設(shè)計

1、本文檔如對你有幫助，請幫忙下載支持！綠色熒光蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)張歷涵 20彭千 20一、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞并培養(yǎng)1、 原理實驗室提供的質(zhì)粒首先要轉(zhuǎn)入大腸桿菌進(jìn)行培養(yǎng)與增殖， 制備出感受態(tài)的細(xì) 胞，我們就可以方便的將需克隆的質(zhì)粒導(dǎo)入其中， 使其繁殖，就能獲得大量質(zhì)粒。所謂感受態(tài)， 是指細(xì)菌生長過程中的某一階段的培養(yǎng)物， 只有某一生長階段 中的細(xì)菌才能作為轉(zhuǎn)化的受體，能接受外源 DNA 而不將其降解的生理狀態(tài)。感 受態(tài)形成后， 細(xì)胞生理狀態(tài)會發(fā)生改變， 出現(xiàn)各種蛋白質(zhì)和酶， 負(fù)責(zé)供體 DNA 的 結(jié)合和加工等。細(xì)胞表面正電荷增加，通透性增加，形成能接受外來的 DNA 分 子的受體位點等。 本

2、實驗為了把外源 DNA（重組質(zhì)粒）引入大腸桿菌，就必須先 制備能吸收外來 DNA 分子的感受態(tài)細(xì)胞。2、 實驗步驟2.1 DH-5 和 BL-21感受態(tài)細(xì)胞的制備（1）將 04 保存的 DH-5 和 BL-21菌種分別接種在 LB液體培養(yǎng)基中 37 下 250 r/min 過夜培養(yǎng) 16 h 。（2）將分別接種過夜菌： LB按 1:50 的比例接種于 2 mL的 LB液體培養(yǎng)基中， 37 活化培養(yǎng) 23 h 至 OD=0.30.5 。（3）取 1.5 mL菌液轉(zhuǎn)入 EP管中，置于冰上 10 min, 然后于 4 下 5000 r/min 離心 5 min。棄上清液，沉淀加入 0.1 mL預(yù)冷的

3、 0.1 mol/L CaCl2緩和懸菌。冰上 放置 15-30 min 后，4 下 5000 r/min 離心 10 min。（4）棄上清液，沉淀用 0.1 mL預(yù)冷的 0.1 mol/L CaCl2（含 15%甘油）緩和懸菌， 放在 20 冰箱內(nèi)保存。2.2 感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化（1）取制備好的感受態(tài)細(xì)胞 100 l，冰上解凍，均勻懸浮。（2）加入 2 l 酶連產(chǎn)物，輕輕混勻，冰上靜置 10-30 min。（3）42 水浴中熱擊 70 sec 后，冰上放置 2 min。（4）加入 200 l LB液體培養(yǎng)基， 37 ， 50-100 rpm振蕩培養(yǎng) 1 h。（5）取 200 l 懸浮細(xì)胞涂布在

4、含合適抗生素的 LB 固體培養(yǎng)基上，用涂布器 均勻涂布，平皿正放靜置 1-2 h后，封口膜封好平皿， 37 培養(yǎng)倒置 12-16 h。二、質(zhì)粒的提取和瓊脂糖凝膠電泳檢測1、 原理：首先選擇好將綠色熒光蛋白導(dǎo)入大腸桿菌的載體，一般選用 pET-28a 質(zhì)粒， 因為該質(zhì)粒具有多酶切割位點，并且導(dǎo)入外源基因后可以充分表達(dá)。已知 pEGFP-N3 質(zhì)粒上攜帶表達(dá)綠色熒光蛋白的基因，此基因作為目的基因 pET-28a 質(zhì)粒作為載體進(jìn)行重組前需要先提取并檢測。使用 堿 裂 解 法提 取 質(zhì)粒 ， 用 到 3 種溶 液， 溶 液 I： 50 mM 葡 萄 糖、 25 mM Tris-Cl 、 10 mM E

5、DTA ，pH 8.0；溶液 II ：0.2 N NaOH、1% SDS； 溶液 III ：3 M 醋酸鉀、 2 M 醋酸。選用適當(dāng)濃度和適當(dāng) pH 值的 Tris-Cl 溶液來 調(diào)節(jié)溶液 ph。加入的葡萄糖可以使懸浮后的菌不會快速沉積到管子底部。 EDTA本文檔如對你有幫助，請幫忙下載支持！是 Ca2+和 Mg2+ 等二價金屬離子的螯合劑，可以抑制 DNase的活性和微生物生 長。此步驟菌體一定要懸浮均勻，不能有結(jié)塊，否則會降低抽提得率。溶液 II 中 NaOH 是最佳的溶解細(xì)胞的試劑，會使細(xì)胞膜從雙層膜向微囊結(jié)構(gòu)的相變化， SDS為下一步做鋪墊。溶液 III 的作用 SDS 在高鹽濃度下發(fā)

6、生沉淀，同時 SDS 能與蛋白質(zhì)結(jié)合，平均兩個氨基酸上結(jié)合一個 SDS 分子，所以沉淀也將溶液中 的大部分蛋白質(zhì)沉淀下來。 溶液中的 K+置換了 SDS中的 Na+而形成了不溶性的 PDS，高濃度的鹽使沉淀更完全。同時，由于基因組 DNA 很長，容易被 PDS 共 沉淀。2 M 的醋酸可以中和 NaOH，因為長時間的堿性條件會打斷 DNA ?；?組 DNA 一旦發(fā)生斷裂，小于 100 kb 的片斷，就不容易與 PDS 共沉淀。所以堿 處理的時間要短， 而且不得激烈振蕩， 否則最后得到的質(zhì)粒上會有大量的基因組 DNA 污染。這一步操作混合均勻后在冰上放置，可以使 PDS 沉淀更充分。在 pH

7、為 8.0-8.3 時，核酸分子堿基幾乎不解離， 磷酸全部解離， 核酸分子帶 負(fù)電，在電泳時向正極移動。采用適當(dāng)濃度的瓊脂糖凝膠介質(zhì)作為電泳支持物， 在分子篩作用下， 事分子大小和構(gòu)象不同的核酸分子涌動率出現(xiàn)較大的差異， 從 而達(dá)到分離核酸片段檢測其大小的目的。 核酸分子中嵌入熒光染料 （如溴化乙錠） 后，在紫外燈下可觀察到核酸片段所在的位置。 在質(zhì)粒提取的過程中， 由于操作 原因，提取的質(zhì)?？赡苡腥N：線性 DNA 、開環(huán) DNA 、閉環(huán)超螺旋 DNA 。當(dāng) 提取的質(zhì)粒 DNA 電泳時，同一質(zhì)粒 DNA 泳動速度：閉環(huán)超螺旋線狀開環(huán)。 2、 實驗步驟2.1 將目的基因質(zhì)粒的大菌種接種在液體培

8、養(yǎng)基中（相應(yīng)濃度抗生素） ， 37培 養(yǎng)過夜。2.2 收集菌體 將擴(kuò)增的菌體收集 1.5mlEP.管中。每次 4，12000r/min 離心 2min，棄上清液后 重復(fù)一次，棄上清液。2.3 裂解菌體（1）將菌體沉淀重懸于 100 l 用冰預(yù)冷的溶液中，劇烈振蕩 10min.（2）加 200l 新配制的溶液，蓋緊管口，快速顛倒離心管 5 次，以混合內(nèi)溶 物，不可強(qiáng)烈振蕩，放置冰上 5min 左右。（ 3）加 150 l 用冰預(yù)冷的溶液，蓋緊管口，將管倒置后溫和地振蕩10s，使溶液在粘稠的細(xì)菌裂解物分散均勻，置冰上 15min。（4）4、 10000r/min 離心 5min，將上清液轉(zhuǎn)移到另一

9、離心管中，并定量上清 液的體積。2.4 提取質(zhì)粒 DNA（1）加等體積酚：氯仿（ 1： 1），于上清夜中，振蕩混合， 4、10000r/min， 離心 10min，將上清液轉(zhuǎn)移到另一離心管中，冰定量上清液的體積。（2）加2倍體積的無水乙醇和 0.1體積的 3mol/L NaAc ，室溫下沉淀質(zhì)粒 DNA， 振蕩混合，放置 30min。（3）4、12000r/min 離心 30min。小心吸去上清液，將離心管倒置于一張紙巾 上，以使所有液體流出，再將附于管壁的液滴除盡。（4）用冰冷的 1ml70%乙醇洗滌質(zhì)粒 DNA 沉淀 2 次（每次用 500l ），不要攪 起沉淀，棄上清、倒置于濾紙上，使沉

10、淀干燥。（5）保存質(zhì)粒 取適量 TE 緩沖液溶解質(zhì)粒 DNA ，混勻后 -20保存?zhèn)溆谩?.5 DNA 瓊脂糖凝膠電泳的檢測（ 1）裝好制膠裝置 用膠帶將洗凈、干燥的制膠板兩端封好 （一定封嚴(yán)，不能留本文檔如對你有幫助，請幫忙下載支持！縫隙）,使用水平儀，將膠板調(diào)至水平，插入適當(dāng)梳子。（ 2）將 1g 瓊脂糖加入 30ml 1×TAE 電泳緩沖液中，搖勻。在微波爐中加熱至 瓊脂糖完全溶解（冷卻到 60，加入 1l 的 Goldview ，并搖勻），則為 1瓊脂 糖凝膠液。（ 3）將溶解的瓊脂糖（約 50）倒入，室溫冷卻凝固。 （4）充分凝固后小心垂直向上拔出梳子，撕掉兩端的膠布，將凝

11、膠置入電泳槽 中 （注意：DNA 樣品孔應(yīng)朝向負(fù)電極一端 ），加 1×TAE 電泳緩沖液至液面覆蓋凝 膠 1mm 。（ 5）用移液器吸取質(zhì)粒樣品 5l 于封口膜上，再加入 1 l 的 6×加樣緩沖液， 混勻后，小心加入點樣孔。（ 6）打開電源開關(guān)，調(diào)節(jié)電壓至 100V，可見藍(lán)條帶由負(fù)極向正極移動。 （7）當(dāng)藍(lán)條帶移動到距凝膠前沿 12cm 處，停止電泳（ 8）將凝膠置于紫外線透射儀上，打開紫外燈， DNA 存在處顯出熒光條帶。三、PCR、酶切等方法獲取目的基因，酶切連接重組質(zhì)粒1、原理PCR 是一種利用兩種與相反鏈雜交并附著于靶 DNA 兩側(cè)的寡核苷酸引物， 經(jīng)酶促合成特異

12、的 DNA 片段的體外方法。反應(yīng)過程由高溫變性，低溫退火和適 溫延伸等幾步反應(yīng)組成一個循環(huán)， 然后反復(fù)進(jìn)行，使目的的 DNA 得以迅速擴(kuò)增。 置待擴(kuò)增 DNA 于高溫下解鏈成為單鏈 DNA 模板，人工合成的兩個寡核苷酸引 物在低溫條件下分別與目的片段兩側(cè)的兩條鏈互補(bǔ)結(jié)合， DNA 聚合酶在 72將 單核苷酸從引物 3'端開始摻入，沿模板 5'3'方向延伸，合成 DNA 新鏈。目的基因與載體擴(kuò)增后要進(jìn)行重組， 利用共有的酶切位點即 Bam Hl 和 Not I 兩個位點進(jìn)行雙酶切，產(chǎn)生相同的粘性末端便于在 DNA 連接酶的作用下重新連 接。2、實驗步驟2.1 PCR 實驗

13、（1）在 0.2ml EP管內(nèi)配置 PCR反應(yīng)體系一個。（2）混勻后瞬時離心。（3）放入 PCR 儀中，設(shè)置反應(yīng)程序。2.2 酶切實驗（1）分別取兩支 0.2ml EP 管做好標(biāo)記。（2）兩個 EP 管中分別配置兩個體系即各加入一種質(zhì)粒和兩種限制性內(nèi)切酶。（3）將兩支 EP 管混勻后瞬時離心，放入恒溫培養(yǎng)箱 37酶切 1h。（ 4）可取 5l 進(jìn)行電泳檢測。2.3 DNA 的連接重組（1）在 EP管中加入緩沖液，酶切后的載體質(zhì)粒和熒光蛋白質(zhì)粒以及 DNA 連接 酶。（2）EP 管中液體混勻后瞬時離心，放入培養(yǎng)箱 22反應(yīng) 20min，-20下保存 用于轉(zhuǎn)化。四、重組質(zhì)粒導(dǎo)入 DH5擴(kuò)增1、原理

14、重組質(zhì)粒雖已構(gòu)建完畢， 但是為得到大量的重組質(zhì)粒， 需要將重組質(zhì)粒導(dǎo)入 到 DH5中進(jìn)行擴(kuò)增。 為了將重組質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)菌中， 我們首先得使得細(xì)菌處于易 于吸收外源 DNA 得感受態(tài)。其原理是細(xì)菌處于 0，在有 CaCl2存在的低滲溶液本文檔如對你有幫助，請幫忙下載支持！ 中，菌細(xì)胞便會膨脹成球形，易于吸收外源 DNA。再加之轉(zhuǎn)化混合物中的 DNA 形成抗 DNA 酶的羥基 -鈣磷酸復(fù)合物粘附于細(xì)胞表面，經(jīng) 42短時間熱擊處理， 促進(jìn)細(xì)胞吸收 DNA 復(fù)合物。在將重組質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)菌之后， 就需要將細(xì)菌置于非選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng)一段 時間，促使在轉(zhuǎn)化過程中獲得的新的表型得到表達(dá)。 然后， 再將培養(yǎng)的到的

15、細(xì)胞 轉(zhuǎn)接到含有 Kana的 LB 固體培養(yǎng)基上，便可以鑒定和篩選出重組子。 2、實驗步驟（ 1）取出感受態(tài)細(xì)胞 DH5讓其在冰上自然解凍，每 200l 解凍的感受態(tài)細(xì)胞 加入整管連接產(chǎn)物，混勻后冰浴 30 min。（2）42熱沖擊 90 秒，立即置于冰浴 5min。（3）再在感受態(tài)細(xì)胞混合物中加入 0.8ml 的 LB 培養(yǎng)基，于 37的搖床中培養(yǎng) 1h。（4）1h 后，6000r/min 離心 3min，去掉上清液（約留 200l 的培養(yǎng)液），搖勻菌 快。（ 5）用玻璃涂布器將溶液均勻地涂布在含 Kana 的 LB 固體培養(yǎng)基上，正置培養(yǎng) 皿半小時后， 37倒置培養(yǎng)皿過夜。（6）第二天早晨

16、，觀察實驗結(jié)果。五、菌落 PCR 鑒定陽性克隆1、 原理菌落 PCR可不必提取目的基因 DNA，不必酶切鑒定，而是直接以菌體熱解 后暴露的 DNA 為模板進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，省時少力。在實驗過程中，我們特意使用 載體上的通用引物來篩選陽性克隆。2、 實驗步驟（ 1 ）在 0.2ml 的 EP 管內(nèi)配制 25lPCR 反應(yīng)體系一個： 18.5lddH2O， 2.5l10*Buffer ，1.5lMgCl2，1l4*dNTP，0.5l 的引物 1，0.5l 的引物 2，0.5l 的 Taq 酶，挑菌落一個。（ 2）用滅菌槍頭挑單菌落接觸 EP 管內(nèi)，混勻瞬時離心。（3）放入 PCR 儀中，設(shè)置反應(yīng)程序： 94預(yù)變性 5min ； 94變性 30s； 55退火 30s ； 72 延伸 60s；重復(fù) 30次； 72延伸 10min 。 （ 4）取 9l 反應(yīng)液加 1l10*Loading Buffer 做電泳檢測。六、pET-28a-EGFP 的表達(dá)1、 原理 于重組質(zhì)粒導(dǎo)入 DH5擴(kuò)增步驟的原理相同， 首先得到感受態(tài)細(xì)胞， 然后將 pET-28a-EGFP 質(zhì)粒導(dǎo)入其中，在培養(yǎng)基上培養(yǎng)，使其表達(dá)。2、 實驗步驟（1）取出感受態(tài)細(xì)胞 BL21 ，讓其在冰上自由解凍， 5lpET-28a-EGFP 質(zhì)粒加 入 200l 解凍的感受態(tài)細(xì)胞中，輕彈混勻后冰浴 30min。（2）42