人脂肪組織來源干細(xì)胞生物學(xué)特性研究_圖文

1、第50卷第5期2010年9月大連理工大學(xué)學(xué)報(bào)J o u r n a l o f D a l i a n U n i v e r s i t y o f T e c h n o l o g y V o l .50,N o .5S e pt .2010文章編號(hào):1000-8608(201005-0649-07人脂肪組織來源干細(xì)胞生物學(xué)特性研究朱艷霞1,劉天慶*1,宋克東1,姜麗麗1,馬學(xué)虎1,崔占峰2(1.大連理工大學(xué)干細(xì)胞與組織工程研發(fā)中心,遼寧大連116024;2.牛津大學(xué)工程科學(xué)系組織工程與生物處理中心,英國牛津O X 13P J 摘要:為進(jìn)一步研究脂肪組織來源的干細(xì)胞增殖和多向分化潛能,用

2、改進(jìn)的方法分離脂肪組織來源的干細(xì)胞,通過c c k -8檢測細(xì)胞的增殖能力、流式細(xì)胞儀檢測干細(xì)胞相關(guān)表面標(biāo)記的表達(dá)、R T -P C R 對(duì)干細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行分析;并對(duì)分離得到的細(xì)胞向脂肪、軟骨、骨及心肌細(xì)胞誘導(dǎo),觀察其多向分化能力.結(jié)果顯示:采用改進(jìn)的方法,從400600m g 脂肪組織可收獲約5×105個(gè)脂肪組織來源的干細(xì)胞,并且細(xì)胞可以重疊生長1個(gè)月以上,期間細(xì)胞表現(xiàn)出幾個(gè)對(duì)數(shù)增殖期;所有增殖的細(xì)胞其干細(xì)胞相關(guān)表面標(biāo)記都呈陽性表達(dá);轉(zhuǎn)錄因子N a n o g 、O c t -4、S o x -2和R e x -1也呈強(qiáng)陽性表達(dá);A D S C s 向脂肪、骨、軟骨和心肌細(xì)

3、胞誘導(dǎo)分化后能夠分別表達(dá)脂滴、堿性磷酸酶和礦化結(jié)節(jié)、富含黏多糖的軟骨細(xì)胞外基質(zhì),以及少量心肌特異性連接蛋白C o n n e x i n -43,表明A D S C s 具有向多個(gè)胚層細(xì)胞分化的能力.此外,為獲得更多具有強(qiáng)增殖能力的細(xì)胞,根據(jù)生長曲線,對(duì)細(xì)胞進(jìn)行每14d 傳代而非傳統(tǒng)的5d 傳代,發(fā)現(xiàn)所得到的細(xì)胞仍保持強(qiáng)的增殖能力、干細(xì)胞表型以及更強(qiáng)的多向分化潛能.關(guān)鍵詞:脂肪;干細(xì)胞;增殖;倍增時(shí)間;多向分化潛能中圖分類號(hào):Q 813.1;R 318文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A收稿日期:2008-08-10;修回日期:2010-07-20.基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30670525;大連理工大學(xué)

4、青年教師培養(yǎng)基金資助項(xiàng)目(893228.作者簡介:朱艷霞(1980-,女,博士生;劉天慶*(1959-,男,教授,博士生導(dǎo)師,E -m a i l :l i u t qd l u t .e d u .c n .0引言自2001年Z u k 等1證實(shí)吸脂獲得的脂肪組織中存在具有多向分化潛能的細(xì)胞群,脂肪干細(xì)胞(a d i p o s e -d e r i v e d s t e m c e l l s ,A D S C 逐漸被人們認(rèn)識(shí)并進(jìn)入干細(xì)胞研究領(lǐng)域.A D S C 具有與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相似的生物學(xué)特性,并且脂肪組織分布廣泛、體內(nèi)儲(chǔ)備量大,可以多次取材并且損傷小,因此,A D S C 作為

5、組織工程和再生治療的種子細(xì)胞前景十分廣闊.目前國內(nèi)外對(duì)A D S C 體外增殖及定向誘導(dǎo)分化能力認(rèn)識(shí)還存在分歧,研究者們通過不同方法獲得了不同量的脂肪干細(xì)胞1、2,要想獲得高質(zhì)、高量的A D S C ,必須建立一套更簡便有效的分離培養(yǎng)方法.另外,大多數(shù)研究顯示A D S C 的增殖周期是67d ,然而有研究表明A D S C 在增殖2周過程中,細(xì)胞的蛋白合成率和總蛋白量一直持續(xù)增加3.因此,A D S C 的生長特性還有待進(jìn)一步闡明.本實(shí)驗(yàn)改進(jìn)現(xiàn)有的A D S C 體外分離培養(yǎng)方法,對(duì)其獲得率、體外增殖能力等進(jìn)行研究,以期A D S C 為種子細(xì)胞的細(xì)胞治療和組織構(gòu)建提供細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ).1材料和方

6、法1.1脂肪干細(xì)胞的分離培養(yǎng)自外科手術(shù)患者(年齡1660歲皮下獲取正常脂肪組織,約500m g ,無鈣鎂H a n k s 液沖洗,用眼科剪盡量剪破脂肪組織中肉眼可見的細(xì)小血管,沖洗血液后剪碎脂肪組織,移入大玻璃管中,加入0.25%胰蛋白酶(s i g m a 和0.1%膠原酶(I 型,s i g m a (體積比11,37恒溫?fù)u床振蕩消化20m i n .此時(shí)液面分為3層:上層為黃色油狀脂肪細(xì)胞層,中層為脂肪組織層,下層為含單個(gè)核細(xì)胞的液體.吸出下層液體移入含完全培養(yǎng)基(10%胎牛血清(h y c l o n e +高糖D M E M (g i b c o 的離心管中終止消化.在剩余脂肪中加

7、入新的胰酶和膠原酶,重復(fù)以上步驟繼續(xù)消化,重復(fù)23次,將收集到的液體1500r /m i n 離心10m i n ,去除懸浮的脂肪細(xì)胞和脂滴,去上清,向細(xì)胞沉淀中加入含10%胎牛血清D M E M 重懸細(xì)胞,移入培養(yǎng)瓶中,37、5%C O 2培養(yǎng)箱孵育,每23d 換液.細(xì)胞達(dá)到100%融合時(shí),用0.25%胰酶和0.04%E D T A (體積比11消化傳代.1.2細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察使用倒置顯微鏡(I X 70-131,O L Y M P U S 觀察細(xì)胞生長,并對(duì)傳代貼壁生長在培養(yǎng)瓶中的脂肪干細(xì)胞的生長、純化情況及增殖進(jìn)行連續(xù)觀察、攝像.1.3細(xì)胞增殖動(dòng)力學(xué)分析將第4代A D S C 以不同密度6

8、.25×104、1.25×105、2.50×105、5.00×105、1.00×106和2.00×106c e l l s /m L 種于96孔板內(nèi),獲得細(xì)胞密度與光密度值的標(biāo)準(zhǔn)曲線.以5.00×103c e l l s/m L 的密度接種細(xì)胞并分別檢測和繪制第3、7和15代細(xì)胞的生長曲線.采用c c k -8測量細(xì)胞增殖,每100L 培養(yǎng)液中加10L 無菌c c k -8,孵育3h 后在酶聯(lián)免疫檢測儀上測各孔450n m 的光吸收值,參比波長630n m.每組設(shè)置3個(gè)平行對(duì)照,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.當(dāng)細(xì)胞傳至20代時(shí),分別將20代

9、細(xì)胞按傳統(tǒng)的每5d 傳代1次(99%融合和每14d 傳代1次(此時(shí)細(xì)胞重疊生長,兩種傳代方法傳代至25代時(shí),分別繪制2個(gè)25代細(xì)胞的生長曲線.1.4累計(jì)群體倍增時(shí)間根據(jù)生長曲線的指數(shù)增殖期計(jì)算群體倍增時(shí)間.群體倍增時(shí)間T d =T ×l g 2/l g (N t /N 0,T 代表生長曲線中的指數(shù)增殖時(shí)間段,N 0是接種時(shí)的細(xì)胞數(shù),N t 是指數(shù)增殖末期的細(xì)胞數(shù).據(jù)此公式計(jì)算25代細(xì)胞的群體倍增時(shí)間T d .1.5細(xì)胞表面分子測定取第4、20及2個(gè)25代細(xì)胞檢測其干細(xì)胞相關(guān)表面標(biāo)記的表達(dá),操作步驟如下:培養(yǎng)的脂肪干細(xì)胞經(jīng)過消化離心(1000r /m i n ,5m i n 后細(xì)胞重懸

10、;細(xì)胞計(jì)數(shù)后將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×107c e l l s/m L ,分別與人抗C D 13-P E 、C D 29-P E 、C D 34-F I T C 、C D 44-F I T C 、C D 45-F I T C 、C D 105-F I T C 、C D 166-P E 和H L A -D R -P E 作用20m i n ,P B S 洗滌2次后用P B S 重懸細(xì)胞,流式細(xì)胞儀(B D ,S a n J o s e ,C A ,U S A 進(jìn)行檢測.1.6逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(R T -P C R 分別提取第4、20、30及2個(gè)25代細(xì)胞的總R N A ,用合成第1鏈c

11、D N A 試劑盒(T a K a R a,日本逆轉(zhuǎn)錄合成c D N A 、N a n o g、O c t -4、S o x -2和R e x -1的引物分別進(jìn)行擴(kuò)增,G A P D H 作為參照.P C R 產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳,S c i o n I m a ge 圖像分析軟件對(duì)電泳條帶進(jìn)行分析.1.7多向分化潛能的檢測1.7.1成脂肪誘導(dǎo)取第4代及2個(gè)25代細(xì)胞,以1×105c e l l s /m L 的密度接種于24孔板中.當(dāng)細(xì)胞貼壁生長達(dá)80%融合時(shí),換成脂肪誘導(dǎo)試劑1,對(duì)照組加常規(guī)培養(yǎng)液.誘導(dǎo)14d 進(jìn)行油紅染色以觀察細(xì)胞脂滴形成情況.1.7.2成骨誘導(dǎo)當(dāng)細(xì)胞

12、貼壁生長達(dá)80%融合時(shí),換成骨誘導(dǎo)試劑1.細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)1周時(shí)進(jìn)行鈣鈷法堿性磷酸酶(A L P 染色,3周進(jìn)行V o nK o s s a 染色,干燥后鏡下觀察.1.7.3成軟骨誘導(dǎo)取第4代及2個(gè)25代細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度2×107c e l l s /m L ,取10L 滴于24孔板內(nèi),于37培養(yǎng)箱孵育3h 后加軟骨誘導(dǎo)劑1.誘導(dǎo)培養(yǎng)2周后進(jìn)行甲苯胺藍(lán)染色,干燥后顯微鏡下觀察.1.7.4成心肌誘導(dǎo)取第4代及2個(gè)25代細(xì)胞,以1×105c e l l s /m L 的密度接種于24孔板中.當(dāng)細(xì)胞貼壁生長達(dá)80%融合時(shí)加9m o l /L 5-氮胞苷,作用24h 后換新鮮培養(yǎng)基繼

13、續(xù)培養(yǎng)4周.用心肌特異性連接蛋白C o n n e x i n -43進(jìn)行免疫熒光檢測,熒光顯微鏡下觀察.1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用S P S S 12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間比較采用t 檢驗(yàn).P <0.05為有顯著性差異.2結(jié)果2.1細(xì)胞形態(tài)接種后A D S C 在24h 內(nèi)開始貼壁,初為短梭形,細(xì)胞大小不等,核漿比例較大.24d 可見細(xì)胞伸展,大多數(shù)細(xì)胞為長梭形,形態(tài)類似成纖維細(xì)胞,核橢圓形,較大(圖1(a .原代培養(yǎng)的細(xì)胞34d 即達(dá)90%融合,傳代后第3代細(xì)胞生長出現(xiàn)方向性(圖1(b ;體外培養(yǎng)20代以后,細(xì)胞的增殖速度無明顯減慢,細(xì)胞形態(tài)無明

14、顯改變(圖1(c ;30代以后的細(xì)胞體積明顯增大(圖1(d .2.2細(xì)胞增殖動(dòng)力學(xué)在本文的培養(yǎng)條件下,A D S C 可傳至30代以上.從圖2(b 可以看出在最初3dA D S C 處于生長適應(yīng)期,第4d 開始細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期,然而第8d 后細(xì)胞處于生長停滯期.但與其他研究結(jié)果不同的是細(xì)胞并未出現(xiàn)接觸抑制,而是繼續(xù)增056大連理工大學(xué)學(xué)報(bào)第50卷殖到第10d時(shí)達(dá)到又一個(gè)增殖峰值.接下來的幾天,細(xì)胞數(shù)量雖然有所減少,第12d后細(xì)胞又進(jìn)入另一個(gè)對(duì)數(shù)增殖期.從圖2還可以看出,隨著傳代次數(shù)的增加細(xì)胞的增殖能力有所下降.圖2(c顯示了兩種傳代方法得到的第25代細(xì)胞的生長曲線.與圖2(b類似,這兩種細(xì)胞

15、的生長曲線表現(xiàn)出多個(gè)對(duì)數(shù)增殖期和增殖峰值,兩種方法得到的25代細(xì)胞都具有較強(qiáng)的增殖能力 .圖1體外培養(yǎng)的脂肪干細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變F i g.1M o r p h o l o g yc h a n g eo fh A D S C sf r o ms u b c u t a n e o u sf a tt i s s u ec u l t u r e di nv i t r o圖3對(duì)應(yīng)于生長曲線不同時(shí)刻脂肪干細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變F i g.3M o r p h o l o g yc h a n g e so fh A D S Ci na c c o r d a n c ew i t ht h eg r o

16、w t hc u r v e s1 5 6第5期朱艷霞等:人脂肪組織來源干細(xì)胞生物學(xué)特性研究 A D S C P 4A D S C P 20C D 13P E 99.44%(+91.16%(+C D 29P E 78.50%(+74.80%(+C D 34F I T C (-(-C D 44F I T C 83.43%(+83.43%(+C D 45F I T C (-(-C D 105F I T C 68.50%(+60.76%(+C D 166P E 52.91%(+48.98%(+H L A -D R P E(-(-都呈陰性表達(dá).第4代細(xì)胞的陽性表達(dá)率稍高于第20代.本文還發(fā)現(xiàn)每隔14d

17、 傳代得到的25代細(xì)胞干細(xì)胞相關(guān)表面標(biāo)志的表達(dá)率要高于常規(guī)5d 傳代得到的25代細(xì)胞的表達(dá)率(P <0.05.2.4轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)第4和20代細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子N a n o g、O c t -4、S o x -2和R e x -1都呈陽性表達(dá),兩者的表達(dá)率R 沒有顯著性差異.第30代細(xì)胞N a n o g 、O c t -4、S o x -2和R e x -1m R N A 雖然也呈陽性表達(dá),但表達(dá)率明顯低于其他兩代細(xì)胞(P <0.05(圖5(a 、6(a .每14d 傳代得到的25代細(xì)胞N a n o g、O c t -4、S o x -2和R e x -1的表達(dá)率明顯高于每5d 傳

18、代得到的25代細(xì)胞的表達(dá)率(圖5(b 、6(b .表2兩種傳代方法得到的25代細(xì)胞表面C D 標(biāo)志的表達(dá)T a b .2E x pr e s s i o n o f c e l l s u r f a c e C D m a r k e r s o f A D S C o f p a s s a ge 25w i t h t w o s u b c u l t u r e m e t h o d s 抗體結(jié)合的熒光P 25(5P 25(14C D 13P E 96.80%(+99.89%(+C D 29P E 70.80%(+85.70%(+C D 34F I T C (-(-C D 44F

19、I T C 41.03%(+53.37%(+C D 45F I T C (-(-C D 105F I T C 32.61%(+48.10%(+C D 166P E 28.54%(+48.15%(+H L A -D R P E(-(- 圖5不同代數(shù)脂肪干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子m R N A的表達(dá)情況F i g .5T r a n s c r i p t i o n f a c t o r s m R N A e x pr e s s i o n i n h A D S C o f d i f f e r e n t p a s s a ge s 2.5多向分化潛能2.5.1成脂肪潛能A D S C s 經(jīng)

20、脂肪誘導(dǎo)液向脂肪誘導(dǎo)分化5d 后,胞漿內(nèi)出現(xiàn)少量脂滴并逐漸聚集.8d 后,細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變,從長梭形類成纖維細(xì)胞外觀逐漸變圓,并且開始出現(xiàn)充滿脂滴的細(xì)胞.脂肪分化誘導(dǎo)2周后出現(xiàn)了大量的脂滴(圖7(a 1.油紅“O ”染色后細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量256大連理工大學(xué)學(xué)報(bào)第50卷紅染顆粒(圖7(a2、(a3、(a4,證明鏡下所見細(xì)胞內(nèi)顆粒確為脂滴.另外,從半定量分析結(jié)果(圖8可知,第25代細(xì)胞成脂肪能力明顯弱于第4代細(xì)胞.而2個(gè)25代細(xì)胞的成脂肪潛能沒有顯著性差異. 2.5.2成骨潛能A D S C s成骨誘導(dǎo)后約7d長滿單層,生長略慢.細(xì)胞多為梭形,隨時(shí)間延長,密度增高,細(xì)胞呈多層生長,細(xì)胞外分泌基質(zhì)

21、增多.經(jīng)A L P染色后見第4代細(xì)胞具有較強(qiáng)的堿性磷酸酶的活性(圖7(b2,而第25代細(xì)胞誘導(dǎo)7d后堿性磷酸酶的活性明顯低于第4代(圖7(b3、7(b4. 14d時(shí)有局灶型點(diǎn)狀鈣化斑形成,21d時(shí)形成明顯的礦化結(jié)節(jié)沉積,隨誘導(dǎo)時(shí)間增加,結(jié)節(jié)狀沉積愈加明顯,顏色加深.V o nK o s s a染色顯示結(jié)節(jié)狀沉積為黑色(圖7(c2、(c3、(c4,證實(shí)了結(jié)節(jié)狀沉積為鈣鹽沉積.同樣,第25代細(xì)胞形成的鈣化結(jié)節(jié)明顯少于第4代細(xì)胞.2個(gè)25 代細(xì)胞堿性磷酸酶活性圖7脂肪干細(xì)胞多向分化潛能的檢測F i g.7M u l t i-d i f f e r e n t i a t i o np o t e n

22、 t i a l so fh A D S C st o w a r dm e s o d e r m a la n de n d o d e r m a ll i n e a g e s356第5期朱艷霞等:人脂肪組織來源干細(xì)胞生物學(xué)特性研究 大 連 理 工 大 學(xué) 學(xué) 報(bào) 第 卷 和鈣化結(jié)節(jié)形成都沒有顯著性差異（ 圖 ） 細(xì)胞 成軟骨潛能 經(jīng)軟骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)后， 生長相對(duì)變慢， 細(xì)胞由成纖維樣變?yōu)闄E 體積增大， 圓形及三角形， 有的呈腎 形 （ （ ） 導(dǎo) 培 養(yǎng) 圖 ）誘 甲 可 見 細(xì) 胞 周 圍 有 基 質(zhì) 分 泌 苯 胺 藍(lán) 染 色 后， 可見 大 量 異 染 性 基 質(zhì)， 藍(lán) 紫 色

23、 （ （ ） 呈 圖 、 （） （） ， 見 、 ） 表現(xiàn) 為 軟 骨 細(xì) 胞 分 化 特 點(diǎn)（ 圖 ） 但 個(gè) 代細(xì)胞成軟骨潛能沒 有 顯 著 性 差 異， 都 明顯低于第 代細(xì)胞 成心肌潛能 氮胞苷作用 ， 繼續(xù)培 養(yǎng) 周后細(xì)胞重 疊 生 長， 并 沒 有 發(fā) 現(xiàn) 明 顯 的 形 但 態(tài)學(xué)改變和自發(fā) 搏 動(dòng) 的 細(xì) 胞 光 染 色 后 顯 微 鏡 熒 下觀察， 代 少有的幾個(gè)細(xì)胞出現(xiàn) 綠 色 第 熒光（ ） ， 第 代 細(xì) 胞 誘 導(dǎo) 染 色 后 未 見 圖 （ ） 而 綠色熒光（ ） （） 圖 （ 、 ） 峰 如此強(qiáng)的增殖能力是以前報(bào)道 、 中從 未出現(xiàn)過的 雖然 體 外 長 期 傳 代

24、 培 養(yǎng) 后 仍 能 保 持 但 較強(qiáng)的增殖能力， 還 是 隨 著 傳 代 次 數(shù) 的 增 加 有 所下降， 表明傳代 時(shí) 胰 酶 的 作 用 會(huì) 對(duì) 細(xì) 胞 造 成 一 定的損傷 為減少胰酶的作用次數(shù)， 本文將培養(yǎng)至 或 傳 代， 代的細(xì) 胞 分 別 按 常 規(guī) 傳 代， 傳至 代時(shí)發(fā)現(xiàn)每 傳代得到的細(xì)胞增殖力 并 略高于每 傳 代 得 到 的 細(xì) 胞， 且 細(xì) 胞 數(shù) 量 是 常規(guī)傳代的 倍 本文所培養(yǎng)的 其 和 都 呈 陰性表達(dá)， 作為排 除 成 纖 維 細(xì) 胞 的 表 面 這 標(biāo)志也是持續(xù)陰 性 表 達(dá)， 可 以 為 的 自 體 或 同 種 異 體 移 植 提 供 理 論 依 據(jù) 時(shí)

25、、 同 、 、 和 都 呈 陽 性 表 達(dá)， 與 間 其 他 研 究 結(jié) 果 一 致 、 充 質(zhì) 標(biāo) 志 物 持 續(xù) 表 達(dá) 說明貼壁 的 可 以 增 殖 而 沒 有 丟 失 干 細(xì) 胞 相關(guān)的表面標(biāo)志 物， 映 了 向 間 充 質(zhì) 起 源 反 細(xì)胞系的分化能力， 如脂肪、 軟骨和成骨 轉(zhuǎn) 錄 因 子 、 和 ， 、 特 別是 、 和 在指導(dǎo)干細(xì)胞的多向 本 分 化 潛 能 中 起 著 重 要 的 作 用 文 培 養(yǎng) 的 傳至 代時(shí)仍能表達(dá) 、 、 和 而 ， 且 每 隔 傳 代 得 到 的 代細(xì)胞的表達(dá)率 高 于 每 隔 傳 代 得 到 的 細(xì) 胞 圖 脂肪干細(xì)胞分化率的半定量分析 因?yàn)檫@ 個(gè)轉(zhuǎn)錄 因 子 啟 動(dòng)、 持 并 調(diào) 節(jié) 多 能 干 細(xì) 維 胞的分化潛能 ， 因此每隔 傳代得到的細(xì)胞 與常規(guī)傳代的細(xì)胞相比具有更強(qiáng)的分化潛能 討論 用本 文 改 進(jìn) 的 分 離 方 法， 脂 肪 組 每 織平均可獲得 × 個(gè)干細(xì)胞， 比文獻(xiàn)報(bào)道的細(xì) 胞獲得率 高 倍以上 這是因?yàn)楸疚膽?yīng)用