核酸提取經(jīng)驗(yàn)整理(共9頁)

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上一、核酸核苷酸單體聚合而成的生物大分子，是生物細(xì)胞最基本和最重要的成分。一般認(rèn)為，生物進(jìn)化即始于核酸，因?yàn)樵谒猩镔|(zhì)中只有核酸能夠自我復(fù)制。今天已知核酸是生物遺傳信息的貯藏所和傳遞者。一種生物的藍(lán)圖就編碼在其核酸分子中。核酸是1869年米歇爾(F.Miescher)在膿液的白細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的。他當(dāng)時(shí)稱之為核素。阿爾特曼(R.Altmann)于1889年認(rèn)識(shí)其酸性后，定名為核酸。二、核酸的分類和功能核酸分為核糖核酸(RNA)和脫氧核糖核酸(DNA)兩大類。這兩類核酸有某些共同的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，但生物功能不同。DNA貯存遺傳信息，在細(xì)胞分裂過程中復(fù)制，使每個(gè)子細(xì)胞接受與母細(xì)胞結(jié)

2、構(gòu)和信息含量相同的DNA；RNA主要在蛋白質(zhì)合成中起作用，負(fù)責(zé)將DNA的遺傳信息轉(zhuǎn)變成特定蛋白質(zhì)的氨基酸序列。核酸的基本結(jié)構(gòu)單元是核苷酸，核苷酸含有含氮堿基、戊糖和磷酸3種組分。堿基與戊糖構(gòu)成核苷，核苷的磷酸酯為核苷酸。DNA和RNA中的戊糖不同，RNA中的戊糖是D-核糖；DNA不含核糖而含D-2-脫氧核糖(核糖中2位碳原子上的羥基為氫所取代)。核酸就是根據(jù)其中戊糖種類來分類的，DNA和RNA的堿基也有所不同。三、核酸的理化性質(zhì)RNA和核苷酸的純品都呈白色粉末或結(jié)晶，DNA則為白色類似石棉樣的纖維狀物。除肌苷酸、鳥苷酸具有鮮味外，核酸和核苷酸大都呈酸味。DNA、RNA和核苷酸都是極性化合物，一

3、般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有機(jī)溶劑，它們的鈉鹽比游離核酸易溶于水，RNA鈉鹽在水中溶解度可達(dá)40g/L，DNA鈉鹽在水中為10g/L，呈黏性膠體溶液。在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱堿性溶液中較穩(wěn)定。天然狀態(tài)的DNA 是以脫氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于細(xì)胞核中。要從細(xì)胞中提取DNA 時(shí)，先把DNP抽提出來，再把P除去，再除去細(xì)胞中的糖，RNA 及無機(jī)離子等，從中分離DNA。四、細(xì)胞裂解：（一）裂解原理在核酸提取過程中，細(xì)胞裂解是非常重要的。經(jīng)典的裂解液幾乎都含有去污劑 (如 SDS、Triton X-100、NP-40、T

4、ween 20 等) 和鹽 (如 Tris、EDTA、NaCl 等)。鹽的作用，除了提供一個(gè)合適的裂解環(huán)境 (如 Tris)，還包括抑制樣品中的核酸酶在裂解過程中對(duì)核酸的破壞 (如 EDTA)、維持核酸結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定 (如 NaCl) 等。去污劑則是通過使蛋白質(zhì)變性，破壞膜結(jié)構(gòu)及解開與核酸相連接的蛋白質(zhì)，從而實(shí)現(xiàn)核酸游離在裂解體系中。裂解體系中還可能加入蛋白酶，利用蛋白酶將蛋白質(zhì)消化成小的片段，促進(jìn)核酸與蛋白質(zhì)的分開，同時(shí)，也便于后面的純化操作以及獲得更純的核酸。也有直接使用高濃

5、度的蛋白質(zhì)變性劑 (如 GIT、GuHCl 等) 裂解的，該方法已經(jīng)成為了 RNA 抽提的主流，卻不是基因組 DNA 抽提的主流。（二）細(xì)胞的裂解方法細(xì)菌細(xì)胞破碎方法有以下幾種：1）機(jī)械方法：超聲波處理法、研磨法、勻漿法。關(guān)于超聲波處理法，要設(shè)定好超聲時(shí)間和間隙時(shí)間，一般超聲時(shí)間不超過5秒，間隙時(shí)間最好大于超聲時(shí)間。2）化學(xué)試劑法：用含SDS或CTAB的溶液處理細(xì)胞，在一定的pH環(huán)境和變性條件下,細(xì)胞破裂,蛋白質(zhì)變性沉淀,核酸被釋放到水相，pH環(huán)境則由加入的強(qiáng)堿(NaOH)或緩沖液( TE、STE等)提供，表面活性

6、劑或強(qiáng)離子劑可使細(xì)胞裂解、蛋白質(zhì)和多糖沉淀,緩沖液中的一些金屬離子螯合劑( EDTA等)可螯合對(duì)核酸酶活性所必須的金屬離子Mg2+ 、Ca2+ ,從而抑制核酸酶的活性,保護(hù)核酸不被降解。3）反復(fù)凍融法：將細(xì)胞在-20度以下冰凍，室溫融解，反復(fù)幾次，由于細(xì)胞內(nèi)冰粒形成和剩余細(xì)胞液的鹽濃度增高引起溶脹，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)破碎。個(gè)人經(jīng)驗(yàn)一般情況，37,3min，液氮3min,反復(fù)三次即可以。4）酶解法：加入溶菌酶或蝸牛酶、蛋白酶K等，都可使細(xì)胞壁破碎，核酸釋放。蛋白酶還能降解與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì),促進(jìn)核酸的分離。其中溶菌酶能催化細(xì)菌細(xì)胞壁的蛋白多糖N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸殘基間的-(1 ,4)

7、 鍵水解。蛋白酶K能催化水解多種多肽鍵,其在65 及有EDTA、尿素(14mol/ L) 和去污劑(0. 5 %SDS 或 1 %Triton X-100) 存在時(shí)仍保留酶活性,這有利于提高對(duì)高分子量核酸的提取效率。在實(shí)際工作中,酶作用、機(jī)械作用、化學(xué)作用經(jīng)常聯(lián)合使用。具體選擇哪種或哪幾種方法可根據(jù)細(xì)胞類型、待分離的核酸類型及后續(xù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膩泶_定。（三）裂解方法的評(píng)價(jià)含蛋白酶的裂解方法，可以認(rèn)為是抽提基因組 DNA 的首選。裂解包括膜蛋白的游離和與基因組 DNA 相連接的蛋白質(zhì)的游離。蛋白酶的作用

8、是使蛋白質(zhì)變小，故而對(duì)蛋白質(zhì)的游離有巨大的促進(jìn)作用；同時(shí)，巨大的基因組DNA 是很容易“纏”住大分子的東西的，蛋白質(zhì)被蛋白酶消化變小后，則不容易被基因組 DNA “纏”住，有利于蛋白質(zhì)在純化操作中的去除，使最終獲得的基因組 DNA 的純度更高。另外一個(gè)思路是，如果基因組 DNA 與蛋白質(zhì) “纏”在一起，在純化的過程中有兩種可能：如果基因組 DNA 的特性占優(yōu)勢(shì)，則純化時(shí)以 DNA 的形式被保留下來，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的殘留；如果蛋白質(zhì)的特性占優(yōu)勢(shì)，則純化時(shí)以蛋白質(zhì)的形式被去除，導(dǎo)致 

9、DNA 的損失。當(dāng)然去污劑裂解方法，仍然在細(xì)胞基因組 DNA 抽提方面有優(yōu)勢(shì)，尤其是當(dāng)?shù)寐屎图兌纫蟛皇亲罡?，而?jīng)濟(jì)性及操作簡(jiǎn)單很重要時(shí)?？刂坪昧呀庖?樣品的比例是該方法成功的關(guān)鍵。該方法結(jié)合高鹽沉淀，可以實(shí)現(xiàn)最簡(jiǎn)單的操作，但純度及得率的穩(wěn)定性可能會(huì)比用PC抽提的差一些。高濃度蛋白質(zhì)變性劑 (如 GIT、GuHCl 等) 的裂解方法，是抽提 RNA 的首選。總 RNA 的抽提，最重要的是快速裂解細(xì)胞膜，至于與基因組 DNA 相連接的蛋白質(zhì)的裂解以及基因組與蛋白質(zhì)&#

10、160;“纏”住的問題，因?yàn)槎疾粫?huì)對(duì)以后的純化產(chǎn)生大的影響，可以不考慮。高濃度蛋白質(zhì)變性劑能快速破壞細(xì)胞膜，進(jìn)而迅速抑制住細(xì)胞內(nèi)的 RNA 酶，從而確保了 RNA 的完整性。除了極少量不適用該方法的樣品  主要是植物，其它絕大部分樣品的 RNA 的抽提，都可以以高濃度的蛋白質(zhì)變性劑為基礎(chǔ)的。當(dāng)然有些樣品，如肌肉，即使是 RNA 抽提，也強(qiáng)烈建議使用含蛋白酶的裂解液 (或者在操作中的某個(gè)時(shí)候使用蛋白酶消化蛋白質(zhì)) ，原因在于這些樣品中的蛋白質(zhì)，是非常難以去除的。該方法是獲得最大

11、得率和最高純度的基礎(chǔ)。含 CTAB 的裂解液，幾乎成為富含多糖的樣品，如細(xì)菌、植物的基因組 DNA 抽提的首選裂解方法。該方法成功與否與兩個(gè)因素有關(guān)：一是CTAB 的質(zhì)量，二是洗滌的徹底程度。CTAB 的質(zhì)量對(duì)裂解效率有很大的影響，而且，似乎還說不清楚原因，因?yàn)榧词故峭还旧a(chǎn)的純度一樣的 CTAB，批號(hào)不同，效果就可能差別很大。洗滌去除 CTAB 要比其它的鹽難一些，同時(shí)，CTAB 的少量殘留也會(huì)對(duì)酶活性有巨大影響，所以洗滌是否徹底也是該方法成功與否的關(guān)鍵。裂解時(shí)的溫度，多使用 6

12、5C；但如果發(fā)現(xiàn)降解嚴(yán)重或者得率太低，可以試一下 37C 45C 這個(gè)相對(duì)低溫的區(qū)域。SDS 堿裂解法是質(zhì)粒抽提的首選裂解方法，具有快速、得率高、幾乎無基因組 DNA 污染的特點(diǎn)?？刂坪昧呀庖?菌體的比例和操作的溫和是該方法成功的關(guān)鍵。蛋白質(zhì)的沉淀效率在4會(huì)更好一些，所以，加入溶液后在 4靜置一段時(shí)間以及采用 4離心去蛋白質(zhì)，都可以提高質(zhì)量。該方法不一定要使用 PC 純化，但結(jié)合 PC 純化，可以獲得純度很高的質(zhì)粒。RNA 的去除可以靠在溶液中加入 RNase A

13、(100ug/ml) 或者在最后的溶解液中加入 RNase A (25 ug/ml) 來實(shí)現(xiàn)?？偟母杏X是，在溶液中使用 RNase A，RNA 的殘留少一些。不過，經(jīng)典沉淀幾乎沒有辦法徹底去除 RNA 殘留。另外，對(duì)大質(zhì)粒 (50 kb 以上)，該方法可能會(huì)有問題。PCR 模板的簡(jiǎn)易裂解方法，也是使用面很廣的一類方法。該方法的特點(diǎn)是無須純化，樣品被裂解后即可直接取裂解液用于 PCR，非?？焖佟Ｒ舱?yàn)椴患兓?，所以，假陰?#160;(即沒有擴(kuò)增出來的陽性) 比例也比較高。該方

14、法最簡(jiǎn)單的就是反復(fù)凍融法，簡(jiǎn)便快捷，不需任何化學(xué)試劑，凍融離心，PCR檢測(cè)就可以了。如果使用裂解法，那么最簡(jiǎn)單的裂解液就是水，復(fù)雜一點(diǎn)的就會(huì)含有一些不會(huì)抑制后續(xù)的 PCR 反應(yīng)，而且能提高裂解效率，甚至還可能部分消除樣品內(nèi)抑制 PCR 反應(yīng)雜質(zhì)的東西，如 Triton X-100、甲酰胺等。再復(fù)雜一點(diǎn)的就會(huì)含有諸如 Chelex 100 之類的能吸附部分雜質(zhì)的介質(zhì)。操作也非常簡(jiǎn)單，多使用溫度的變化來實(shí)現(xiàn)樣品的裂解，如煮沸、或者高溫-低溫的多次循環(huán)等。該方法最適合從一大堆樣品中找出陽性樣品，但卻不適合用于判斷某一個(gè)樣品是陽性還

15、是陰性。降低樣品使用量可以提高陽性率，因?yàn)闃悠妨康慕档?，同時(shí)意味著 PCR 的抑制物量的降低。裂解液的用量原則是：確保能徹底裂解樣品，同時(shí)使裂解體系中核酸的濃度適中。濃度過低，將導(dǎo)致沉淀效率低，影響得率；濃度過高，去除雜質(zhì)的過程復(fù)雜且不徹底，導(dǎo)致純度下降。另外，裂解液的用量是以樣品中蛋白質(zhì)的含量為基準(zhǔn)的，而不是以核酸含量為基準(zhǔn)，這一點(diǎn)務(wù)必牢記。五、核酸純化就個(gè)人所知，目前在科研領(lǐng)域廣泛使用的核酸純化技術(shù)主要可以分為兩大類：使用介質(zhì)的和不使用介質(zhì)的，使用介質(zhì)的，一次就將核酸與其它所有雜質(zhì)分開；不使用介質(zhì)的，一定是首先將核酸和鹽與大分子雜質(zhì)分開，再通過沉淀核酸使核酸與鹽分開&#

16、160;(PEG 沉淀和 LiCl 沉淀除外)。1）經(jīng)典的使用苯酚/氯仿抽提的純化技術(shù)：細(xì)胞裂解后離心分離含核酸的水相，加入等體積的酚氯仿異戊醇(25 24 1 體積) 混合液。依據(jù)應(yīng)用目的，兩相經(jīng)漩渦振蕩混勻(適用于分離小分子量核酸) 或簡(jiǎn)單顛倒混勻(適用于分離高分子量核酸) 后離心分離。疏水性的蛋白質(zhì)被分配至有機(jī)相，核酸則被留于上層水相。酚是一種有機(jī)溶劑，預(yù)先要用STE 緩沖液飽和，因未飽和的酚會(huì)吸收水相而帶走一部分核酸。酚也易氧化發(fā)黃,而氧化的酚可引起核酸鏈中磷酸二酯鍵斷裂或使核酸鏈交聯(lián)；

17、故在制備酚飽和液時(shí)要加入一特殊物質(zhì)，以防止酚氧化。氯仿可去除脂肪，使更多蛋白質(zhì)變性,從而提高提取效率。異戊醇則可減少操作過程中產(chǎn)生的氣泡。核酸鹽可被一些有機(jī)溶劑沉淀,通過沉淀可濃縮核酸,改變核酸溶解緩沖液的種類以及去除某些雜質(zhì)分子。典型的例子是在酚、氯仿抽提后用乙醇沉淀，在含核酸的水相中加入p H5. 05.5 ，終濃度為0.3M的NaAc 或KAc 后，鈉離子會(huì)中和核酸磷酸骨架上的負(fù)電荷，在酸性環(huán)境中促進(jìn)核酸的疏水復(fù)性。然后加入22. 5 倍體積的乙醇,經(jīng)一定時(shí)間的孵育，可使核酸有效地沉淀。其他的一些有機(jī)溶劑（異丙醇、聚乙二醇( PEG) 等

18、）和鹽類(10. 0mol/ L 醋酸銨、8. 0mol/ L 的氯化鋰、氯化鎂和低濃度的氯化鋅等) 也用于核酸的沉淀。2）使用離子交換介質(zhì)的純化技術(shù)：將裂解液過柱，核酸被聯(lián)結(jié)在離子交換介質(zhì)上；洗滌去除殘留的雜質(zhì)后，用高鹽緩沖液將核酸從介質(zhì)上洗脫下來。再經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)的乙醇/異丙醇沉淀、乙醇洗滌、干燥等操作，獲得純的核酸，溶解于合適的緩沖液中。3）使用吸附介質(zhì)的純化技術(shù)：將裂解液過柱，核酸被吸附介質(zhì)選擇性吸附；洗滌去除殘留的雜質(zhì)后，用水或者合適的低鹽緩沖液將核酸從介質(zhì)上洗脫下來，就可以直接用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。4) 密度梯度離心法：密度梯度離心也用于核酸的分離和分析。

19、雙鏈DNA、單鏈DNA、RNA 和蛋白質(zhì)具有不同的密度，因而可經(jīng)密度梯度離心形式形成不同密度的純樣品區(qū)帶，該法適用于大量核酸樣本的制備，其中氯化銫2溴化乙錠梯度平衡離心法被認(rèn)為是純化大量質(zhì)粒DNA 的首選方法。氯化銫是核酸密度梯度離心的標(biāo)準(zhǔn)介質(zhì),梯度液中的溴化乙錠與核酸結(jié)合，離心后形成的核酸區(qū)帶經(jīng)紫外燈照射，產(chǎn)生熒光而被檢測(cè)，用注射針頭穿刺回收后，通過透析或乙醇沉淀除去氯化銫而獲得純化的核酸。（二）純化方法評(píng)價(jià)PC(P是英文酚的縮寫，C是英文氯仿的縮寫)抽提/醇沉淀方法，是一個(gè)永不過時(shí)的方法。穩(wěn)定、可靠、經(jīng)濟(jì)、方便。PC抽提可以徹底去除蛋白質(zhì)，醇沉淀可以去除鹽，對(duì)于一般的干

20、凈的樣品 (雜質(zhì)為蛋白質(zhì))，該方法完全可以獲得高質(zhì)量的核酸。雖然每次 PC 抽提都會(huì)損失一部分核酸 (因?yàn)椴豢赡軐⑺嗳恳迫?，以及低濃度核酸的醇沉淀效率低，但這些問題都可以靠操作的調(diào)整而得以解決或者減少影響。該方法的最大的問題是不適合大規(guī)模抽提。PC抽提是去除蛋白質(zhì)的一個(gè)非常有效的手段。苯酚能使蛋白質(zhì)變性，變性后的蛋白質(zhì)從水相中被析出，處于苯酚中或者苯酚/水相之間。PC 抽提的關(guān)鍵是，一要混勻徹底，二要用量足夠。徹底混勻，才能確保苯酚與蛋白質(zhì)的充分接觸，使蛋白質(zhì)完全變性。許多人總是擔(dān)心混勻的劇烈程度是否會(huì)對(duì)核酸，尤其是基因組 DN

21、A 造成破壞，實(shí)際上大可不必如此小心。劇烈的混勻操作，是會(huì)部分打斷大分子的基因組 DNA，但該破壞作用不會(huì)強(qiáng)烈到 DNA 變成 10kb 以內(nèi)的小片段。手劇烈晃動(dòng)混勻后，基因組 DNA 的片段，大部分會(huì)大于 20kb，這個(gè)大小，除了一些特別的要求外，對(duì) PCR 和酶切，都是完全適用的。如果要求的片段非常大，如構(gòu)建文庫用，則不能使用劇烈的混勻方法，而只能來回溫和顛倒混勻  此時(shí)的關(guān)鍵是：裂解液的比例要足夠大，使體系不要太粘稠。用量要足夠，是因?yàn)楸椒尤コ鞍踪|(zhì)是有一定的

22、飽和度的。超過了該飽和度，裂解體系中的蛋白質(zhì)不會(huì)被一次去除，必須靠多次抽提，方可徹底去除。另外，體系太粘稠的壞處是，蛋白質(zhì)難以徹底去除，以及基因組 DNA 會(huì)斷裂得更厲害，所以要注意裂解液與樣品的比例。4離心操作有利于更徹底去除蛋白質(zhì)。PC抽提的另外一個(gè)用途是，利用酸性酚可以部分去除 DNA 的特點(diǎn)，在 RNA 抽提時(shí)獲得 DNA 殘留極少的 RNA。不過有一點(diǎn)要提醒的是，有些植物樣品，在去除某些雜質(zhì)之前，是不能使用 PC 抽提的，否則核酸必定降解。高鹽沉淀蛋白質(zhì)/醇沉淀方法，同樣也是

23、一個(gè)非常不錯(cuò)的方法。與 PC 抽提方法相比，除了純度的穩(wěn)定性可能要低一點(diǎn)外，該方法幾乎克服了 PC 抽提的所有缺點(diǎn)。更快、更輕松去除蛋白質(zhì)所伴隨的好處是，可以用于大規(guī)模抽提，不足是純度 (蛋白質(zhì)殘留) 不夠穩(wěn)定。蛋白質(zhì)的沉淀效率在 4會(huì)更好一些。介質(zhì)純化方法，是一個(gè)越來越受到重視的方法。其最大特點(diǎn)是非常適合大規(guī)模核酸抽提，并且因?yàn)槭苋藶椴僮饕蛩赜绊懶。兌鹊姆€(wěn)定性很高 (雖然純度不一定比PC 純化方法更高)。其致命弱點(diǎn)是樣品過量。介質(zhì)可以分為兩大類，一類是柱式的，即介質(zhì)被預(yù)先裝填在下面是通的柱子里；另外一

24、類則是顆粒狀 (如Glassmilk、磁性小珠等)。顆粒狀的介質(zhì)的純化操作與經(jīng)典的醇沉淀差別不大，都是通過數(shù)次的加液-倒液過程，干燥后，溶解即可獲得純化好的核酸。柱式純化的操作雖然也是有加液-倒液過程，但因?yàn)榧尤氲囊后w通過離心后會(huì)進(jìn)入另外一個(gè)離心管中，與含有核酸的柱子完全是分開的，所以洗滌更徹底，操作更省力 (不用操心將核酸倒掉了，或者液體的殘留)。不過，介質(zhì)純化方法的成本是最高的。（三）醇的沉淀1）沉淀的原理目的：目的是使核酸從裂解體系中沉淀下來，從而實(shí)現(xiàn)核酸與其它雜質(zhì)主要是鹽的分離。就核酸而言，標(biāo)準(zhǔn)的醇沉淀要求有一定的鹽及某一比例的醇用量，但這決不是說這些鹽是必不可少的

25、或者醇的比例是不可更改的。實(shí)際操作中不難發(fā)現(xiàn)，當(dāng)裂解體系中核酸的濃度達(dá)到一定水平后，即使體系中不含教科書中建議的鹽，單獨(dú)使用醇也可以使核酸沉淀下來；或者含有鹽，使用低比例的醇也可以使核酸沉淀下來 (當(dāng)然，得率可能會(huì)降低)。知道這一點(diǎn)的意義在于：不要迷信標(biāo)準(zhǔn)方法的唯一性；相反，當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn)方法碰到問題  主要是純度問題時(shí)，完全可以通過調(diào)整沉淀?xiàng)l件來改善。最有參考價(jià)值的是的一個(gè)沉淀方案：一半異丙醇加一半高鹽溶液替代純粹的異丙醇，可以大大降低多糖殘留。另外一個(gè)問題就是，要堅(jiān)信核酸的醇沉淀過程同樣也是其它雜質(zhì)的沉淀過程；調(diào)整醇沉淀的條件，雖然會(huì)降低核酸的得率，但因?yàn)榭梢源蟠?/p>

26、提高純度。2) 沉淀劑的選擇：醇沉淀使用異丙醇還是乙醇，我們并沒有發(fā)現(xiàn)這二者對(duì)質(zhì)量有大的影響。異丙醇沉淀的核酸比較緊湊，帖壁緊，顏色不是很白；乙醇沉淀的核酸比較蓬松，容易從壁上移動(dòng)，顏色比較白。這是現(xiàn)象，少量核酸用異丙醇沉淀，大量核酸用乙醇沉淀。至于異丙醇沉淀更容易沉淀下鹽的說法，我們沒有碰到過，我更覺得出現(xiàn)該現(xiàn)象的原因就在洗滌的不徹底。當(dāng)然，也不要忘記異丙醇沉淀的最大優(yōu)點(diǎn)是體積小，可以使絕大部分的小量抽提操作在 1.5ml 離心管內(nèi)完成。但由于其沉淀物很緊湊，洗滌時(shí)其中心部分不容易被洗滌到，所以，洗滌異丙醇沉淀的核酸的關(guān)鍵是：一定要使沉淀懸浮起來，一定要放置一段

27、時(shí)間使沉淀最終變成蓬松的白色。如果再洗滌一次，質(zhì)量決不會(huì)有問題的。當(dāng)然，沉淀所用的試劑，不僅僅就乙醇和異丙醇，還有包括PEG、LiCl、CTAB 都可以用于核酸沉淀，雖然它們遠(yuǎn)沒有醇沉淀的高使用頻率，但卻各有特點(diǎn)。LiCl 可以沉淀 RNA 以去除 DNA，CTAB 可以從含多糖的裂解體系中將核酸沉淀下來。PEG 是沉淀病毒顆粒的方便手段。 3) 沉淀溫度的選擇：如果核酸抽提的起始樣品是雜質(zhì)比較多時(shí)，原則上不要使用低溫沉淀。低溫沉淀能提高沉淀效率：當(dāng)核酸濃度很低時(shí)，效果明顯；當(dāng)核酸濃度比較高時(shí)，效果不明顯

28、，但卻會(huì)導(dǎo)致雜質(zhì)的大大增加。（四）核酸的洗滌1）洗滌原理與目的：洗滌對(duì)于整個(gè)提取過程來說，也是非常重要的。洗滌，首先一定要將沉淀懸浮起來；第二就是要控制一定的時(shí)間，尤其是當(dāng)核酸沉淀比較大時(shí) (使核酸沉淀最終蓬松)；第三是少量多次；第四則是去上清要徹底。大部分資料中的操作基本上都是“倒掉上清后倒置在吸水紙上片刻”，這一說法，對(duì)于質(zhì)量好的離心管，如果離心管是經(jīng)過硅化的，因?yàn)橐后w幾乎不掛壁，所以上清可以去除得非常徹底；好的管子，即使沒有經(jīng)過硅化，殘留量也非常少，也沒有什么問題；差的管子，液體的掛壁非?？捎^，其殘留量多到會(huì)影響后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。避免液體殘余的一個(gè)好方法，就是倒掉液體后再短暫離心，將

29、殘液用移液器吸出。還有需大家牢記的是，殘液中都含有上一步操作中的雜質(zhì)，其殘留量與混勻程度、核酸沉淀的大小都有關(guān)。揮發(fā)時(shí)去掉的是乙醇，雜質(zhì)是不會(huì)被揮發(fā)去除的。這步，切忌不要用手甩，這樣容易將核酸甩掉。另外，核酸沉淀的大小及裂解液的裂解能力也決定了洗滌的強(qiáng)度。沉淀越大，裂解液的裂解能力越強(qiáng)，洗滌越要徹底：放置時(shí)間相對(duì)要長(zhǎng)一點(diǎn)，洗滌次數(shù)也要考慮增加。當(dāng)然，乙醇濃度的選擇也非常重要，一般情況，洗滌一定要用室溫的 75% 乙醇。（五）核酸的溶解和保存 1）核酸溶解：純化后的核酸，其中 RNA 以水溶解為主，DNA 則多以弱堿性的 Tr

30、is 或者 TE 溶解。經(jīng)典的 DNA 溶解方法多提倡使用 TE 溶解，其中原因是有人認(rèn)為 EDTA 可以減少 DNA 被可能殘留下來的 DNase 降解的風(fēng)險(xiǎn)；如果操作過程控制得當(dāng)，DNase 的殘留幾乎是可以忽略的，完全可以直接使用 Tris 或者水 (pH 接近 7) 溶解 DNA。2）核酸保存：基本上，核酸在保存中的穩(wěn)定性，與溫度成反比，與濃度成正比。一般的我們選擇，-20或70

31、保存的穩(wěn)定。如果溫度不合適，保存中核酸發(fā)生降解或者消失，首要原因是酶殘留導(dǎo)致的酶解，第二個(gè)原因則是保存核酸溶液的 pH 值不合適導(dǎo)致的水解(RNA 在弱酸性更穩(wěn)定，而 DNA 在弱堿性更合適)。還有一個(gè)不為人重視的，就是EP 管對(duì)核酸的影響。首先一定要堅(jiān)信一點(diǎn)，那就是核酸一定會(huì)與裝它的容器的接觸面發(fā)生反應(yīng)，達(dá)到某種均衡。EP 管的材質(zhì)，首先可能吸附核酸，其次還可以誘導(dǎo)核酸的結(jié)構(gòu)發(fā)生某些變化，如變性。在核酸的濃度比較高時(shí)，這個(gè)現(xiàn)象可能觀察不到；當(dāng)核酸濃度很低時(shí)，則比較明顯了。在低濃度的核酸中加入 Geletin,Gl

32、ycogen,BSA 可以穩(wěn)定核酸，雖然已經(jīng)為實(shí)驗(yàn)所證明，但許多實(shí)驗(yàn)人員并沒有將該建議當(dāng)回事。現(xiàn)在制造 EP 管的材料遠(yuǎn)多于過去。這些新出現(xiàn)的材料，在強(qiáng)度、透明度等物理特征方面可能比原來的純 PP 材質(zhì)要好許多，但其化學(xué)特征，尤其是對(duì)核酸穩(wěn)定性的可能影響，遠(yuǎn)沒有研究透徹。正如現(xiàn)在的質(zhì)?？梢愿脑斓迷絹碓竭m用某些要求一樣，其負(fù)面產(chǎn)物可能是，抽提的質(zhì)粒電泳的構(gòu)型越來越多：除了原來的三種帶型外，還可能出現(xiàn) denatured cc 、multimeric forms of cc 等等帶型。（六）核酸的濃縮應(yīng)用最廣的核酸濃縮

33、法是乙醇沉淀法。在中等濃度單價(jià)陽離子存在下，加入一定量的乙醇后，所形成有核酸沉淀可經(jīng)離心而回收，甚至對(duì)低至pg量的DNA或RNA，也可定量回收。回收的核酸可按所需濃度，再溶于適當(dāng)?shù)木彌_液中。核酸濃縮的具體操作時(shí)，可向含樣品的小中加入V/10單價(jià)陽離子鹽貯存液2V無水乙醇，混勻，放冰水浴中1530min，取出目測(cè)平衡，04度，12000g，離心10min。吸棄上清，再另70%乙醇0.51ml，12000g，04度洗滌離心2min。吸棄上清，沉淀用油泵抽干或打開蓋子晾干后，溶于適當(dāng)體積的緩沖液中。單價(jià)陽離子鹽的選擇，主要基于下述考慮：用醋酸銨可減少dNTP的共沉淀，但在以后要作核酸的磷酸化時(shí)應(yīng)避免

34、用醋酸銨，因銨離子是T，多核苷酸激酶的強(qiáng)烈抑制劑。當(dāng)用較高濃度的乙醇沉淀RNA時(shí)，常用LiCl，因LiCl在乙醇中溶解度很高，不隨核酸共沉淀。含有SDS的核酸樣品，應(yīng)使用NaCl，這時(shí)該去垢劑要70%乙醇中仍保持可溶。DNA和RNA沉淀，大多使用醋酸鈉（pH5.2 ）。六、核酸質(zhì)量的檢測(cè)問題將抽提好的核酸直接用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)，是唯一可靠的檢測(cè)方法；除此之外的檢測(cè)方法，都是相對(duì)的，而且并不十分可信。目前用于正式實(shí)驗(yàn)前檢測(cè)核酸質(zhì)量的方法，一是電泳，二是紫外分光光度儀。電泳檢測(cè)的主要是核酸的完整性和大小，只要核酸不是太小或者太大 (超出電泳分離范圍)，該方法還是非常可信的；電泳還可

35、以用于估計(jì)核酸的濃度，但其準(zhǔn)確度與經(jīng)驗(yàn)有關(guān)；另外，電泳也可能提供某些雜質(zhì)污染的信息，但是同樣與經(jīng)驗(yàn)有關(guān)。紫外分光光度儀檢測(cè)的是純度和核酸含量，然而，由于紫外分光光度儀不能確保非常準(zhǔn)確，而該儀器的靈敏度又非常高，所以，提供的結(jié)果并不十分可信。一般講，同時(shí)進(jìn)行紫外和電泳檢測(cè)，綜合二者的結(jié)果，可以做出一個(gè)更合理的判斷。但由于這兩個(gè)方法都有缺陷，所以，即使出現(xiàn)壞的結(jié)果能用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)而好的結(jié)果卻不能用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，也不用大驚小怪。關(guān)于紫外分光光度儀的檢測(cè)。首先，不要使用不能選擇波長(zhǎng)的儀器；使用那些已經(jīng)固定了波長(zhǎng)的儀器，大概可以算是你夢(mèng)魘的開始 (沒有信息是可怕的，更可怕的是將錯(cuò)誤的信息當(dāng)真，其中

36、280、320、230、260nm下的吸光度分別代表了核酸、背景（溶液渾濁度）、鹽濃度和蛋白等有機(jī)物的值。)。其次，一定要經(jīng)常調(diào)較儀器；最后，要記住讀數(shù) A230 ：A260 ：A280 = 1：2 (DNA 為 1.8) ：1 為理論上的數(shù)據(jù)，實(shí)際測(cè)定時(shí)會(huì)有一些差別；但如果差別太大，就有問題了，有兩個(gè)值得商榷的觀點(diǎn)：如果 A260/A230 > 2 就是純的，如果 A260/A280 > 2 就是核酸降解。A260/A230 如果比 2.0 

37、大許多，一定是有雜質(zhì)殘留的 (具體是什么雜質(zhì)我不知道)。如果核酸抽提好后立即就測(cè)定，A260/A280 > 2.0 決不提示核酸降解，原因是：那些能導(dǎo)致 A260/A280 > 2.0 的核酸片段非常小，常規(guī)的沉淀是不可能將它們沉淀下來的；更可能的原因是：你儀器提供的 A260/A280 實(shí)際是 A262/A282 甚至 A264/A284 的值。純的核酸的吸光值，在 A230 是谷底，在 A260 是峰頂，在 A280 則

38、正好是半山坡。根據(jù)曲線在底和頂?shù)男甭首钚?，在半山坡的斜率最大的特點(diǎn)，不難得出如下結(jié)論：A230 和 A260 的讀數(shù)受儀器準(zhǔn)確性的影響比較小，而 A280 受儀器準(zhǔn)確性的影響比較大。關(guān)于電泳檢測(cè)，觀察瓊脂凝膠中DNA的最簡(jiǎn)單方法是利用熒光染料溴化乙錠進(jìn)行染色。該物質(zhì)含有一個(gè)可以嵌入DNA的堆積堿基之間的一個(gè)平面基團(tuán)，這個(gè)基團(tuán)的固定位置及其與堿基的密切接近，導(dǎo)致染料與DNA結(jié)合并呈現(xiàn)熒光，其熒光產(chǎn)率比游離染料溶液有所增加。DNA吸收254nm處的紫外輻射并傳遞給染料，而被結(jié)合的染料本身則在302nm和366nm有光吸收。這兩種情況下，被吸收的能量

39、可在可見光譜紅橙區(qū)的590nm處重新發(fā)射出來。因此，當(dāng)凝膠中含有游離溴化乙錠時(shí)即可以檢測(cè)到少量的DNA。建議先電泳檢測(cè)，再用紫外分光光度儀檢測(cè)。電泳后，可以看到哪些樣品根本就不能用 (如降解太厲害)，以及核酸的大致濃度，這樣就為紫外分光光度儀的檢測(cè)提供了一個(gè)參考 (降解的不必要測(cè)了，要測(cè)的該取多少量等)。七、核酸中雜質(zhì)的去除對(duì)于一些對(duì)核酸純度要求較高的實(shí)驗(yàn)，我們就需要對(duì)其進(jìn)行特殊的處理，除去其中的多糖、蛋白質(zhì)及非目的核酸，其方法如下：（1）肝糖元、淀粉及粘多糖，由于其物理化學(xué)性質(zhì)與核酸有許多相似之處，常在提取液中殘存下來。除去的方法常有：取材前盡量減少組織中多糖的含量，如先使動(dòng)物饑餓數(shù)天然后殺死，可使細(xì)胞內(nèi)肝糖元大大減少。加入淀粉酶，將大分子多糖分解為小分子，在以后純化步驟中逐漸被除去。在濃磷酸鹽存在下，以2-甲氧基乙醇抽提核酸提取液，使多糖溶于下層水相，核酸在上面有機(jī)層中。以鈣鹽沉淀DNA，再以草酸鉀處理，使之形成DNA鉀鹽回收，然后用離子交換法吸附DNA，使之與多糖分離。（2）蛋白質(zhì)的除去：由于核酸在細(xì)胞內(nèi)以核蛋白體形式存在，不論采用哪種方法提取核酸，蛋白質(zhì)都不同程度地存在于體系中。因此，除去蛋白質(zhì)是核酸分離純化不可避免