骨髓間充質(zhì)細(xì)胞與速固化磷酸鈣支架共培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)研究

1、骨髓間充質(zhì)細(xì)胞與速固化磷酸鈣支架共培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)研究    【摘要】  目的觀察人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在速固化磷酸鈣骨水泥支架中的增殖和生長(zhǎng)情況。方法將速固化殼聚糖?擦姿岣乒撬?泥支架材料預(yù)先成形。采用全骨髓法分離人骨髓間充質(zhì)細(xì)胞并在體外對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)和擴(kuò)增。72 h首次換液，細(xì)胞融合80%傳代，取第3代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞與磷酸鈣骨水泥支架復(fù)合培養(yǎng)，分別利用四甲基偶氮唑藍(lán)MTT法及掃描電鏡等檢測(cè)細(xì)胞在材料中的增殖和生長(zhǎng)情況。結(jié)果用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD值提示共培養(yǎng)后，支架內(nèi)的細(xì)胞數(shù)量逐漸增加。掃描電鏡結(jié)果顯示支架材料內(nèi)部為多孔結(jié)構(gòu)，孔內(nèi)見有細(xì)胞生長(zhǎng)，細(xì)胞表面

2、可見分泌顆粒。結(jié)論速固化殼聚糖?擦姿岣乒撬?泥對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞有較好的細(xì)胞相容性，細(xì)胞可在材料內(nèi)黏附和增殖，是理想的骨組織工程支架材料。 【關(guān)鍵詞】  磷酸鈣； 殼聚糖； 骨髓間充質(zhì)細(xì)胞； 組織工程； 體外培養(yǎng)組織工程是將大量細(xì)胞三維有序化構(gòu)成組織，而支架材料是使細(xì)胞有序化三維排列所必需的載體。在骨組織工程支架材料中，磷酸鈣骨水泥因具有易塑形和可注射等特點(diǎn)而成為目前研究的熱點(diǎn)1。而經(jīng)過近年來的強(qiáng)韌化和速固化等改性處理后，磷酸鈣骨水泥在臨床上應(yīng)用將更具實(shí)用性。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）因具有強(qiáng)大的增殖和多向分化能力而成為目前組織工程研

3、究中最常用的種子細(xì)胞來源。本研究觀察新型速固化殼聚糖?擦姿岣乒撬?泥支架材料與成人MSCs細(xì)胞共培養(yǎng)后，材料對(duì)細(xì)胞黏附和增殖的影響，以評(píng)價(jià)該材料的細(xì)胞相容性。    1  材料與方法1.1  主要試劑和儀器    DMEM?LG培養(yǎng)基（Gibco公司），特級(jí)胎牛血清（天津TBD公司），地塞米松、?哺視土姿崮啤夠笛?酸（Sigma公司），四甲基偶氮唑藍(lán)MTT、二甲基亞砜DMSO、乙二胺四乙酸EDTA（Amresco公司），680型酶標(biāo)儀（美國(guó)BIO?RAD公司），XL?30ESEM掃描電鏡（PHILIPS公司）。&#

4、160;   1.2  方法    1.2.1  殼聚糖?擦姿岣乒撬?泥的制備    將主要成分為殼聚糖溶液（脫乙酰度為93%，分子量約942 000）的液相及固相的磷酸三鈣粉末（均由暨南大學(xué)理工學(xué)院材料科學(xué)與工程學(xué)院提供）用射線消毒備用。在室溫下，將固相和液相以0.7 g：1 ml比例置于培養(yǎng)皿內(nèi)混合，攪拌均勻成糊狀后，置于模具中成形。約5 min后材料基本凝固，失去流動(dòng)性。    1.2.2  成人MSCs細(xì)胞培養(yǎng)   

5、從年輕健康志愿者髂前上棘處抽取肝素化骨髓約3 ml，采用全骨髓分離培養(yǎng)法。細(xì)胞生長(zhǎng)至瓶底約90%面積時(shí)，按1：3進(jìn)行傳代培養(yǎng)。取第3代人骨髓MSCs細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。    1.2.3  細(xì)胞與支架材料復(fù)合培養(yǎng)    材料預(yù)濕：將成形材料置于6孔培養(yǎng)板上，浸于完全培養(yǎng)基中預(yù)濕1 h。    細(xì)胞準(zhǔn)備:將第3代人骨髓MSCs用0.25%胰酶消化，制成1.0×106個(gè)ml的細(xì)胞懸液。    細(xì)胞與材料聯(lián)合培養(yǎng)：采用沉淀法接種細(xì)胞。將200 l細(xì)胞懸液滴于材料上，將

6、6孔板置于培養(yǎng)箱中，接種3 h后，加入完全培養(yǎng)基并使之完全浸泡材料。之后每3 d換液1次。    1.2.4  MSCs在支架材料中的活力檢測(cè)（MTT法）    用MTT法檢測(cè)細(xì)胞在材料中的增殖情況。將細(xì)胞與材料共培養(yǎng)后第1 d起，隔天取一材料，用PBS沖洗后，0.25%胰酶及0.02%EDTA消化材料中的細(xì)胞，收集細(xì)胞，加入孔板中。加入MTT 10 l，37 溫育4 h，加入100 l DMSO，在酶標(biāo)儀上560 nm處測(cè)定OD值。    1.2.5  組織工程材料掃描電鏡（SEM）

7、分析    在細(xì)胞-材料共培養(yǎng)1周后用掃描電鏡進(jìn)行觀察。將標(biāo)本經(jīng)PBS清洗后，置于體積分?jǐn)?shù)為2.5%戊二醛溶液中固定過夜，30%100%梯度酒精脫水，醋酸異戊酯置換，臨界點(diǎn)干燥、噴金，用PHILIPS XL?30ESEM掃描電鏡觀察。    2  結(jié)果    2.1  成人骨髓MSCs培養(yǎng)光鏡觀察    原代72 h首次換液后，可見部分細(xì)胞貼壁，細(xì)胞呈圓形、橢圓形或梭形。多數(shù)細(xì)胞呈集落樣生長(zhǎng)，邊緣細(xì)胞為梭形。散在細(xì)胞多為梭形，體積較大。3周左右，細(xì)胞融合可

8、達(dá)瓶底面積約90%。這時(shí)細(xì)胞成簇狀或旋渦狀生長(zhǎng)，細(xì)胞多為細(xì)短的梭形。傳代24 h后，大部分細(xì)胞貼壁，少量懸浮細(xì)胞在換液時(shí)去除。57 d，細(xì)胞融合可達(dá)瓶底面積約90%，細(xì)胞為長(zhǎng)梭形，形態(tài)均一（圖1）。    2.2  成人骨髓MSCs在支架材料中的活力檢測(cè)    活細(xì)胞線粒體脫氫酶能將MTT還原成甲?N（formazan）。甲?N為紫色結(jié)晶，可溶于DMSO。用酶標(biāo)儀在560 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其OD值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，甲?N結(jié)晶物形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。本實(shí)驗(yàn)通過MTT法檢測(cè)顯示細(xì)胞與支架聯(lián)合培養(yǎng)后，細(xì)胞

9、在材料中具有增殖活力（圖2）。圖1第3代人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞  （100×）（略）圖2細(xì)胞在材料中的增殖情況（略）2.3  SEM觀察細(xì)胞與材料復(fù)合生長(zhǎng)情況    掃描電鏡（SEM）圖像顯示人骨髓MSCs與速固化磷酸鈣支架共培養(yǎng)7 d時(shí)細(xì)胞在多孔支架材料上生長(zhǎng)情況（圖3）。圖中可見材料內(nèi)部為多孔結(jié)構(gòu)，且其孔徑較大，超過100 m。孔內(nèi)可見細(xì)胞生長(zhǎng)，細(xì)胞呈紡錘形，細(xì)胞表面有分泌顆粒。 圖3SEM觀察細(xì)胞與材料復(fù)合生長(zhǎng)情況（略）3  討論    良好的細(xì)胞及組織相容性是醫(yī)用生物支架材料應(yīng)首先具備的基本

10、條件。羥基磷灰石與人類骨骼中的無機(jī)鹽具有十分相似的化學(xué)組成，具有良好的組織相容性、骨傳導(dǎo)和骨誘導(dǎo)性能，是目前臨床上最理想的骨植入材料之一。然而，目前所使用的羥基磷灰石多為經(jīng)煅燒成形后的固態(tài)材料，不易塑形，給臨床應(yīng)用造成不便。而近年來出現(xiàn)的磷酸鈣骨水泥（Calcium Phosphate Cement，CPC）具有可塑形的優(yōu)點(diǎn)，可填充各種復(fù)雜形狀的骨缺損，而其固化后的產(chǎn)物為羥基磷灰石2。不過，早期研制的磷酸鈣骨水泥普遍存在固化時(shí)間長(zhǎng)3和力學(xué)強(qiáng)度不足4等缺點(diǎn)，使其在使用時(shí)容易被局部組織出血沖去而無法原位固化且不宜用于人體負(fù)重部位。因此要將磷酸鈣骨水泥在臨床上推廣應(yīng)用，對(duì)材料改性使其強(qiáng)韌化并可迅速固

11、化便成為目前需要解決的問題。    針對(duì)上述問題，許多學(xué)者對(duì)磷酸鈣骨水泥進(jìn)行了改性研究。Takagi等5的研究發(fā)現(xiàn)，在骨水泥液相中加入殼聚糖（Chitosan）可以縮短其固化時(shí)間。而最近新研制的殼聚糖?擦姿岣乒撬?泥的固化時(shí)間減少到了6.7 min6。在國(guó)內(nèi)也有研究發(fā)現(xiàn)，磷酸鈣殼聚糖復(fù)合物在潮濕條件下更穩(wěn)定，固化時(shí)間縮短，抗壓強(qiáng)度提高7。殼聚糖（Chitosan）是一種帶正電荷的堿性多糖聚合物，它具有生物相容性好、無毒、可降解和抗菌等優(yōu)點(diǎn)。殼聚糖分子表面帶有親水的功能基團(tuán)，使其便于細(xì)胞黏附8。而且殼聚糖還具有促進(jìn)成骨和基質(zhì)礦化的作用9。本實(shí)驗(yàn)所用的磷酸鈣骨水泥其液

12、相主要成分是殼聚糖。將具有良好組織相容性的殼聚糖引入磷酸鈣骨水泥組分中，從理論上說該復(fù)合材料的組織相容性應(yīng)該是令人滿意的。而本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也證實(shí)了作者的預(yù)測(cè)。從實(shí)驗(yàn)中MTT法檢測(cè)結(jié)果可以看出，骨髓MSCs細(xì)胞在材料中保持增殖活力。而電鏡掃描圖像也顯示，支架內(nèi)部為多孔結(jié)構(gòu)，且有許多孔徑超過了100 m。這對(duì)細(xì)胞長(zhǎng)入、工程化組織在體內(nèi)的物質(zhì)交換以及骨的再生都是有利的10。從電鏡圖中還可以看到，在材料內(nèi)部孔隙中有細(xì)胞的長(zhǎng)入，且細(xì)胞表面出現(xiàn)分泌顆粒，這反映了孔隙中長(zhǎng)入的細(xì)胞具有代謝功能。從上面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，該支架材料對(duì)細(xì)胞具有良好的親和性，細(xì)胞在材料內(nèi)可發(fā)揮功能。   

13、; 綜上所述，該新型速固化磷酸鈣骨水泥支架材料具有良好的細(xì)胞相容性，且材料內(nèi)部的多孔結(jié)構(gòu)和孔徑也能滿足于細(xì)胞長(zhǎng)入和骨的再生，是構(gòu)建骨組織工程的理想材料。   【參考文獻(xiàn)】  1 桑宏勛，楊克強(qiáng)，王臻，等.自固化磷酸鈣復(fù)合BMP及同種異體骨修復(fù)兔股骨大段骨缺損J.中國(guó)矯形外科雜志,2006,14（1）:39?42.2 Zhang Y,Xu HH,Takagi S,et al.In?sim hardening hydroxyapatite?based scaffold for bone repairJ.J Mater Sci Mater Med,2006,1

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