離心技術(shù)與細(xì)胞器分離

1、離心技術(shù)離心技術(shù)與細(xì)胞器的分離與細(xì)胞器的分離一一 實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康? 1、以分離葉綠體、細(xì)胞核為例、以分離葉綠體、細(xì)胞核為例, ,掌握掌握離心機(jī)離心機(jī)的操作的操作技術(shù)及兩種不同的離心方法：技術(shù)及兩種不同的離心方法：差速離心法、密度梯差速離心法、密度梯度離心法度離心法; ; 2 2、光鏡鑒定各種細(xì)胞器的提取情況及了解、光鏡鑒定各種細(xì)胞器的提取情況及了解葉綠體、葉綠體、細(xì)胞核細(xì)胞核的形態(tài)。的形態(tài)。二二 實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理 離心技術(shù)離心技術(shù)（centrifugal technique）是根據(jù)）是根據(jù)顆粒在作勻速圓周運(yùn)動(dòng)時(shí)都會(huì)受到一個(gè)向顆粒在作勻速圓周運(yùn)動(dòng)時(shí)都會(huì)受到一個(gè)向外的力這一原理而發(fā)展起來的一種分

2、離技外的力這一原理而發(fā)展起來的一種分離技術(shù)。術(shù)。 離心力離心力（centrifugal force，F(xiàn)c） 相對(duì)離心力相對(duì)離心力（relative centrifugal force，RCF） 離心力（離心力（centrifugal force，F(xiàn)c） 離心力是顆粒在一定角度速度下作圓周運(yùn)離心力是顆粒在一定角度速度下作圓周運(yùn)動(dòng)時(shí)受到的一個(gè)向外的力。動(dòng)時(shí)受到的一個(gè)向外的力。 離心力（離心力（Fc）的大小取決于）的大小取決于角速度角速度與與旋轉(zhuǎn)旋轉(zhuǎn)半徑半徑，即：，即： Fc= m2r 其中其中是旋轉(zhuǎn)角速度，以弧度是旋轉(zhuǎn)角速度，以弧度/秒為單位；秒為單位；r是顆粒離開旋轉(zhuǎn)中心的距離，以是顆粒離開旋轉(zhuǎn)

3、中心的距離，以cm為單位；為單位；m是質(zhì)量，以是質(zhì)量，以g為單位。為單位。 相對(duì)離心力（相對(duì)離心力（relative centrifugal force，RCF） 又稱相對(duì)離心加速度，是指又稱相對(duì)離心加速度，是指離心力相當(dāng)于離心力相當(dāng)于重力加速度的倍數(shù)重力加速度的倍數(shù)。在文獻(xiàn)中常用。在文獻(xiàn)中常用“相對(duì)相對(duì)離心力離心力”或或“數(shù)字?jǐn)?shù)字g”表示。表示。 RCF= (m2r )/(mg)=1.11910-5 n2r 式中式中r為離心轉(zhuǎn)子的半徑距離，指離心管的為離心轉(zhuǎn)子的半徑距離，指離心管的重心至轉(zhuǎn)軸中心間的距離，以重心至轉(zhuǎn)軸中心間的距離，以cm為單位；為單位；g為地球重力加速度（為地球重力加速度（9

4、80cm/sec2）；）；n為轉(zhuǎn)為轉(zhuǎn)子每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù)（子每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù)（rpm）。）。離心力的轉(zhuǎn)換列線圖離心力的轉(zhuǎn)換列線圖 離心機(jī)離心機(jī)制備性制備性分析性分析性分析性超速離心機(jī)分析性超速離心機(jī)普通離心機(jī)普通離心機(jī)冰凍離心機(jī)冰凍離心機(jī)臺(tái)式（或地臺(tái)式（或地面式）普通面式）普通離心機(jī)離心機(jī)大容量冰大容量冰凍離心機(jī)凍離心機(jī)小于小于0.6萬萬轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)/分分高速冰凍高速冰凍離心機(jī)離心機(jī)0.6-2.5萬萬超速冰凍超速冰凍離心機(jī)離心機(jī)2.5-8萬或萬或更高更高 概述概述臺(tái)式高、超臺(tái)式高、超速離心機(jī)速離心機(jī)0.6-100.6-10萬轉(zhuǎn)萬轉(zhuǎn)/ /分以上分以上 離心機(jī)的基本分類離心機(jī)的基本分類離心機(jī)的結(jié)構(gòu)離心機(jī)的結(jié)構(gòu) 離心

5、機(jī)的主要部件為離心機(jī)的主要部件為轉(zhuǎn)頭轉(zhuǎn)頭、主軸、電動(dòng)機(jī)、主軸、電動(dòng)機(jī)和傳動(dòng)裝置、制動(dòng)器、外殼和機(jī)座。和傳動(dòng)裝置、制動(dòng)器、外殼和機(jī)座。 離心機(jī)的轉(zhuǎn)頭主要有：離心機(jī)的轉(zhuǎn)頭主要有：角度轉(zhuǎn)頭（角度轉(zhuǎn)頭（angle-headed rotors）、甩平式水平轉(zhuǎn)頭（）、甩平式水平轉(zhuǎn)頭（swing-out rotors）/吊桶式轉(zhuǎn)頭（吊桶式轉(zhuǎn)頭（swinging bucket rotors） 水平轉(zhuǎn)頭水平轉(zhuǎn)頭 角度轉(zhuǎn)頭角度轉(zhuǎn)頭離心技術(shù)類型離心技術(shù)類型 常用離心技術(shù)一般包括：常用離心技術(shù)一般包括： 差速離心法（差速離心法（differential velocity centrifugation） 密度梯度離心法

6、密度梯度離心法(density gradient centrifugation)。 差速離心法差速離心法 （differential velocity centrifugation） 采用采用逐漸增加離心速度逐漸增加離心速度或或低速和高速交替低速和高速交替進(jìn)行離心進(jìn)行離心，使沉降系數(shù)不同的顆粒在不同，使沉降系數(shù)不同的顆粒在不同的分離速度及不同的離心時(shí)間下分批分離的分離速度及不同的離心時(shí)間下分批分離的方法，稱為差速離心法。的方法，稱為差速離心法。 常用于從組織勻漿中分離各種細(xì)胞器。常用于從組織勻漿中分離各種細(xì)胞器。Figure 8-9 Molecular Biology of the Cell

7、( Garland Science 2008)The preparative ultracentrifuge差速離心法差速離心法 （differential velocity centrifugation） 密度梯度離心密度梯度離心 原理：當(dāng)不同顆粒存在原理：當(dāng)不同顆粒存在浮力密度差浮力密度差時(shí)，在離心力時(shí)，在離心力場下，在密度梯度介質(zhì)中，顆?；蛳蛳鲁两?，或場下，在密度梯度介質(zhì)中，顆?；蛳蛳鲁两?，或向上浮起，一直移動(dòng)到與它們各自的密度恰好相向上浮起，一直移動(dòng)到與它們各自的密度恰好相等的位置，在這里顆粒沒有重量，不管離心多長等的位置，在這里顆粒沒有重量，不管離心多長時(shí)間，它們再也不移動(dòng)了，形成一

8、系列密度區(qū)。時(shí)間，它們再也不移動(dòng)了，形成一系列密度區(qū)。從而使不同浮力密度的物質(zhì)得到分離。從而使不同浮力密度的物質(zhì)得到分離。 等密度梯度離心一般常用等密度梯度離心一般常用CsCl、RuCl、蔗糖、甘、蔗糖、甘油等做介質(zhì)。油等做介質(zhì)。 此法一般應(yīng)用于物質(zhì)的此法一般應(yīng)用于物質(zhì)的大小相近，而密度差異較大小相近，而密度差異較大大時(shí)。常用來分離提取核酸、亞細(xì)胞器和質(zhì)粒。時(shí)。常用來分離提取核酸、亞細(xì)胞器和質(zhì)粒。 Density gradient centrifugation Density gradient centrifugation 實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟 1將材料用蒸餾水洗凈。用濾紙吸干水后將材料用蒸餾水洗

9、凈。用濾紙吸干水后,去葉脈去葉脈,稱取稱取2克葉片克葉片,用剪刀剪碎后放入研缽。用剪刀剪碎后放入研缽。 2量取量取10ml 勻漿勻漿buffer，先向研缽中倒入，先向研缽中倒入5ml后開后開始研磨。始研磨。 3四層紗布過濾，收集四層紗布過濾，收集過濾液過濾液到到10ml離心管中，離心管中，再將剩下的再將剩下的5ml勻漿勻漿buffer 沖洗研缽后也過濾到管沖洗研缽后也過濾到管中，中，5000rpm離心離心5分鐘分鐘, 去上清。去上清。 4加入加入 0.5% TritonX-100 2.5ml, 混勻，振蕩后靜混勻，振蕩后靜置置3分鐘分鐘. 5000rpm離心離心5分鐘，去上清。分鐘，去上清。

10、5加入加入1ml CSK buffer 振蕩混勻振蕩混勻,可以用槍頭輕輕可以用槍頭輕輕吹打沉淀使其溶解吹打沉淀使其溶解. 6濾膜過濾（濾膜過濾（300目）目）, 去掉未裂解的原生質(zhì)體及裂解的細(xì)去掉未裂解的原生質(zhì)體及裂解的細(xì)胞膜內(nèi)溶物等大塊雜質(zhì)，收集胞膜內(nèi)溶物等大塊雜質(zhì)，收集過濾液過濾液。 以上步驟所提到的細(xì)胞核不純以上步驟所提到的細(xì)胞核不純,其中混雜有原生質(zhì)體、線粒其中混雜有原生質(zhì)體、線粒體、葉綠體體、葉綠體, 下面采用蔗糖密度梯度離心分離細(xì)胞核和葉綠下面采用蔗糖密度梯度離心分離細(xì)胞核和葉綠體。體。 7. 把含有把含有2.3M蔗糖蔗糖的的CSK buffer 3ml加至于離心管底部加至于離心管

11、底部. 8. 再把再把3ml 60%percoll CSK buffer 輕輕的平鋪于輕輕的平鋪于7的溶液上的溶液上方方, 用移液槍加時(shí)一定要小心順著管壁把一溶液平鋪于另一用移液槍加時(shí)一定要小心順著管壁把一溶液平鋪于另一溶液之上溶液之上. 這時(shí)應(yīng)該能觀察到溶液明顯的分層現(xiàn)象這時(shí)應(yīng)該能觀察到溶液明顯的分層現(xiàn)象. 9. 然后把然后把6中過濾溶液輕輕的平鋪于中過濾溶液輕輕的平鋪于8的溶液上方。觀察分的溶液上方。觀察分層現(xiàn)象。層現(xiàn)象。 10. 3200g離心離心32分鐘，溶液梯度層重新分布。分鐘，溶液梯度層重新分布。 11.分別吸取一些各層的溶液進(jìn)行改良品紅苯酚染色、鏡檢分別吸取一些各層的溶液進(jìn)行改良品紅苯酚染色、鏡檢。觀察不同大小不同密度的細(xì)胞器的分布情況以及他們的。觀察不同大小不同密度的細(xì)胞器的分布情況以及他們的形態(tài)特征。形態(tài)特征。 試劑勻漿勻漿buffer：5mM MES, 6.8mM CaCl2, 11mM KH2PO4, 0.3M 山梨醇山梨醇, 0.3 M甘露醇甘露醇, 0.4PVP-30CSK buffer: 100mM KCl, 3mM MgCl2, 1mM EGTA(PH8.0), 10mM PIPES(PH6.8), 300mM sucrose. 60%percoll CSK buffer ： 60%percoll, 100m