獻(xiàn)給初學(xué)者western blot操作步驟詳解上

1、獻(xiàn)給初學(xué)者：western blot 操作步驟詳解（上）2016-08-08 dlzhangyu 生物學(xué)霸我做 western 的時(shí)候，發(fā)現(xiàn)目前的資都很，網(wǎng)上的資也大多互相傳抄，說法各異，于是綜合目前網(wǎng)上所能找到的資和個(gè)人實(shí)際經(jīng)驗(yàn)，編輯這份 western blot 操作步驟，內(nèi)容包括主要操作步驟和所需要注意的有用的細(xì)節(jié)，并附上參考文獻(xiàn)。我按下文的步驟操作已經(jīng)做出來 可重復(fù)的、背景干凈的 western 條帶，所以相信你也。為節(jié)省時(shí)間，我總結(jié)一下 western blot Quick Guide和一天做出 western 的具體時(shí)間規(guī)劃，附在文末，要在下一次展示。蛋白質(zhì)印跡的發(fā)明者是大學(xué) Ge

2、orge Stark。Neal Burnette 于 1981 所著的 Analytical Biochemistry 中首次被稱為 Western Blot。最開始做印跡的是一個(gè)叫 Southern 的科學(xué)家，但印跡的對(duì)象是 DNA 鏈，他把這種技術(shù)稱為 Southern blot，后來出現(xiàn)兩個(gè)過程相似，但是對(duì)象同的印跡方法，一個(gè) RNA，一個(gè)對(duì)蛋白質(zhì)，人們分別把這兩種技術(shù)的稱為 Northern 和Western，與這兩個(gè)技術(shù)的發(fā)明人沒有 。由于這一步方法各異，具體步驟請(qǐng)參考試劑盒的說明書即可。蛋白質(zhì)的樣品 是 Western Blotting 的第一步，樣品 是關(guān)鍵步驟，要求盡可能的獲得

3、所有蛋白質(zhì)，應(yīng)注意以下問題：在合適的鹽濃度下，應(yīng)保持蛋白質(zhì)的最大溶解性和可重復(fù)性。選擇合適的表面活性劑和還原劑，破壞所有非共價(jià)結(jié)合的蛋白質(zhì)復(fù)合物和共價(jià)鍵二硫鍵，使其 形成一個(gè)各自多肽的溶液。盡去除核酸，多糖，脂類等干擾分子。防止蛋白質(zhì)在樣品處過程中的人為的修飾， 過程應(yīng)在低溫下進(jìn)，以避免細(xì)胞破碎出的各種酶類的修飾（加入合適的蛋白酶抑制劑）。樣品建議分裝成合適的（比如分裝出 20 ul 檢測(cè)蛋白質(zhì)定用），然后于 -20 或 -80 中長(zhǎng)期保存，但要注意要反復(fù)凍融，因?yàn)闀?huì)使蛋白的抗原特性發(fā)生改變。若蛋白提取過程 問題或蛋白發(fā)生降解則很難進(jìn)好之后的實(shí)驗(yàn)，也就很難做出 結(jié)果一、蛋白質(zhì)的樣品背景。除此之

4、外 loading buffer 的作用也容忽視，切莫使用新鮮的上樣緩沖液，同時(shí)在處時(shí)也應(yīng)注意將樣品與 loading buffer 混合均勻。如果要定的話，一般選擇 BCA 或者 Bradford 方法， BCA 要求檢測(cè)波長(zhǎng)為 562 nm， Bradford 為 595 nm。具體方法見各試劑盒說明書。為避免假陽(yáng)性結(jié)果，建議先把 lysis buffer 加入 BCA 工作液或考馬 G250 混合看是否產(chǎn)生顏色。測(cè) 白含后，計(jì)算含 50100 ug 蛋白的溶液體積即為上樣（一般 8 cm 寬的迷你膠每個(gè)泳道最大能承載的蛋白質(zhì)為 150 ug，所以如果從組織提取蛋白的話上樣宜過大）。網(wǎng)上有

5、人喜歡等質(zhì)上樣（即每個(gè)泳道的上樣體積一但質(zhì)一定），也有使用等體積上樣（即先把各個(gè)樣品稀釋到某一固定濃度，然后等體積等質(zhì)上樣，計(jì)算上樣體積時(shí)需包含loading buffer 的體積）。按分子克的說法，還是使用等體積上樣比較好。上樣總體積一般超過 15 ul，加樣孔的最大限度可加 20 ul 樣品。上樣前要將樣品置于燒杯內(nèi)，將燒杯置于石棉網(wǎng)上用 燈加熱至沸騰，在沸水中煮 35 min 使蛋白充分變性。也可以使用 PCR 儀 95°加熱 5 min，效果佳，操作方。之后樣品可以在 4 冰箱短時(shí)間保存，也可在 -20 冰箱保存數(shù)月，但是反復(fù)凍融會(huì)使蛋白質(zhì)的抗原特性改變。1.板蘸點(diǎn)洗潔精輕輕

6、擦洗。兩面都擦洗過后用自來水沖，再用蒸餾水沖洗干凈后立在筐晾干。若繼續(xù)使用，需用無水乙醇擦拭后晾干再妥善收起來， 板之間墊 紙隔開。梳子應(yīng)用水洗干凈，臨用前用無水乙醇擦拭晾干。2. 灌膠與上樣 板對(duì)齊后放入夾中卡緊。然后垂直卡在架子上準(zhǔn)備灌膠（操作前先往 板間灌水，檢查是否）。 按配膠試劑盒說明書選擇合適的分離膠濃度配置，最后加入TEMED，之后搖勻即可灌膠。配制凝膠時(shí)要充分混勻，此外應(yīng)保證試三、SDS-PAGE 電泳二、蛋白質(zhì)定劑的新鮮，特別是過硫酸銨。灌膠時(shí)掌握好速度，避免氣泡產(chǎn)生（注意濃度越小的膠含水越多，凝固 后膠體積縮小越多）。然后膠上加一層水，液封后的膠凝的快（灌膠 時(shí)開始可快一些

7、，膠面快到所需高度時(shí)要放慢速度。操作時(shí)膠一定要沿 板流下，這樣膠中才 有氣泡。加水液封時(shí)要很慢，否則膠會(huì)被沖變形）。未聚合的丙烯酰胺具有神經(jīng)毒性，操作時(shí)應(yīng)該戴手套防護(hù)。梳子插入濃 縮膠時(shí)，應(yīng)確保沒有氣泡。注意給積層膠出足夠的空間（分子克推 薦長(zhǎng)度為插入的梳齒長(zhǎng)再加 1 cm）。 當(dāng)水和膠之間有一條折射線時(shí)，說明膠已凝。再等幾分鐘覺得差多的時(shí)候就可倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干。聚合時(shí)間由 AP 以及 TEMED 決定，通常在 30 min 左右，AP 新鮮會(huì)導(dǎo)致聚合變慢，氣溫較低時(shí)膠是會(huì)凝得慢一些，必要時(shí)可適當(dāng)增加 AP 以及 TEMED 的 ，但通常 超過 1 h，若超過 1 h 甚至長(zhǎng)仍未

8、聚合，應(yīng)檢查配制的操作有無錯(cuò)誤。由于 TEMED 催化 APS相關(guān)化學(xué)基團(tuán)，再由 APS的基團(tuán)催化Acr/Bis 聚合，所以如果 APS 新鮮的話加再多的 TEMED 效果也佳，這就是為么推薦 APS 每周新鮮配置的 。 按說明書配積層膠，加入 TEMED 后立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中。灌膠時(shí)也要使膠沿 板流下以免膠中有氣泡產(chǎn)生。插梳子時(shí)要使梳子保持水平。由于膠凝固時(shí)體積會(huì)收縮減小，從而使加樣孔的上樣體積減小，所以在 濃縮膠凝固前最好在兩邊補(bǔ)膠至剛剛冒頂。待到濃縮膠凝固后，兩手分 別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出。 趁積層膠聚合的這段時(shí)間，取適當(dāng)體積樣本混

9、合 1X SDS loading buffer（最好事前分裝好，每次從冰箱取一管即可），95100° 加熱5 min，若有沉淀可用稍低溫度，比如 4555° 加熱 1 h 達(dá)到變性的目的。我一般習(xí)慣分裝 20 ul 到 PCR 管，先和 loading buffer 混合好， 臨用前用 PCR 儀加熱 95 °C 5 min，效果錯(cuò)。 膠做好后連同板一起安裝到電泳槽上，加入電泳緩沖液后開始準(zhǔn)備上樣（我們使用的是大連競(jìng)邁科技公司的 MV-III 型小型單垂直板電泳槽，電泳液至少要漫過內(nèi)測(cè)的小板，電泳槽下面用倒太多電泳液）。加樣前可用 5 ml 注射或加樣先沖洗一下加

10、樣孔。用微加樣貼壁吸取樣品，將樣品吸出要吸進(jìn)氣泡。將加樣針頭插至加 樣緩慢加入樣品（加樣太快可使樣品沖出加樣孔，若有氣泡也可能 使樣品溢出。加入下一個(gè)樣品時(shí)，進(jìn)樣需在外槽電泳緩沖液中洗滌 3次，以免交叉污染。目前我們做的 mini 膠上有 10 個(gè)上樣孔，一般在第一個(gè)入marker（是 Fermentas 預(yù)染 marker），其余 9 個(gè)入樣品， 也可在頭尾加入 marker，中間 8 個(gè)樣品。加樣前樣品應(yīng)先離心，尤其是長(zhǎng)時(shí)間放置的樣品。在未加樣的應(yīng)加入等的樣品緩沖液。上樣時(shí)，小心要使樣品溢出而污染相臨加樣孔。也可使用 10 ul的槍頭就，比用微加樣快很多，用槍頭時(shí)注意要插得太深，容 把板撐

11、開，樣品就落到膠和板之間的空隙。3. 電泳電泳槽內(nèi)加入電泳緩沖液沖洗清除黏附在凝膠底部的氣和未聚合的丙烯 酰胺，網(wǎng)上有資建議低電壓短時(shí)間的預(yù)電泳，清除凝膠內(nèi)的雜質(zhì)，疏 通凝膠孔徑以保證電泳過程中電泳的暢通，但是在分子克上卻反對(duì)這種做法，由是會(huì)破壞緩沖系統(tǒng) pH 的連續(xù)性。請(qǐng)各位按照實(shí)際經(jīng)驗(yàn)來做即可。電泳時(shí)間和電壓說法各異。按照各實(shí)驗(yàn)室的慣或者電泳槽的使用說明來操作。電泳至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳，進(jìn)轉(zhuǎn)膜。為減少蛋白質(zhì)條帶的擴(kuò)散，上樣后應(yīng)盡快進(jìn)電泳，電泳結(jié)束后也應(yīng)直接或者轉(zhuǎn)印。就講到這兒，欲知后事如何，且聽下回分解。文章來源：丁香園站友 dlzhangyu圖片來源：網(wǎng)絡(luò)閱讀原文 閱讀 26402

12、138精選言陳陳正好在用這個(gè)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，說很多以前我沒注意到的細(xì)節(jié)問題，感謝作者和小編。20168月8日19作者回復(fù)分享出去就是對(duì)我們和作者最大的支持哦20168月8日4C'est la vie最近板就讓我學(xué)習(xí)做這個(gè)，看到推送真的是好感動(dòng)(_)感謝大神的總結(jié)20168月8日11作者回復(fù)分享和點(diǎn)贊就是對(duì)我們最大的支持哦20168月8日三蛋官人,繼續(xù)嘛,人家等及20168月8日8作者回復(fù)客官急，周四見。20168月8日18陳俊明請(qǐng)教樓主，如果10個(gè)上樣孔。我只加8個(gè)樣品。剩下兩個(gè)孔沒有添加等的上樣緩沖液。對(duì)蛋白在凝膠上的分布有影響嗎？請(qǐng)多多指教20168月8日M. 總結(jié)的真用心，期待下部6生

13、物學(xué)霸精品公開課正式上線啦，點(diǎn)擊下方閱讀原文查看具體課程。20168月8日作者回復(fù)好類，感謝支持哦20168月8日1甘支持，學(xué)到很多，請(qǐng)繼續(xù)20168月8日3麥霸樣品怎么可能反復(fù)凍融？這個(gè)科學(xué)啊20168月8日3作者回復(fù)這個(gè)可以做到哦20168月8日3糖果 TD 趕緊出下部吧20168月8日作者回復(fù)別急哈 20168月8日稻草這個(gè)寫得太好20168月8日2作者回復(fù)對(duì)你們有幫助真是太好啦20168月8日1培雁2現(xiàn)在是 WB自動(dòng)化定的儀嗎？感覺那個(gè)儀的重復(fù)性，靈度比較高，而且效率挺高的。20168月8日2啦最近我們 經(jīng)常在跑電泳的時(shí)候液，知道作者遇到過沒有好苦惱20168月8日毛阿懋哇咔咔這是我寫

14、的啊 沒想到這么多 看到能幫助這么多人我心很高興20168月8日2作者回復(fù)非常感謝你20168月8日Iris要 ing2贊贊贊。多謝小編20168月8日作者回復(fù)多寫作者哦20168月8日2于芳芳新學(xué)期 板讓做這個(gè)實(shí)驗(yàn)20168月8日作者回復(fù)加油哦，好好做20168月8日柚子學(xué)霸可否請(qǐng)你幫我解個(gè)惑吶？ 我最近配膠拔出梳子后加樣兒都好好洗呢，你幫我分析分析吧，拜托啦！20168月9日1變得彎彎扭扭的哪哪作者回復(fù)要么膠有問題，要么凝固時(shí)間夠20168月10日1翠平太棒！20168月8日1作者回復(fù)感謝支持哦20168月8日米昨天才看到師兄做這個(gè)實(shí)驗(yàn)，還想哪20168月8日1查查呢，結(jié)果 就發(fā)，真是心有

15、靈犀文刀家的禾方好巧，過兩天就要做印跡呢,正好可以結(jié)合BIO-RAD的使用手冊(cè)一塊兒看， 謝小編20168月8日1作者，謝廖大胖正需要，感謝作者20168月8日1小小韓期待下部 正做著呢20168月8日1小小魚太感謝，對(duì)科研一竅通的我，可以一步一步解科研，好開心2月21日Valie-霍我做的蛋白是20kDa的，先用IPTG誘導(dǎo)檢測(cè)，跑SDS-PAGE和未誘導(dǎo)的比效果好1月21日pilgrimage煮 白后，蛋白變性沉淀，這個(gè)時(shí)候上清液的蛋白濃度會(huì)下降，知作者考慮這個(gè)問 題沒？201611月29日明樣品加入loading后，如果暫時(shí)跑膠，可以先加熱變形直接-20保存嗎201611月15日天對(duì)我這樣的初學(xué)者來說，這樣的文真的多多益善贊!20168月10日小編！下篇！快快快快快20168月8日電泳時(shí)上層膠和下層膠電壓是是必須一樣呢？我們上層是80V，下層是120V20168月8日柚子看來我得等到下篇出再開工大大的贊一個(gè)！20168月8日作者回復(fù)很快就出來哈20168月8日l(shuí)ouis也正在為此發(fā)愁，感謝作者和小編！20168月8日請(qǐng)趕快新,下篇20168月8日作者回復(fù)20168月8日且走且看最近也在做這個(gè)，但是木有結(jié)果2016