透明顫菌血紅蛋白基因在紅色糖多孢菌株中表達及對紅霉素產(chǎn)量的影

1、透明顫菌血紅蛋白基因在紅色糖多孢菌株中表達及對紅霉素產(chǎn)量的影         作者：吳益民 王洪軍 孫艷 吳瓊 馮立 張志強 楊青 楊國平 【摘要】 目的 利用已含有血紅蛋白基因(vgb)的紅色糖多孢基因工程重組菌，探討vgb表達產(chǎn)物對重組糖多孢紅霉菌提高紅霉素產(chǎn)率的影響。方法 用SDS-PAGE、Western blot方法鑒定血紅蛋白，用葡萄糖濃度與總蛋白質含             

2、;           作者：吳益民 王洪軍 孫艷 吳瓊 馮立 張志強 楊青 楊國平【摘要】  目的 利用已含有血紅蛋白基因(vgb)的紅色糖多孢基因工程重組菌，探討vgb表達產(chǎn)物對重組糖多孢紅霉菌提高紅霉素產(chǎn)率的影響。方法 用SDS-PAGE、Western blot方法鑒定血紅蛋白，用葡萄糖濃度與總蛋白質含量比較原始菌株與重組菌株的差別。結果 紅色糖多孢基因工程重組菌與原始菌株比較，重組菌株發(fā)酵過程葡萄糖濃度的變化出現(xiàn)在第二時段(約38h)，原始菌株達到了0.4g/L，而

3、重組菌株只有0.25g/L；第三時段原始菌株出現(xiàn)了游離葡萄糖濃度高峰而重組菌株未出現(xiàn)。在兩個菌株中生物物質濃度以總蛋白質(g/L)表示存在不同，重組菌株比原始菌株約低27%。紅霉素效價，原始菌株和重組菌株分別為3.98和5.15g/L，相當于重組菌株提高紅霉素體積產(chǎn)率約29%。結論 重組紅色糖多孢菌表達了透明顫菌血紅蛋白，提高了紅霉素產(chǎn)率，對解決抗生素工業(yè)和基因工程菌高密度發(fā)酵有良好的應用前景。 【關鍵詞】  透明顫菌； 血紅蛋白基因； 紅色糖多孢菌； 基因重組    ABSTRACT  Objective  To study the

4、 exprssion of Vitreoscilla hemoglobin gene (vgb) in the Saccharopoblyspoura erythraea and its effect on erythromycin production.  Method  A vgb gene was integrated into the chromosomal DNA of Sac.erythraea by electrotransformation and the recombinant Sac.erythraea was obtained. The VHb was

5、 identified with SDS-PAGE and Western blotting method. Glucose concentrations and total protein content in original Sac.erythraea and recombinant strain fermentation processes were determined and compared with auto-biochemical assay. The erythromycin titers were tested with cylinder plate method. Re

6、sults  At the second stage of fermentation, glucose concentration of original strain reached 0.4g/L at about 38h and that of recombinant strain was 0.25g/L; at the third stage, a glucose concentration peak appeared in original strain while none did in recombinant. The total protein content of r

7、ecombinant was lower than that of original strain by 27%. The titres of erythromycin in original strain and recombinant were 3.98 and 5.15g/L, respectively, i.e. the the erythromycin production of recombinant was increased by 29% compared with that of original strain.  Conclusion  vgb gene

8、 was expressed in recombinant Sac.erythraea, which increased erythromycin production and showed a bright application prospect of antibiotic-gene engineering strain.    KEY WORDS  Vitreoscilla;  vgb;  Saccharopolyspora erythraea;  Gentic recombination  

9、60; 紅霉素是由紅色糖多孢菌培養(yǎng)液中分離出來的一種抗生素，每年的產(chǎn)量有數(shù)千噸?？紤]到菌體進行大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)時所處的特殊生長條件，只有在大規(guī)模的生物反應器中提高氧氣的利用率，才能有效地提高紅霉素的產(chǎn)量降低生產(chǎn)成本，因此，尋求能夠提高細胞利用氧氣能力的途徑是提高紅霉素產(chǎn)量的關鍵。透明顫菌血紅蛋白(VHb)在多種異源菌株中獲得成功表達1，2，是提高細胞利用氧能力的一條新途徑。本項研究將vgb基因引入紅色糖多孢菌株，并在重組紅色糖多孢菌株中成功地表達了血紅蛋白，與原始菌株比較，在發(fā)酵過程中血紅蛋白持續(xù)表達，提高了紅霉素的產(chǎn)率，現(xiàn)將結果報道如下。    1  材

10、料與方法    1.1  材料    (1)菌株與質粒  紅色糖多孢菌2359(紅霉素的工業(yè)生產(chǎn)菌)購自大連醫(yī)藥公司。紅色糖多孢菌的基因工程重組菌(染色體中已整合了Vitreoscilla hemog-lobin gene，vgb)本實驗室構建。紅霉素生物檢測的檢定菌和藤黃微球菌(Micrococus luteus)28001購自大連醫(yī)藥公司。    (2)試劑  紅霉素標準品購自Fluka公司。葡萄糖、正丙醇、糊精、培養(yǎng)基與常用化學試劑和免疫試劑均購自上海生物工程公司。&#

11、160;   (3)儀器及設備  日本SANYO MS-3020型高壓滅菌鍋；美國Beckman J2-21型低溫離心機；瑞士INFORS公司生產(chǎn)的Minifors實驗室小型發(fā)酵罐和Techfors-S中試型發(fā)酵罐；寧波新芝科儀器研究所生產(chǎn)的超聲波細胞粉碎儀；惠普上海分析儀器有限公司生產(chǎn)的7320分光光度計。    1.2  方法    (1)重組紅色糖多孢菌載體的構建與工程菌株的篩選  見文獻3。    (2)透明顫菌血紅蛋白基因在紅色糖多孢菌中表達&#

12、160; 將重組糖多孢紅霉菌發(fā)酵培養(yǎng)物100ml離心，收集菌體。每克菌體加入3ml的裂解液懸浮細菌，加入溶菌酶至終濃度100g/ml，1/10體積的1% Triton X-100震蕩混勻，30水浴15min，置冰浴中超聲處理(功率：200300w，每次60s，間隔10s)，將裂解液12000r/min離心15min，溶菌沉淀和上清中加入100l 2× SDS-PAGE緩沖液，立即進行SDS-PAGE電泳分析表達產(chǎn)物(分離膠濃度為12%，濃縮膠濃度為5%)。具體操作方法參照文獻4。    (3)紅色糖多孢菌的補料培養(yǎng)  工程菌的發(fā)酵分3級進行。取

13、一級種子35ml在S2培養(yǎng)基中進行搖瓶培養(yǎng)，48h后轉移至含3.5L S3培養(yǎng)基的5L的小型發(fā)酵罐中，進行二級種子培養(yǎng)。攪拌轉速為800r/min，空氣流量0.6vvm，溫度34。培養(yǎng)過程中檢測溶解氧壓(DOT)、pH值和氧化還原電位的變化，并在線監(jiān)測排氣中的二氧化碳和氧氣的濃度。40h后取1.5L的二級種子轉移至20L的中試型發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐中事先加入10L濃度減半的S4發(fā)酵培養(yǎng)基。溫度34，pH值7.1，攪拌轉速初始值為700r/min，當DOT低于45%的空氣飽和度時提高攪拌轉速到900r/min；空氣流量在前12h為0.35vvm， 然后上調至0.85vvm， 開始補料后再下調為0.7vvm；反應器上方空氣壓力控制在0.01MPa。發(fā)酵過程中的補料，12160h按2.4ml/(L·d)的速率補加正丙醇；25h到發(fā)酵結束區(qū)間按4.8ml/(L·d)的速率補加豆油；3090h按48ml/(L·d)的速率補加15%糊精。低流速時通過補料泵每分鐘補入適當?shù)牧?，高流速時可連續(xù)補料。    (4)葡萄糖濃度測定  按6、38和96h梯度時間定時取樣，以生化分析儀檢測葡萄糖濃度，同時設對照組。    (5)發(fā)酵液中總蛋白含量的測定  采用