分子生物學2016L3斷裂基因

1、Molecular Biology 分子生物學分子生物學 Lecture 3 (12 Sep ,2016, Th, 18:00)Graduate School of Chinese Academy of Agricultural & Sciences (中國農(nóng)業(yè)科學院研究生院)(GSCAAS)Chapter 2The interrupted gene(斷裂基因)2.1 Introduction2.2 Restriction endonucleases are a key tool in mapping DNA (限制性內(nèi)切核酸酶是DNA作圖中的關(guān)鍵工具 (2.3) )2.3 Organ

2、ization of interrupted genes may be conserved (斷裂基因的組成結(jié)構(gòu)可能是保守的 (2.4) )2.4 Genes can be isolated by the conservation of exons (通過外顯子的保守性可以分離基因 (2.6) )2.5 Some DNA sequences code for more than one protein (一些DNA序列編碼一種以上蛋白質(zhì) (2.8) )2.6 The members of a gene family have a common organization (基因家族成員具有共同的

3、組織結(jié)構(gòu) (2.11) )Key Concepts：Eukaryotic genomes contain interrupted genes that consist of an alternation of exons (represented in the final RNA product) and introns (removed from the initial transcript).The exon sequences occur in the same order in the gene and in the RNA, but an interrupted gene is lo

4、nger than its final RNA product because of the presence of the introns.關(guān)鍵概念：關(guān)鍵概念：真核生物基因組包含的斷裂基因由間隔的外顯子 (最終以RNA產(chǎn)物體現(xiàn))和內(nèi)含子 (從初始轉(zhuǎn)錄物中去除的序列)組成。外顯子(外元)序列在基因和RNA中的順序是一致的，但由于內(nèi)含子(內(nèi)元)的存在，斷列基因的長度大于它的最終RNA產(chǎn)物的長度。2.1 IntroductionThe exons are the sequences represented in the mature RNA. By definition, a gene start

5、s and ends with exons, corresponding to the 5 and 3 ends of the RNA. The introns are the intervening sequences that are removed when the primary transcript is processed to give the mature RNA.外顯子外顯子的序列包含在成熟RNA中。也可以是基因起始、結(jié)束于外顯子對應(yīng)于RNA的5和3端。內(nèi)含子內(nèi)含子是插入序列，在初始轉(zhuǎn)錄物加工成成熟RNA時被除去。Figure2.1 Interrupted genes are

6、 expressed via a precursor RNA. Introns are removed when the exons are spliced together. The mRNA has only the sequences of the exons.內(nèi)含子從斷裂基因中去除后形成信使RNA外顯子1剪接去除內(nèi)含子前體mRNA前體RNA(非mRNA)的長度決定基因的區(qū)域每個編碼區(qū)域在基因中是彼此分離的圖圖2.12.1 斷裂基因表達成前體RNA，內(nèi)含子剪切除去后，外顯子剪接連接在一起，而mRNA只有外顯子的序列。2.2 Restriction endonucleases are a

7、key tool in mapping DNA (限制性核酸內(nèi)切酶是DNA作圖中的關(guān)鍵工具) (2.3)Key Concepts Restriction endonucleases can be used to cleave DNA into defined fragments. A map can be generated by using the overlaps between the fragments generated by different restriction enzymes.關(guān)鍵概念關(guān)鍵概念限制性內(nèi)切核酸酶可以用來將DNA剪切成特定的片段。用不同的限制性內(nèi)切核酸酶作用，可

8、產(chǎn)生一系列DNA片段，通過疊加方法可用于DNA作圖(物理圖譜)。 物理圖譜物理圖譜（Physics Map）：物理圖譜描繪DNA上可以識別的標記的位置和相互之間的距離(以堿基對的數(shù)目為衡量單位)，這些可以識別的標記包括限制性內(nèi)切酶的酶切位點，基因等。物理圖譜不考慮兩個標記共同遺傳的概率等信息。對于人類基因組來說，最粗的物理圖譜是染色體的條帶染色模式，最精細的圖譜是測出最精細的圖譜是測出DNA的的完整堿基序列。完整堿基序列。物理圖譜是利用限制性內(nèi)切酶將染色體切成片段，再根據(jù)重疊序列確定片段間連接順序，以及遺傳標志之間物理距離堿基對(bp)或千堿基(kb)或兆堿基(Mb)的圖譜。 bp is an

9、 abbreviation for base pairs; distance along DNA is measured in bp.Restriction enzymes recognize specific short sequences of DNA and cleave the duplex (sometimes at target site, sometimes elsewhere, depending on type).bp 是堿基對的縮寫；用以測量DNA中的距離。限制性核酸內(nèi)切酶可以識別雙鏈DNA上的特異的短序列并切開雙鏈結(jié)構(gòu)(根據(jù)基因的不同類型，切割可以在靶位點或其它位置)。R

10、estriction map is a linear array of sites on DNA cleaved by various restriction enzymes.Restriction endonucleases can be used to cleave DNA into defined fragments. A map can be generated by using the overlaps between the fragments generated by different restriction enzymes. 限制圖譜是DNA經(jīng)不同限制性內(nèi)切酶切割后的線性排列

11、。限制性內(nèi)切酶可將DNA切成一定長度的片段。利用由不同限制性內(nèi)切酶切割所產(chǎn)生的片段之間的重疊性質(zhì)可繪制DNA圖譜。Figure 2.3 Fragments generated by cleaving DNA with a restriction endonuclease can be separated according to their sizes.圖2.3 限制酶作用產(chǎn)生的DNA切割片段能按照它們的大小而分開。電泳可根據(jù)大小分離片段電泳可根據(jù)大小分離片段與對照相比的片段大小對照含有一系列已知大小的片段用限制性核酸內(nèi)切酶切割電泳、與對照DNA對比Figure2.4 A restrictio

12、n map is a linear sequence of sites separated by defined distances on DNA. The map identifies the sites cleaved by enzymes A and B, as defined by the individual fragments produced by the single and double digests. 限制圖譜圖圖2.4 限制圖譜表示的是DNA上以限定長度而分開的所有位點的線性次序。該圖確定了酶A及B的酶切位點，它們由單酶切和雙酶切消化所產(chǎn)生的不同片段來確定。2.3 Or

13、ganization of interrupted genes may be conserved (斷裂基因的組成結(jié)構(gòu)可能是保守的) (2.4)由于內(nèi)含子額外序列的存在，并通過限制圖譜或電子顯微鏡技術(shù)比較基因與它們的RNA產(chǎn)物而使內(nèi)含子能夠被檢測出來，但最終的定義是通過比較序列而得出的。比較不同生物的同源基因，我們發(fā)現(xiàn)內(nèi)含子的位置通常是保守的，但是相應(yīng)的內(nèi)含子的長度變化可以很大。內(nèi)含子通常不編碼蛋白質(zhì)。 Figure 2.5 Comparison of the restriction maps of cDNA and genomic DNA for mouse -globin shows th

14、at the gene has two introns that are not present in the cDNA. The exons can be aligned exactly between cDNA and gene. cDNA中缺失內(nèi)含子的限制位點限制位點基因組DNA圖圖2.5 比較- 珠蛋白的cDNA和基因組DNA的限制圖譜，我們發(fā)現(xiàn)基因有兩個內(nèi)含子而cDNA中則沒有。在cDNA和基因組DNA中，外顯子限制圖譜排列是一致的。Figure 2.6 An intron is a sequence present in the gene but absent from the m

15、RNA (here shown in terms of the cDNA sequence). The reading frame is indicated by the alternating open and shaded blocks; note that all three possible reading frames are blocked by termination codons in the intron. 內(nèi)含子序列mRNA中去除阻斷圖圖2.6 內(nèi)含子就是包含在基因中但在mRNA中缺失的一段序列 (此處顯示的是cDNA序列)。讀框用交互開放和陰影區(qū)表示；值得注意的是三個可能

16、的讀框被內(nèi)含子中的終止密碼子所阻斷。Figure 2.7 All functional globin genes have an interrupted structure with three exons. The lengths indicated in the figure apply to the mammalian -globin genes. 珠蛋白基因具有相似的結(jié)構(gòu)，但內(nèi)含子的長度不同珠蛋白基因具有相似的結(jié)構(gòu)，但內(nèi)含子的長度不同圖圖2.7 所有功能性珠蛋白基因都是含三個外顯子的斷裂基因結(jié)構(gòu)。圖中標識的長度亦適用于哺乳動物- 珠蛋白基因。內(nèi)含子長度內(nèi)含子長度包含UTR（Untran

17、slated Regions)即非翻譯區(qū)，是信使RNA（mRNA）分子兩端的非編碼片段。 5-UTR從mRNA起點的甲基化鳥嘌呤核苷酸帽延伸至AUG起始密碼子，3-UTR從編碼區(qū)末端的終止密碼子延伸至多聚A尾巴（Poly-A）的末端。 珠蛋白基因 globin gene 血紅蛋白含2個和2個鏈，分別由鏈珠蛋白基因和鏈珠蛋白基因的信息而形成。哺乳動物的鏈基因和鏈基因在結(jié)構(gòu)上相似，都是由2個內(nèi)含子而分為3個外顯子部分。鏈基因和鏈基因的內(nèi)含子1的長度約為120個堿基對，而對內(nèi)含子2，鏈很長（例如人的鏈基因之一的2，內(nèi)含子2含140個堿基對，而鏈基因含849個堿基對）。珠蛋白基因在哺乳類是數(shù)次重復(fù)的結(jié)

18、構(gòu)，形成一種多重基因群。珠蛋白珠蛋白（英文名為“globinglobin”）是具有攜帶氧能力的蛋白質(zhì)攜帶氧能力的蛋白質(zhì)。在脊椎動物體內(nèi)有兩種類型：即存在于血液中血紅蛋白和肌肉中肌紅蛋白，目前在神經(jīng)系統(tǒng)又發(fā)現(xiàn)了第三種珠蛋白。Figure 2.8 Mammalian genes for DHFR have the same relative organization of rather short exons and very long introns, but vary extensively in the lengths of corresponding introns.圖圖2.8 哺乳動物的

19、DHFR基因具有相似的構(gòu)成，即它有較短的外顯子和較長的內(nèi)含子，但相應(yīng)的內(nèi)含子之間的長度變化廣泛。DHFR：二氫葉酸還原酶二氫葉酸還原酶 (dihydrofolate reductase) DHFR基因具有一個不變的結(jié)構(gòu)基因具有一個不變的結(jié)構(gòu)Conservation of exons can be used as the basis for identifying coding regions by identifying fragments whose sequences are present in multiple organisms. 外顯子的保守性可以做為鑒定編碼區(qū)的基礎(chǔ)，即通過確認那

20、些在許多生物體中都存在的序列片段。2.4 Genes can be isolated by the conservation of exons (通過外顯子的保守性可以分離基因) (2.6)Key Concepts關(guān)鍵概念關(guān)鍵概念I(lǐng)n a region containing a gene whose function has been conserved among a range of species, the sequence representing the protein should have two distinctive properties :it must have an o

21、pen reading frame (open reading frame, ORF);it is likely to have a related sequence in other species.對于含有這樣基因的區(qū)域，即在許多生物中這些基因的功能長期被保留下來，這個序列所代表的蛋白質(zhì)應(yīng)當有兩個特性：它必須有一個開放閱讀框 (ORF)；在其他生物中很可能存在與它相關(guān)的序列。Southern blotting基本概念及原理基本概念及原理Southern印跡雜交是進行基因組DNA特定序列定位的通用方法。一般利用瓊脂糖凝膠電泳分離經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化的DNA片段，將膠上的DNA變性并在原位將單鏈

22、DNA片段轉(zhuǎn)移至尼龍膜或其他固相支持物上，經(jīng)干烤或者紫外線照射固定，再與相對應(yīng)結(jié)構(gòu)的標記探針進行雜交，用放射自顯影或酶反應(yīng)顯色，從而檢測特定DNA分子的含量。 Southern印跡雜交技術(shù)是分子生物學領(lǐng)域中最常用的具體方法之一。其基本原理是：具有一定同源性的兩條核酸單鏈在一定的條件下，可按堿基互補的原則形成雙鏈，此雜交過程是高度特異的。由于核酸分子的高度特異性及檢測方法的靈敏性，綜合凝膠電泳和核酸內(nèi)切限制酶分析的結(jié)果，便可繪制出DNA分子的限制圖譜。但為了進一步構(gòu)建出DNA分子的遺傳圖，或進行目的基因序列的測定以滿足基因克隆的特殊要求，還必須掌握DNA分子中基因編碼區(qū)的大小和位置。有關(guān)這類數(shù)據(jù)

23、資料可應(yīng)用Southern印跡雜交技術(shù)獲得。 Southern印跡雜交技術(shù)包括兩個主要過程：一是將待測定核酸分子通過一定的方法轉(zhuǎn)移并結(jié)合到一定的固相支持物（硝酸纖維素膜或尼龍膜）上，即印跡（blotting）；二是固定于膜上的核酸與同位素標記的探針在一定的溫度和離子強度下退火，即分子雜交過程。該技術(shù)是1975年英國愛丁堡大學的E.M.Southern首創(chuàng)的，Southern印跡雜交故因此而得名。Another technique that allows genomic fragments to be scanned rapidly for the presence of exons is ca

24、lled exon trapping shows that it starts with a vector that contains a strong promoter, and has a single intron between two exons. When this vector is transfected into cells, its transcription generates large amounts of an RNA containing the sequences of the two exons. 另外一種技術(shù)即對基因組片段迅速掃描從而得知外顯子的存在叫外顯子

25、捕獲外顯子捕獲技術(shù)。外顯子捕捉外顯子捕捉技術(shù)要求一個帶有強啟動子的載體且在兩個外顯子之間只有一個內(nèi)含子。當這個載體轉(zhuǎn)染到細胞后，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生大量的含有兩個外顯子序列的RNA。Figure 2.12 A special splicing vector is used for exon trapping. If an exon is present in the genomic fragment, its sequence will be recovered in the cytoplasmic RNA, but if the genomic fragment consists solely of s

26、equences from within intron, splicing does not occur, and the mRNA is not exported to the cytoplasm.3 剪接點5 剪接點 轉(zhuǎn)錄和剪接載體在轉(zhuǎn)錄物中含有兩個通過剪接剪接連在一起的外顯子圖圖2.12 此技術(shù)用了一種特殊的載體。如果基因組片段中含有一個外顯子，那么它的序列可以在細胞質(zhì)RNA中被發(fā)現(xiàn)；但如果基因組片段中只由內(nèi)含子中的序列組成，那么剪接就不會發(fā)生，且mRNA也不會運輸?shù)郊毎|(zhì)中。一特殊載體用于外顯子捕捉基因組片段轉(zhuǎn)錄和剪接外顯子插基因組片段到內(nèi)含子中2.5 Some DNA sequenc

27、es code for more than one protein (一些DNA序列編碼一種以上蛋白質(zhì)) (2.8)Key Concepts The use of alternative initiation or termination codons allows two proteins to be generated where one is equivalent to a fragment of the other. Nonhomologous protein sequences can be produced from the same sequence of DNA when it

28、 is read in different reading framesby two (overlapping) genes. Homologous proteins that differ by the presence or absence of certain regions can be generated by differential (alternative) splicing, when certain exons are included or excluded. This may take the form of including or excluding individ

29、ual exons or of choosing between alternative exons.起始 (或終止)的可選擇性可以產(chǎn)生相關(guān)的蛋白質(zhì)全長蛋白質(zhì)部分長度蛋白質(zhì)選擇性起始點Figure 2.17 Two proteins can be generated from a single gene by starting (or terminating) expression at different points.圖圖2.17 通過在不同的起始位點起始表達或在不同的終止位點終止表達, 一條基因可以翻譯出兩種不同的蛋白質(zhì)。Figure 2.18 Two genes may share t

30、he same sequence by reading the DNA in different frames.不同的閱讀框可以使用重疊的三聯(lián)體密碼子蛋白質(zhì)1的密碼子蛋白質(zhì)2的密碼子圖2.18 通過使用不同的讀框,兩條基因可共享一段DNA序列?？勺兗艚涌梢蕴娲怙@子Figure 2.19 Alternative splicing generates the and variants of troponin T (可變剪接產(chǎn)生肌鈣蛋白T的和兩種類型).可變剪接使用不同外顯子的組合只有內(nèi)含子被剪接除去長蛋白質(zhì)有三個外顯子內(nèi)含子+外顯子2被剪接除去短蛋白質(zhì)只有外顯子1+外顯子3Figure 2.20

31、 Alternative splicing uses the same pre-mRNA to generate mRNAs that have different combinations of exons. 圖圖2.20 可變剪接使用相同的前體mRNA，產(chǎn)生的mRNA含有不同的外顯子組合。(一組基因假定具有共同特征，可以鑒定出在進化過程中這組基因分開之前的一些性質(zhì))(所有的珠蛋白都具有3個外顯子和2個內(nèi)含子這種共同的組織形式，這意味著它們由一個祖先基因進化而來 )Key ConceptsA common feature in a set of genes is assumed to ide

32、ntify a property that preceded their separation in evolution. All globin genes have a common form of organization with 3 exons and 2 introns, suggesting that they are descended from a single ancestral gene.2.6 The members of a gene family have a common organization (基因家族成員具有共同的組織結(jié)構(gòu)) (2.11)Figure 2.2

33、4 The exon structure of globin genes corresponds with protein function, but leghemoglobin has an extra intron in the central domain.圖圖2.24 珠蛋白基因的外顯子結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)的功能相一致，但是豆血紅蛋白的中央結(jié)構(gòu)域中含有一個額外的內(nèi)含子。結(jié)構(gòu)域是被分開的亞鐵血紅素結(jié)合域豆血紅蛋白有一個額外的內(nèi)含子珠蛋白豆血紅蛋白豆血紅蛋白珠蛋白珠蛋白（英文名為“globin”）是具有攜帶氧能力的蛋白質(zhì)攜帶氧能力的蛋白質(zhì)。在脊椎動物體內(nèi)有兩種類型：即存在于血液中的血紅蛋白和肌肉中

34、的肌紅蛋白，目前在神經(jīng)系統(tǒng)又發(fā)現(xiàn)了第三種珠蛋白。豆科植物根瘤中的血紅蛋白血紅蛋白，亦稱為根瘤血紅蛋白。這是1939年久保秀雄發(fā)現(xiàn)的。 豆血紅蛋白關(guān)系著根瘤菌固氮的有效性。 豆血紅蛋白存在類菌體的周圍，有截留和釋放氧分子的功能，既為有截留和釋放氧分子的功能，既為類菌體的呼吸作用源源提供分子氧的快速細流，又保護了類菌體內(nèi)固氮類菌體的呼吸作用源源提供分子氧的快速細流，又保護了類菌體內(nèi)固氮酶免與氧直接接觸而受破壞酶免與氧直接接觸而受破壞。豆血紅蛋白存在于植物細胞的液泡中，對氧具有很強的親和力，因此對創(chuàng)造固氮作用所必須的厭氧條件是有利的。 Figure 2.25 The rat insulin gene

35、 with one intron evolved by losing an intron from an ancestor with two interruptions.圖圖2.25 大鼠胰島素祖先基因含有兩個內(nèi)含子，進化過程中丟失了一個，從而其基因結(jié)構(gòu)是由一個內(nèi)含子間隔兩個片段。普通胰島素基因 (雞&大鼠)大鼠的第二條胰島素基因引導(dǎo)大鼠胰島素基因丟失了一大鼠胰島素基因丟失了一個外顯子個外顯子丟失內(nèi)含子丟失內(nèi)含子引導(dǎo)編碼內(nèi)含子外顯子內(nèi)含子外顯子編碼編碼外顯子在肌動蛋白的基因進化中，內(nèi)含子發(fā)生了很多變化Actin genes vary widely in their organizati

36、on. The sites of introns are indicated in purple (肌動蛋白基因的構(gòu)成變化很大，內(nèi)含子的位置在圖中以紫色標示) Figure 2.26 (19個不同的位置, 1% in the population. (我們把在一個基因座上有多條等位基因的現(xiàn)象稱作遺傳多態(tài)性遺傳多態(tài)性（genetic polymorphism ）。當多條等位基因在一個種群中穩(wěn)定當多條等位基因在一個種群中穩(wěn)定存在時，這些等位基因所在的位置被認為是多態(tài)性的存在時，這些等位基因所在的位置被認為是多態(tài)性的。如果某條等位基因在種群中存在的概率大于1 % ，那么我們就可以認為它是多態(tài)性的。

37、) A change in a single nucleotide when alleles are compared is called a single nucleotide polymorphism (SNP). One occurs every 1330 bases in the human genome. Defined by their SNPs, every human being is unique. (當比較等位基因時，其單個核苷酸的改變被稱為單核苷酸多態(tài)性（SNP）。在人類基因組中，大約每1330 個堿基就有一個單核苷酸多態(tài)性。從從SNP SNP 的角度來看，每一個人的基因

38、組都是獨一無的角度來看，每一個人的基因組都是獨一無二的二的，SNP 可以通過不同的方法進行檢測，從直接的序列比較到質(zhì)譜或者生物化學方法，這些方法都是根據(jù)在特定區(qū)域中序列的變化來顯示差異的。 )Figure 3.1 A point mutation that affects a restriction site is detected by a difference in restriction fragments.圖3.1 通過檢測限制片段的大小可以發(fā)現(xiàn)影響酶切位點的點突變DNA在一個區(qū)段上有三個靶位點突變消除了其中一個靶位點酶切產(chǎn)生兩條內(nèi)部片段有一些點突變會改有一些點突變會改變限制圖譜變限制

39、圖譜酶切產(chǎn)生一條內(nèi)部片段片段C A difference in restriction maps between two individuals is called a restriction fragment length polymorphism (RFLP). Basically a RFLP is a SNP that is located in the target site for a restriction enzyme. It can be used as a genetic marker in exactly the same way as any other marker. Instead of examining some feature of the phenotype, we directly assess the genotype,