毛細(xì)管電泳法測(cè)定梔子金花丸中黃芩苷的含量

1、毛細(xì)管電泳法測(cè)定梔子金花丸中黃芩苷的含量                                 作者：楊慧文，王曉可，毋福海 【摘要】  目的 建立梔子金花丸中黃芩苷的含量測(cè)定方法。方法 采用未涂層彈性融硅石英毛細(xì)管柱(60 cm× 75

2、m，有效長(zhǎng)度52 cm)，以40 mmol·L-1硼砂溶液(pH9.0)為運(yùn)行緩沖液;分離電壓為12 kV;重力進(jìn)樣10 s(高度15 cm);檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm;以對(duì)硝基苯甲酸為內(nèi)標(biāo)。結(jié)果 黃芩苷質(zhì)量濃度在7.552.5 g·mL-1范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系(r=0.999 6)，黃芩苷平均回收率為96.7%，RSD值為1.62%(n=6)。結(jié)論 該方法專屬性強(qiáng)，結(jié)果準(zhǔn)確可靠、重現(xiàn)性好，可用于梔子金花丸的質(zhì)量控制。 【關(guān)鍵詞】  毛細(xì)管電泳法;梔子金花丸;黃芩苷Abstract:Objective To establish the method for th

3、e determination of baicalin in Zhizijinhua pills by capillary electrophoresis. Methods The separation was performed in an uncoated fused silica capillary of 60 cm×75 m ID (52 cm effective length).The running buffer wes 40 mmol·L-1 Na2B4O7 buffer solution(pH9.0).The voltage applied was 12 k

4、V. The sample was injected by gravity(10 s，15 cm). The detection wavelength was 280 nm,and the internal standard was pnitrobenzoic acid. Results The linear range of baicalin was 7.5-52.5 g·mL-1(r=0.999 6). The average recovery for baicalin was 96.7%(RSD=1.62%,n=6). Conclusion The method proved

5、to be exclusive,convenient,rapid and well repeatable，and can be used for quantitative determination of Zhizijinhua pills.Key words:capillary electrophoresis;Zhizijinhua pills;baicalin梔子金花丸是由梔子、黃芩、黃連、黃柏等8味藥材制成的中藥成方制劑，具有清熱瀉火、涼血解毒之功效。臨床用于肺胃熱盛，口舌生瘡，牙齦腫痛，目赤眩暈，咽喉腫痛，吐血衄血，大便秘結(jié)等的。梔子金花丸的現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)采用HPLC法測(cè)定制劑中梔子苷的含量

6、1，亦有其他報(bào)道采用HPLC法測(cè)定其中黃芩苷、梔子苷、綠原酸等成分的含量 26，但采用毛細(xì)管電泳法對(duì)梔子金花丸進(jìn)行質(zhì)量控制的方法尚未見報(bào)道。本文采用毛細(xì)管電泳法測(cè)定梔子金花丸中黃芩苷的含量，為更好地控制梔子金花丸質(zhì)量提供了依據(jù)。1 儀器與試藥1.1 儀器CL1030型高效毛細(xì)管電泳儀(北京彩陸儀器有限公司)，KNAUER K2501紫外-可見檢測(cè)器(德國(guó))，HW2000色譜工作站2.17版(南京千譜軟件有限公司)。ORION MODEL 828型pH計(jì)(美國(guó))。DL360超聲波清洗器寧波石浦海天儀器廠，頻率(4.5±0.225)kHZ，功率240 W。未涂層彈性融硅石英毛細(xì)管柱(河北

7、銳年永灃色譜器件有限公司)。1.2 試藥黃芩苷(藥品生物制品檢定所，批號(hào)110715-200815)。梔子金花丸(山東孔圣堂制藥有限公司，批號(hào)090457、090546、090741，規(guī)格 9 g·袋-1)。甲醇為色譜純;硼砂、對(duì)硝基苯甲酸、NaOH均為分析純;水為雙蒸水。2 方法與結(jié)果2.1 溶液的制備2.1.1 內(nèi)標(biāo)溶液的制備 精密稱取對(duì)硝基苯甲酸適量，加水制成100 g·mL-1的內(nèi)標(biāo)貯備液。2.1.2 對(duì)照品貯備液的制備 精密稱取在60 減壓干燥4 h的黃芩苷對(duì)照品15 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品貯備液(黃芩苷質(zhì)量濃度為15

8、0 g·mL-1)。2.1.3 供試品溶液的制備 取梔子金花丸樣品，研碎，取約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%(體積分?jǐn)?shù))甲醇50 mL，稱定重量，超聲處理40 min，放冷，再稱定重量，用70%(體積分?jǐn)?shù))甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，棄去初濾液，精密量取續(xù)濾液10 mL至蒸發(fā)皿中，水浴揮干，再用70%(體積分?jǐn)?shù))甲醇溶解轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加入內(nèi)標(biāo)溶液2.5 mL，用70%(體積分?jǐn)?shù))甲醇稀釋至刻度，搖勻，0.45 m微孔濾膜濾過(guò)，作為供試品溶液。2.1.4 陰性對(duì)照液的制備 取處方組成中除黃芩外的其余藥材，制成不含黃芩的陰性對(duì)照品，按“2.1.3”項(xiàng)下方法

9、處理，即得。2.1.5 運(yùn)行緩沖液的制備 精密稱取硼砂適量，加水制成40 mmol·L-1硼砂溶液(pH=9.0)，0.45 m微孔濾膜濾過(guò)，作為運(yùn)行緩沖液。2.2 電泳條件采用未涂層彈性融硅石英毛細(xì)管柱(60 cm×75 m，有效長(zhǎng)度52 cm);以40 mmol·L-1硼砂溶液(pH9.0)為運(yùn)行緩沖液;分離電壓為12 kV;重力進(jìn)樣10 s(高度15 cm);檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm;溫度為室溫，濕度小于70%。毛細(xì)管柱在使用前依次用0.1 mol·L-1 NaOH溶液和水沖洗1520 min，再用運(yùn)行緩沖液沖洗約5 min。以對(duì)硝基苯甲酸為內(nèi)標(biāo)。在

10、此條件下進(jìn)行測(cè)定，對(duì)照品、供試品、陰性對(duì)照溶液色譜圖見圖1。2.3 方法學(xué)考察2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別吸取對(duì)照品貯備液適量，加甲醇稀釋成黃芩苷質(zhì)量濃度為7.5、15.0、22.5、30.0、37.5、45.0、52.5 g·mL-1，內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量濃度為25.0 g·mL-1的溶液。依次重力進(jìn)樣10 s，每個(gè)濃度測(cè)定3次以上。以對(duì)照品與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)(Y)，黃芩苷質(zhì)量濃度()為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=0.0350-0.0383，r=0.999 6。表明黃芩苷在7.552.5 g·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。2.3.2 精密度試驗(yàn) 取質(zhì)量濃度

11、為30.0 g·mL-1的黃芩苷對(duì)照品溶液，按“2.2”項(xiàng)下電泳條件，連續(xù)測(cè)定5次，記錄峰面積并RSD值。結(jié)果黃芩苷峰面積的RSD=1.99%，表明儀器精密度良好。2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液(批號(hào)090741)，在0、2、4、6、8、12 h分別重力進(jìn)樣10 s，記錄峰面積并計(jì)算RSD。結(jié)果黃芩苷峰面積的RSD=1.65%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)(批號(hào)090741)的梔子金花丸樣品6份，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依法測(cè)定。結(jié)果梔子金花丸中黃芩苷的平均含量為1.63 mg·g-1，RSD=1.62%(n=6)

12、。表明重復(fù)性良好。2.3.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取梔子金花丸樣品(批號(hào)090741)共6份，加入黃芩苷對(duì)照品適量，按“2.1.3”項(xiàng)下方法處理并依法測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。梔子金花丸中黃芩苷的平均回收率為96.7%,RSD=2.15%。表1 加樣回收率試驗(yàn)2.4 樣品測(cè)定取梔子金花丸樣品3批，按“2.1.3”項(xiàng)下方法處理后依法測(cè)定，記錄峰面積，代入回歸方程計(jì)算樣品中黃芩苷的含量，結(jié)果見表2。表2 樣品含量測(cè)定3 討論3.1 提取方法的選擇 有關(guān)文獻(xiàn)7，8中黃芩苷的提取方法，本實(shí)驗(yàn)先后以50%(體積分?jǐn)?shù))甲醇、70%(體積分?jǐn)?shù))甲醇、甲醇為溶劑進(jìn)行超聲提取。結(jié)果表明，樣品采用70%(體

13、積分?jǐn)?shù))甲醇超聲提取基本完全，且黃芩苷與雜質(zhì)峰分離度較好。同時(shí)考察了不同提取時(shí)間(30、40、50 min)對(duì)提取效率的影響，結(jié)果顯示超聲40 min時(shí)提取率已達(dá)最高，超聲時(shí)間延長(zhǎng)而提取率并未提高。因此，確定以70%(體積分?jǐn)?shù))甲醇為提取溶劑，超聲提取40 min。3.2 內(nèi)標(biāo)物的選擇 毛細(xì)管電泳有重現(xiàn)性差的缺點(diǎn)，因此采用內(nèi)標(biāo)法定量。苯甲酸鈉、對(duì)氨基苯甲酸以及對(duì)硝基苯甲酸在280 nm波長(zhǎng)處均有吸收。預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，苯甲酸鈉在體系中不出峰;對(duì)氨基苯甲酸靈敏度低，且出峰時(shí)間與黃芩苷過(guò)于接近，容易產(chǎn)生干擾;對(duì)硝基苯甲酸峰型好，雖出峰時(shí)間與黃芩苷接近，但在樣品中無(wú)干擾，故選其作為內(nèi)標(biāo)物。3.3 運(yùn)行

14、緩沖液的選擇9 黃芩苷極性較強(qiáng)，容易離子化;而在硼砂溶液中，黃芩苷中鄰二羥基基團(tuán)更易形成絡(luò)離子10，加快離子化。因此選擇硼砂溶液為運(yùn)行緩沖液，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定其最佳濃度為40 mmol·L-1。3.4 采用毛細(xì)管電泳法測(cè)定梔子金花丸中黃芩苷含量，與高效液相色譜法相比1，5，6具有樣品用量少，分析成本低等優(yōu)點(diǎn)，并減少了對(duì)環(huán)境的污染，可用于梔子金花丸的質(zhì)量控制?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1 國(guó)藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：2010年版一部M.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010： 879-880.2 郭小龍，蔡敏，陳勇，等.液相色譜法同時(shí)測(cè)定梔子金花丸中梔子苷和鹽酸小檗堿的含量J.湖北大學(xué)

15、學(xué)報(bào):科學(xué)版，2007，29(3)：283-285.3 鄭峰，徐成志.HPLC法測(cè)定梔子金花丸中大黃素、大黃酚的含量J.安徽醫(yī)藥，2007，11 (11)：1006-1007.4 張義友，傅紅，包淑英，等.RP-HPLC測(cè)定梔子金花丸中綠原酸的含量J.中成藥，2005，27(8)：附4-5.5 李志剛.高效液相色譜法測(cè)梔子金花丸的黃芩苷的含量J.中國(guó)城鄉(xiāng)衛(wèi)生，2004，(3)：45.6 高曉燕，盧建秋.梔子金花丸中梔子苷、黃芩苷、番瀉苷A和番瀉苷B的含量測(cè)定方法研究J.中國(guó)中藥雜志，2009，34(20)：2649-2651.7 張勇剛.HPLC法測(cè)定慢嚴(yán)舒檸顆粒中黃芩苷的含量J.武漢生物工程

16、學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，3(3)：144-146.8 李彤彤，李宏，侯茂君，等.黃芩化學(xué)成分及黃芩苷提取方法研究進(jìn)展J.天津藥學(xué)，2002，14(3)：7-8.9 宋粉云，龔紅全，林琳，等.毛細(xì)管電泳法測(cè)定銀黃膠囊及銀黃顆粒中黃芩苷和綠原酸的含量J.廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，23(3)：231-233.10 陳義.毛細(xì)管電泳技術(shù)及應(yīng)用M.北京：化學(xué)出版社，2000.1         2.3 方法學(xué)考察2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別吸取對(duì)照品貯備液適量，加甲醇稀釋成黃芩苷質(zhì)量濃度為7.5、15.0、22.5、30.0

17、、37.5、45.0、52.5 g·mL-1，內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量濃度為25.0 g·mL-1的溶液。依次重力進(jìn)樣10 s，每個(gè)濃度測(cè)定3次以上。以對(duì)照品與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)(Y)，黃芩苷質(zhì)量濃度()為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=0.0350-0.0383，r=0.999 6。表明黃芩苷在7.552.5 g·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。2.3.2 精密度試驗(yàn) 取質(zhì)量濃度為30.0 g·mL-1的黃芩苷對(duì)照品溶液，按“2.2”項(xiàng)下電泳條件，連續(xù)測(cè)定5次，記錄峰面積并RSD值。結(jié)果黃芩苷峰面積的RSD=1.99%，表明儀器精密度良好。2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

18、 取供試品溶液(批號(hào)090741)，在0、2、4、6、8、12 h分別重力進(jìn)樣10 s，記錄峰面積并計(jì)算RSD。結(jié)果黃芩苷峰面積的RSD=1.65%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)(批號(hào)090741)的梔子金花丸樣品6份，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依法測(cè)定。結(jié)果梔子金花丸中黃芩苷的平均含量為1.63 mg·g-1，RSD=1.62%(n=6)。表明重復(fù)性良好。2.3.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取梔子金花丸樣品(批號(hào)090741)共6份，加入黃芩苷對(duì)照品適量，按“2.1.3”項(xiàng)下方法處理并依法測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。梔子金花丸中黃

19、芩苷的平均回收率為96.7%,RSD=2.15%。表1 加樣回收率試驗(yàn)2.4 樣品測(cè)定取梔子金花丸樣品3批，按“2.1.3”項(xiàng)下方法處理后依法測(cè)定，記錄峰面積，代入回歸方程計(jì)算樣品中黃芩苷的含量，結(jié)果見表2。表2 樣品含量測(cè)定3 討論3.1 提取方法的選擇 有關(guān)7，8中黃芩苷的提取方法，本實(shí)驗(yàn)先后以50%(體積分?jǐn)?shù))甲醇、70%(體積分?jǐn)?shù))甲醇、甲醇為溶劑進(jìn)行超聲提取。結(jié)果表明，樣品采用70%(體積分?jǐn)?shù))甲醇超聲提取基本完全，且黃芩苷與雜質(zhì)峰分離度較好。同時(shí)考察了不同提取時(shí)間(30、40、50 min)對(duì)提取效率的影響，結(jié)果顯示超聲40 min時(shí)提取率已達(dá)最高，超聲時(shí)間延長(zhǎng)而提取率并未提高。因

20、此，確定以70%(體積分?jǐn)?shù))甲醇為提取溶劑，超聲提取40 min。3.2 內(nèi)標(biāo)物的選擇 毛細(xì)管電泳有重現(xiàn)性差的缺點(diǎn)，因此采用內(nèi)標(biāo)法定量。苯甲酸鈉、對(duì)氨基苯甲酸以及對(duì)硝基苯甲酸在280 nm波長(zhǎng)處均有吸收。預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，苯甲酸鈉在體系中不出峰;對(duì)氨基苯甲酸靈敏度低，且出峰時(shí)間與黃芩苷過(guò)于接近，容易產(chǎn)生干擾;對(duì)硝基苯甲酸峰型好，雖出峰時(shí)間與黃芩苷接近，但在樣品中無(wú)干擾，故選其作為內(nèi)標(biāo)物。3.3 運(yùn)行緩沖液的選擇9 黃芩苷極性較強(qiáng)，容易離子化;而在硼砂溶液中，黃芩苷中鄰二羥基基團(tuán)更易形成絡(luò)離子10，加快離子化。因此選擇硼砂溶液為運(yùn)行緩沖液，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定其最佳濃度為40 mmol·L-1。3.4 采用毛細(xì)管電泳