果蠅的晝夜生物鐘基因及其作用機(jī)理

1、果蠅的晝夜生物鐘基因及其作用機(jī)理摘要：晝夜節(jié)律生物鐘是一種以近似24 小時(shí)為周期的自主維持的振蕩器，由輸人通路、中央振蕩器和輸出通路三部分組成的。生物鐘機(jī)制的研究已深入到分子水平。生物鐘相關(guān)基因相繼被分離鑒定，它們及其編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物構(gòu)成的自主調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄和翻譯反饋環(huán)是生物鐘運(yùn)轉(zhuǎn)的分子機(jī)制。本文介紹了果蠅主要生物鐘基因及其作用機(jī)理，展望了揭示生物鐘調(diào)節(jié)機(jī)制在遺傳學(xué)上的重要意義。關(guān)鍵詞：晝夜節(jié)律生物鐘，生物鐘基因，分子機(jī)制Abstract: The circadian clock is a self - sustaining oscillator with a period of about 24

2、 hour that includes input ,central oscillator and output . The circadian clock mechanism has been studied extensively at the molecular level and several clock - related genes have been identified. The clock genes and the coded protein comprise the self sustaining feedback loop that can regulate both

3、 on the transcriptional and on the translational level . This article introduced the clock genes and molecular circadian mechanism found in drosophilam. The significance of the circadian clock regulation mechanism research in genetics was also prospected.Keywords: circadian clock, Clock gene, Molecu

4、lar circadian mechanism生物鐘是基因和行為之間的聯(lián)系的一個(gè)強(qiáng)有力的例證，它也揭示了環(huán)境對基因表達(dá)的影響，表現(xiàn)了遺傳和外界因素的相互作用決定有機(jī)體外在的行為。生物鐘是許多有機(jī)體所固有的，從細(xì)菌到人類，這或許是由于有機(jī)體長期接受光照和黑暗循環(huán)的進(jìn)化結(jié)果。最初人們猜想生物鐘可能是因?yàn)橛袡C(jī)體對每天晝夜變化的反應(yīng)，白天尋找食物，晚上休息。但是實(shí)驗(yàn)證明生物體在沒有任何環(huán)境變化的條件下仍表現(xiàn)出以24 小時(shí)為一周期的有節(jié)律的行為。生物鐘能夠使生物體本身的節(jié)律與環(huán)境的節(jié)律同步化，因此生物鐘可以優(yōu)化生物體日常行為的節(jié)律，并且生物鐘確實(shí)影響機(jī)體的健康 1 ,2 。昆蟲經(jīng)過長期的演化，在它們的生

5、命活動和行為中，有著明顯的晝夜節(jié)律性周期變化。許多昆蟲的活動節(jié)律還有季節(jié)性，對于一年發(fā)生多代的昆蟲，各世代在滯育、遷移、交配、生殖等方面對季節(jié)性晝夜變化有明顯的反應(yīng)。這些周期性節(jié)律活動，主要受光周期、溫度等外在因子和內(nèi)在神經(jīng)-內(nèi)分泌物(諸如各種激素)的調(diào)節(jié)和控制。昆蟲的生物鐘種類很多，本文詳細(xì)介紹果蠅的晝夜節(jié)律生物鐘 3 。晝夜鐘可分3 個(gè)部分：(1) 生物振蕩器(oscillator) ，由一組呈節(jié)律表達(dá)的基因及其編碼的蛋白質(zhì)組成。節(jié)律基因啟動后，經(jīng)轉(zhuǎn)錄、翻譯生成相應(yīng)的蛋白質(zhì)。當(dāng)此蛋白質(zhì)濃度達(dá)到一定程度，反饋?zhàn)饔糜谧陨砘虻膯硬课?，使其濃度高低?4 小時(shí)周期進(jìn)行振蕩 4 。在晝夜振蕩反饋

6、回路中，正性成分(positive element)，啟動生物鐘基因，使之進(jìn)行表達(dá)；負(fù)性成分(negative element)，阻斷正性成分的作用，使表達(dá)減弱或停止 5 ，如圖1 所示。振蕩器是生物鐘運(yùn)作的核心元件，它收外界傳入的信號，引起相應(yīng)的基因表達(dá)，進(jìn)而控制鐘信號的輸出路徑，使生物體展現(xiàn)晝夜節(jié)律活動； (2) 輸入系統(tǒng)，接受環(huán)境周期信號傳入到振蕩器，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，矯正節(jié)律位相，由感受器和傳入路徑組成。最重要的授時(shí)因子(Zeitgeber) 為光-暗和溫度；(3) 輸出系統(tǒng)，包括與信號輸出有關(guān)的鐘基因和一些鐘控基因( clock-controlled genes ,CCG)，將母鐘

7、節(jié)律振蕩信號，經(jīng)體液和神經(jīng)途徑送達(dá)效應(yīng)器，調(diào)節(jié)其生理、生化和行為的晝夜節(jié)律 6 。圖1 生物鐘基因反饋調(diào)節(jié)示意圖Fig. 1 A scheme of autoregulatory biological clock gene1 果蠅的晝夜生物鐘基因黑腹果蠅(Drosophilam elanogaster)是研究晝夜生物鐘的重要模式生物，其蛹的羽化和成蟲的行為活動均呈現(xiàn)晝夜節(jié)律性。果蠅類鐘基因的研究上世紀(jì)70 年代初已開始，積累資料頗豐。它的主鐘由位于腦部的兩簇神經(jīng)元組成，位于腦部。以后研究發(fā)現(xiàn)，在其身體其他組織亦有鐘結(jié)構(gòu)。到現(xiàn)在為止，在果蠅上已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了7 個(gè)基因主要參與中樞鐘的調(diào)節(jié)，它們是：pe

8、riod (per ) , timeless ( tim) , clock(clk) , cycle (cyc) , vrille (vri) , double - time ( dbt) 和Crypto-chrome ( cry) 7 。1.1 per 基因per 是1993 年首次被鑒定和克隆成功的鐘基因，長10kb，可編碼1200 氨基酸的蛋白質(zhì)，其中一個(gè)氨基酸被取代，就會使周期和轉(zhuǎn)錄循環(huán)發(fā)生改變。per 缺陷可改變生物節(jié)律。業(yè)已證實(shí)，它有3 個(gè)變異的等位基因：長周期基因、短周期基因和無周期基因，分別使果蠅的周期長度變?yōu)?8 小時(shí)、19 小時(shí)或無節(jié)律。我們現(xiàn)在對晝夜鐘的認(rèn)識是從per 的

9、結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)和產(chǎn)物開始的 8 。per 是果蠅的主控基因，影響晝夜節(jié)律和超日節(jié)律。per經(jīng)轉(zhuǎn)錄和翻譯后，形成PER 蛋白，組成鐘的反饋回路。但其須與另一種鐘蛋白組成異二聚體后，才能作為負(fù)性成分發(fā)揮作用 9 。per可在果蠅成蟲的眼、觸角、腦(神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞) 、胸神經(jīng)節(jié)、唾腺、卵巢、消化道和馬氏管等許多組織中表達(dá) 3 。在per mRNA 中部有一個(gè)編碼約20對蘇氨酸甘氨酸重復(fù)( TG重復(fù))的區(qū)域。TG的缺失對晝夜節(jié)律并不產(chǎn)生影響，但卻使果蠅的求偶鳴聲節(jié)律變慢 3 。per上游有一段69bp的增強(qiáng)子序列，其中的E-box ( enhancer)是per mRNA高水平表達(dá)所必需的。1.2 ti

10、m 基因永恒基因tim是果蠅的第二個(gè)生物鐘基因，它對per進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)，在細(xì)胞核內(nèi)定位和蛋白質(zhì)穩(wěn)定性等方面起作用 10 。tim基因是在無明顯晝夜節(jié)律的果蠅pero中發(fā)現(xiàn)的，并已證明是果蠅晝夜節(jié)律功能所必需的，其翻譯產(chǎn)物TIM 是一種酸性蛋白質(zhì)，N端含有核定位序列(信號肽)，C端富含酸性氨基酸，具有轉(zhuǎn)錄活化結(jié)合結(jié)構(gòu)域。從果蠅中分離到的一種蛋白激酶基因產(chǎn)物DBT，一方面使PER不穩(wěn)定，另一方面使磷酸化后的PER與TIM結(jié)合形成穩(wěn)定異二聚體 11 。per 和tim 在下午提高轉(zhuǎn)錄水平，黃昏時(shí)mRNA 達(dá)高峰，PER和TIM蛋白的積累峰在6 小時(shí)后出現(xiàn)，二者形成異二聚體進(jìn)入核內(nèi)，作為負(fù)性成分發(fā)揮

11、作用。黎明后光使TIM降解，致使PER不穩(wěn)定，導(dǎo)致PERTIM 對CLOCKCYC 的抑制作用降低，開啟新一輪的循環(huán)。時(shí)間生物學(xué)研究表明，光暗周期可導(dǎo)引晝夜節(jié)律使其位相重調(diào)。在黑夜的早期給果蠅光照，使晝夜周期延長，由于此時(shí)tim 的mRNA 處于高峰期穩(wěn)定，TIM被光解后可能迅速被新合成的TIM 替補(bǔ)，系統(tǒng)推遲節(jié)律后再回到光照前的位點(diǎn)上；在夜間晚期給予光照，晝夜節(jié)律縮短，這可能由于大TIM被光降解，此時(shí)正處于節(jié)律的低谷期，很少或無tim mRNA 替補(bǔ)之故。1.3 clk 基因CLOCK最早是從小鼠中分離出來的生物鐘基因產(chǎn)物，是由Clock編碼的轉(zhuǎn)錄因子。結(jié)構(gòu)中含有PAS-bhlh (堿基-

12、螺旋- 環(huán)- 螺旋)結(jié)構(gòu)域，且C端富含具有轉(zhuǎn)錄激活作用的Gln (即Q-rich) 。1.4 cyc 基因果蠅的CLOCK和CYC通常以異二聚體形式，發(fā)揮正性調(diào)節(jié)作用。per 和tim 兩種基因啟動子的E-box是其作用的目標(biāo)靶。CLOCKCYC 異二聚體，激活per 、tim 基因轉(zhuǎn)錄，生成PER 和TIM 兩種蛋白。而且也激活vri 、pdf 、ccg 等基因生成蛋白質(zhì)或引起相應(yīng)生物學(xué)效應(yīng)12 。1.5 dbt 基因dbt 基因產(chǎn)物DBT 是一種蛋白激酶，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)對PER進(jìn)行磷酸化，使其穩(wěn)定性降低，從而易于與TIM 結(jié)合。二者結(jié)為異二聚體后性能穩(wěn)定，進(jìn)入細(xì)胞核12。1.6 vri 基因果

13、蠅晝夜生物鐘vri基因的作用現(xiàn)在還難以確定。它是在分離野生型和無節(jié)律型per01基因突變體的不同轉(zhuǎn)錄本時(shí)發(fā)現(xiàn)的。測序發(fā)現(xiàn)它是一個(gè)已知的編碼bZip轉(zhuǎn)錄因子的基因，對于生長發(fā)育有重要的作用。vri的mRNA周期表達(dá)隨per/tim 基因表達(dá)水平而改變，并受CLOCK/CYC與E-box結(jié)合的調(diào)節(jié)。反過來，在表達(dá)tim 基因的細(xì)胞中， vri基因的持續(xù)活化可抑制per和tim 基因的轉(zhuǎn)錄。vri基因的長時(shí)程表達(dá)可經(jīng)轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)機(jī)制降低PDF的水平，而PDF水平的下降可能是果蠅長周期及無節(jié)律表型增加的原因。在這些表型突變的果蠅中，已發(fā)現(xiàn)vri基因的水平是恒定的。vri基因的mRNA在果蠅腹部神經(jīng)元(L

14、Ns) 和光受體細(xì)胞上進(jìn)行表達(dá)，其產(chǎn)物VRI可能是生物振蕩器的中心成分之一。VRI一旦被破壞，可以打破其他基因產(chǎn)物如TIM 等的正常循環(huán) 13 。1.7 cry 基因隱色素(Cryp tochrome, CRY)是由cry基因編碼的一種對藍(lán)光極為敏感的黃素蛋白光受體。作為光受體,接受光波并將其傳遞到振蕩器的鐘基因。首先在擬南芥中分離鑒定，能介導(dǎo)擬南芥的生長、開花時(shí)間和向光 14 。1996年克隆出了哺乳動物的同源蛋白mCRY，并發(fā)現(xiàn)mCRY蛋白也作為感光受體表達(dá)于哺乳動物的視網(wǎng)膜內(nèi)核層中，它在光信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要的作用。果蠅的cry 基因突變成cryb后，突變體果蠅腦的晝夜鐘表現(xiàn)正常，但外周鐘則

15、變的無節(jié)律，這種現(xiàn)象提示中樞鐘與外周鐘的機(jī)制不同 15 。Fernanda等研究表明 16 ，CRY接受光信號刺激后，發(fā)生光化學(xué)變化，在胞漿和細(xì)胞核中直接與TIM發(fā)生光依賴性結(jié)合，促使PER /TIM復(fù)合物失活，從而終止其在反饋環(huán)路中的作用。果蠅的光受體除了CRY之外，神經(jīng)元的振蕩器還可能從其它輸入途徑獲得光信號。隱色素開始是作為一種植物光受體，后來又在動物中找到了它的同源基因，這是為數(shù)不多的從植物到動物神經(jīng)系統(tǒng)之間的進(jìn)化聯(lián)系，未來的研究需著眼于果蠅與哺乳動物CRY的不同功能。2 果蠅晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)的分子機(jī)制果蠅的晝夜節(jié)律，在蛹期是測定種群中個(gè)體之間羽化高峰的小時(shí)數(shù)，在成蟲期則是測定個(gè)體靜止/運(yùn)

16、動周期的時(shí)間。目前認(rèn)為，果蠅生物鐘節(jié)律的起搏點(diǎn)是一種“轉(zhuǎn)錄翻譯抑轉(zhuǎn)錄”機(jī)制構(gòu)成的反饋環(huán)路。此反饋環(huán)的具體作用方式如圖2。TIM通過與PER 的異型結(jié)合，調(diào)節(jié)PER 進(jìn)入核的時(shí)間進(jìn)而調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律行為。但是兩者都不具有DNA 結(jié)合活力，因此，PER可能通過其PAS 域或之外的區(qū)域與其他含有bHLH-PAS域的生物鐘基因結(jié)合，來進(jìn)行負(fù)反饋調(diào)節(jié)。最近發(fā)現(xiàn)， per 上游的增強(qiáng)子序列中的1 個(gè)E-box (enhancer box) 是per RNA 高水平表達(dá)所必需的。而tim 的E-box 的作用方式有所不同，它需和上游相鄰的順式作用因子結(jié)合在一起，進(jìn)而促進(jìn)tim mRNA 的高水平表達(dá)；同時(shí)，E-

17、box 還是bHLH 異型二聚蛋白的結(jié)合部位。而在此機(jī)制中恰好有2 個(gè)含有bHLH-PAS 域的轉(zhuǎn)錄因子CLOCK 和CYCLE ，兩者之間通過它們的PAS 域相互作用，形成CLOCK-CYCLE 異二聚體結(jié)合到per 和tim 的E-box 增強(qiáng)子上，分別驅(qū)動per和tim 的表達(dá)。隨著PER 和TIM 的積累并進(jìn)入核內(nèi)，它們與dCLOCK-CYCLE 相互作用導(dǎo)致異二聚體改變構(gòu)象或者掩蓋它的結(jié)構(gòu)域，進(jìn)而阻遏CLOCK-CYCLE與E-box 的結(jié)合，消減了per 和tim 的轉(zhuǎn)錄；與此同時(shí)，通過一個(gè)獨(dú)立的激活因子或激活因子復(fù)合物又可以促進(jìn)dClk 的轉(zhuǎn)錄。與之相對應(yīng)，在缺少PER-TIM的

18、情況下，高水平的dCLK-CYC 可以激活per和tim 的轉(zhuǎn)錄，同時(shí)抑制dClk 的轉(zhuǎn)錄，其作用方式可能是直接或間接的，這樣就形成了2 個(gè)相互調(diào)節(jié)的反饋環(huán)，從而驅(qū)動果蠅生物節(jié)律內(nèi)部生物鐘的正常運(yùn)轉(zhuǎn)。這個(gè)生物鐘再經(jīng)過一些尚未知的調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性及磷酸化的蛋白的放大作用，而使生物體具有節(jié)律性。此回路中的DBT(double-time 基因的表達(dá)產(chǎn)物) 影響PER 的磷酸化過程，進(jìn)而調(diào)節(jié)PER的穩(wěn)定性，DBT 很可能是PER翻譯后的調(diào)節(jié)因子17。圖2果蠅的生物鐘的調(diào)節(jié)模式Fig2Model for gene regulation within the Drosophila biological

19、clock3 展望有關(guān)生物鐘基因的研究頗多，就鐘基因之間的相互作用來說，由于牽涉的因素較多，提出來的生物體整個(gè)生物鐘節(jié)律的一些假想的調(diào)節(jié)模式還有待于進(jìn)一步證實(shí)。生物節(jié)律普遍存在于生物的各級水平，是生命科學(xué)的重大基礎(chǔ)理論問題。由于鐘基因的發(fā)現(xiàn)和活動規(guī)律的揭示，使這問題的研究獲得突破性進(jìn)展。盡管在較短時(shí)間內(nèi)，人們對近日節(jié)律的認(rèn)識取得了很大的進(jìn)步，但僅僅是一個(gè)開始,還存在許多未知領(lǐng)域。在晝夜節(jié)律行為方面，有些實(shí)驗(yàn)動物生物鐘突變體的表型與多種人類疾病具有驚人的相似性。生物鐘基因的研究有助于對遺傳性疾病的了解。鐘基因突變可使機(jī)體晝夜周期延長或縮短，從而造成機(jī)體與環(huán)境不能同步，導(dǎo)致精神性疾患。生物鐘基因運(yùn)

20、作機(jī)制的深入研究，對揭示生命節(jié)律性活動的本質(zhì)、生物進(jìn)化的分子基礎(chǔ)和開拓遺傳學(xué)研究新領(lǐng)域具有重要意義，可為醫(yī)療保健和農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐，提供新的理論依據(jù)。參考文獻(xiàn)：1 Beaver LM, Gvakharia BO, Vollintine , et al. Loss of circadian clock function decreases reproductive fitness in males of Drosophila melanogasterJ . Proc Natl Acad Sci USA ,2002 ,99 : 2134 2139.2 Ouyang Y, Andersson C R

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