熒光定量PCR技術(shù)

1、常規(guī)PCR中，在擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束之后，我們一般通過(guò)凝膠電泳的方法對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行定性的分析，無(wú)法對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)，也無(wú)法對(duì)起始模板準(zhǔn)確定量，而很多情況下，我們所感興趣的是起始模板量，如轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物中插入某種外源基因的拷貝數(shù)或者病人中某種病毒DNA/RNA的精確copy數(shù)等，如此，熒光定量PCR技術(shù)便應(yīng)運(yùn)而生。1、熒光定量PCR概念所謂定量PCR技術(shù)（real-time PCR），是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)特定數(shù)學(xué)原理對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法（如下圖）。2、熒光定量PCR與普通PCR的主要區(qū)別理論上PCR是一個(gè)指數(shù)增長(zhǎng)的過(guò)程，但

2、是實(shí)際的PCR擴(kuò)增曲線并不是標(biāo)準(zhǔn)的指數(shù)曲線，而是S形曲線。這是因?yàn)殡S著PCR循環(huán)的增多，擴(kuò)增規(guī)模迅速增大，Taq酶、dNTP、引物，甚至DNA模板等各種PCR要素逐漸不敷需求，PCR的效率越來(lái)越低，產(chǎn)物增長(zhǎng)的速度就逐漸減緩。當(dāng)所有的Taq酶都被飽和以后，PCR就進(jìn)入了平臺(tái)期。由于各種環(huán)境因素的復(fù)雜相互作用，不同的PCR反應(yīng)體系進(jìn)入平臺(tái)期的時(shí)機(jī)和平臺(tái)期的高低都有很大變化，難以精確控制。所以，即使是96次PCR重復(fù)實(shí)驗(yàn)，各種條件基本一致，所得結(jié)果有很大差異（如下圖），所以在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中我們不能根據(jù)最終PCR產(chǎn)物的量直接計(jì)算出起始DNA拷貝數(shù)。而從上圖我們也可以看出，雖然相同模版在同一臺(tái)PCR儀上進(jìn)行

3、96次擴(kuò)增，終點(diǎn)處檢測(cè)產(chǎn)物量不恒定，但96次PCR擴(kuò)增曲線都有一個(gè)共同的拐點(diǎn)，而且拐點(diǎn)極具重現(xiàn)性，為熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。3、幾個(gè)基本概念為了使大家更好的理解、掌握熒光定量PCR技術(shù)，接下來(lái)有必要向大家介紹幾個(gè)最基本的概念。3.1擴(kuò)增曲線為了更好的理解熒光定量PCR原理，我將用樣品擴(kuò)增曲線來(lái)進(jìn)行說(shuō)明。描述PCR動(dòng)態(tài)進(jìn)程的曲線即擴(kuò)增曲線。前面我們也了解到，PCR的擴(kuò)增曲線實(shí)際上并不是一條標(biāo)準(zhǔn)的指數(shù)曲線，而是呈S型曲線(如下圖)從上圖我們可以很直觀的看出，熒光定量PCR擴(kuò)增曲線可以分成三個(gè)階段：熒光背景信號(hào)階段（基線期），熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段（對(duì)數(shù)期）和平臺(tái)期。在基線期，擴(kuò)增的熒

4、光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋，我們無(wú)法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺(tái)期，擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級(jí)的增加。由于PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒(méi)有線性關(guān)系，所以根據(jù)最終的PCR產(chǎn)物量不能計(jì)算出起始DNA拷貝數(shù)。只有在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段，PCR產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，我們可以選擇在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析。32熒光閾值我們一般把熒光PCR的前15個(gè)循環(huán)信號(hào)作為熒光本底信號(hào)（baseline，基線期），即樣本的熒光背景值和陰性對(duì)照的熒光值，擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋。熒光閾值是在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個(gè)值，它可以設(shè)定在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上，熒光域值的缺省設(shè)置是315個(gè)

5、循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍（機(jī)器自動(dòng)設(shè)置）。我們?cè)谧鰺晒舛縋CR實(shí)驗(yàn)時(shí)，經(jīng)常采用手動(dòng)設(shè)置，手動(dòng)設(shè)置的原則要大于樣本的熒光背景值和陰性對(duì)照的熒光最高值，同時(shí)要盡量選擇進(jìn)入指數(shù)期的最初階段，真正的信號(hào)是熒光信號(hào)超過(guò)域值（如下圖）。33 Ct值了解了熒光閾值的概念后，Ct值就很好理解了。C代表Cycle，t代表threshold，所謂Ct值就是在熒光PCR擴(kuò)增過(guò)程中，當(dāng)擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)過(guò)的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)。如上圖所示，黑色的線顯示的是熒光閾值，當(dāng)信號(hào)超過(guò)黑色線時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)即為Ct值。因?yàn)镃t值即達(dá)到熒光閾值所經(jīng)過(guò)的循環(huán)數(shù)，所以它就與模版的拷貝數(shù)存在著線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)

6、越多，經(jīng)過(guò)的循環(huán)數(shù)就越少，Ct值也就越小，反之亦然。正常的CT值范圍在18-30之間，過(guò)大和過(guò)小都將影響實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的精度。前面也提到過(guò)，同一模板經(jīng)過(guò)96次PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物雖然不恒定，但Ct值極具重現(xiàn)性。根據(jù)這個(gè)特點(diǎn)，我們可以利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)樣品的Ct值做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，只要在同一次PCR實(shí)驗(yàn)中得到未知樣品的Ct值，就可以根據(jù)曲線算出該未知樣品的起始拷貝數(shù)。34標(biāo)準(zhǔn)曲線在絕對(duì)定量實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，我們可以將已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)瑢⑽粗獦悠泛吞荻认♂尩臉?biāo)準(zhǔn)品在同一熒光PCR實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行反應(yīng)，將稀釋標(biāo)準(zhǔn)品得到的Ct值構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線可以推算出未知樣品的量（如下圖）。熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)

7、曲線示意圖理論上，一系列稀釋樣品的擴(kuò)增曲線之間有均勻的間距（上圖左），如果PCR反應(yīng)呈理想的方式擴(kuò)增，產(chǎn)物在每一循環(huán)都加倍，熒光曲線之間的間距則符合等式“2n稀釋倍數(shù)”，n為2樣本間Ct值差。例如：10倍稀釋的樣本，2n10，可得n3.32，Ct值差3.32。35擴(kuò)增效率擴(kuò)增效率與標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率相關(guān)，計(jì)算方程為：擴(kuò)增效率（E）10-1/斜率。理論上，在每個(gè)指數(shù)擴(kuò)增循環(huán)中，PCR產(chǎn)物的量加倍，即PCR產(chǎn)物2倍增加，反應(yīng)效率為2，擴(kuò)增效率就為2，就可得210-1/斜率，標(biāo)準(zhǔn)曲線得斜率就為-3.32，斜率得絕對(duì)值與熒光曲線間距相同。如果將擴(kuò)增效率用百分率來(lái)表示，即：E%=(E-1)×100

8、%，對(duì)于理想的PCR反應(yīng)，E=2，即：擴(kuò)增效率E%=(2-1)×100%=100%如果E1.92，帶入方程(1.92-1)×100%=92%，表示每個(gè)循環(huán)的終點(diǎn)，擴(kuò)增產(chǎn)物的拷貝數(shù)增加1.92倍，或每次循環(huán)有92的模板被擴(kuò)增。一般說(shuō)來(lái)，擴(kuò)增效率接近100是優(yōu)化的重復(fù)性好實(shí)驗(yàn)的最好標(biāo)志，實(shí)際操作時(shí)，反應(yīng)的擴(kuò)增效率應(yīng)該在90105之間，如果擴(kuò)增效率低，可能的原因是引物設(shè)計(jì)不當(dāng)，或者反應(yīng)條件未優(yōu)化；擴(kuò)增效率大于100時(shí)，可能的原因是系列稀釋樣品加樣錯(cuò)誤，或者有非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增，如引物二聚體產(chǎn)生。用上述方法確定擴(kuò)增效率時(shí)，反應(yīng)體系中的抑制劑的出現(xiàn)也可能導(dǎo)致擴(kuò)增效率明顯增加，原因是高濃

9、度模板樣本中抑制劑的濃度低，導(dǎo)致反應(yīng)的Ct值延遲出現(xiàn)，而低濃度模板樣本中抑制劑濃度高，反應(yīng)的Ct值延遲程度小，導(dǎo)致斜率的絕對(duì)值以及計(jì)算所得的擴(kuò)增效率會(huì)增加。如果擴(kuò)增效率小于90或大于105，建議重新設(shè)計(jì)引物或探針。4、熒光定量PCR的方法接下來(lái)我們就來(lái)了解一下熒光定量的主要方法，我們?nèi)绾芜x擇合適的方法？熒光定量PCR所使用的熒光化學(xué)可分為兩種：熒光探針和熒光染料。而熒光定量 PCR 的方法相應(yīng)的可分為特異類(lèi)和非特異類(lèi)兩類(lèi)，特異性檢測(cè)方法是在PCR反應(yīng)中利用標(biāo)記熒光染料的基因特異寡核苷酸探針來(lái)檢測(cè)產(chǎn)物；而非特異性檢測(cè)方法是在在PCR反應(yīng)體系中，加入過(guò)量熒光染料，熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，

10、發(fā)射出熒光信號(hào)。前者由于增加了探針的識(shí)別步驟，特異性更高，但后者則簡(jiǎn)便易行。熒光定量PCR最常用的方法是DNA結(jié)合染料SYBR Green的非特異性方法和Taqman水解探針的特異性方法，在這里主要介紹這2種方法，其它方法請(qǐng)參考其它熒光定量PCR資料。41非特異性SYBR Green I染料法SYBR Green I是一種結(jié)合于所有dsDNA雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色激發(fā)波長(zhǎng)的染料（結(jié)合示意圖），在游離狀態(tài)下，SYBR Green I發(fā)出微弱的熒光，但一旦與雙鏈DNA結(jié)合后，熒光大大增強(qiáng)（作用機(jī)理圖）。因此，SYBR Green I的熒光信號(hào)強(qiáng)度與雙鏈DNA的數(shù)量相關(guān)，可以根據(jù)熒光信號(hào)檢測(cè)出PC

11、R體系存在的雙鏈DNA數(shù)量。SYBR Green I與DNA雙螺旋小溝區(qū)域結(jié)合示意圖SYBR Green I的優(yōu)點(diǎn)： 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，僅需要設(shè)計(jì)上下游一對(duì)引物，不需要設(shè)計(jì)探針，無(wú)需設(shè)計(jì)多個(gè)探針即可快速檢驗(yàn)多個(gè)基因，通用性好；成本低；能夠通過(guò)溶解曲線分析檢驗(yàn)擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。因而在低通量實(shí)驗(yàn)和單重實(shí)驗(yàn)時(shí)一般優(yōu)先考慮使用SYBR Green I染料法。SYBR Green I的缺點(diǎn)：由于 SYBR Green I 與所有的雙鏈 DNA 相結(jié)合，因此由引物二聚體、單鏈二級(jí)結(jié)構(gòu)以及錯(cuò)誤的擴(kuò)增產(chǎn)物引起的假陽(yáng)性會(huì)影響定量的精確性，SYBR Green I方法對(duì)PCR擴(kuò)增特異性要求較高。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中通過(guò)溶解曲線

12、來(lái)分析產(chǎn)物的均一性有助于分析由SYBR Green I得到定量結(jié)果。另外，因?yàn)镾YBR Green I 不能區(qū)分不同擴(kuò)增子發(fā)出的熒光而導(dǎo)致它不能用于多重反應(yīng)。溶解曲線分析溶解曲線分析可以用來(lái)確定不同的反應(yīng)產(chǎn)物，包括非特異性產(chǎn)物。擴(kuò)增反應(yīng)完成后，通過(guò)逐漸增加溫度同時(shí)監(jiān)測(cè)每一步的熒光信號(hào)來(lái)產(chǎn)生溶解曲線，隨著反應(yīng)中雙鏈DNA變性，熒光染料又回復(fù)到游離狀態(tài)導(dǎo)致熒光信號(hào)降低，用熒光信號(hào)改變的負(fù)的一次導(dǎo)數(shù)與溫度作圖，在擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解溫度上有一特征峰（Tm，DNA雙鏈解鏈50的溫度），用這個(gè)特征峰就可以將特異產(chǎn)物與其它產(chǎn)物如引物二聚體區(qū)分開(kāi)，因?yàn)樗鼈冊(cè)诓煌臏囟热芙猓ㄈ缦聢D）。42特異性Taqman水解探針

13、法Taqman熒光定量技術(shù)是以Taqman熒光探針為基礎(chǔ)，Taqman熒光探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)熒光發(fā)射基團(tuán)和一個(gè)熒光淬滅基團(tuán)。探針完整時(shí)，發(fā)射基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的53外切酶活性將探針酶切降解，使熒光發(fā)射基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。從而實(shí)現(xiàn)定量（如下圖）。常用的熒光基團(tuán)是FAM, TET, VIC, HEX。由于Taqman探針?lè)ㄖ校锿猓€使用了一條特異的探針，因此此方法可以特異的檢測(cè)目標(biāo)序列，防止非特異產(chǎn)物的干擾影響定

14、量的準(zhǔn)確性，同時(shí)它也可以用于多重反應(yīng)，但探針設(shè)計(jì)成本較高，有時(shí)探針設(shè)計(jì)困難。了解了熒光定量的方法后，下面讓我們一起來(lái)看看熒光定量的分析方法，我們?nèi)绾胃鶕?jù)我們的實(shí)驗(yàn)材料、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膩?lái)選擇合適的分析方法？5、熒光定量分析方法我們?cè)谠O(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的時(shí)候通常對(duì)下列事情更感興趣：1）測(cè)定未知樣品的絕對(duì)量：如給定的血樣中的病毒顆粒數(shù)，食品中某一種轉(zhuǎn)基因成分的含量；2）未知樣品與已知樣品相比，基因的表達(dá)量改變了多少倍：如相當(dāng)量的腫瘤組織和正常組織相比，p53mRNA改變了多少倍。分析這兩種假設(shè)的方法就分別叫絕對(duì)定量和相對(duì)定量。絕對(duì)定量是通過(guò)樣品的Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較實(shí)現(xiàn)的。分析的結(jié)果是給定數(shù)量的樣品中（給定數(shù)量

15、的細(xì)胞，每微克總RNA）中核酸的量（拷貝數(shù)、微克）。相對(duì)定量的分析結(jié)果是在相當(dāng)量的試驗(yàn)組（樣品A）和對(duì)照組（樣品B）中一個(gè)靶基因的相對(duì)比率（倍數(shù)差異）。接下來(lái)我們就來(lái)看看我們?cè)趯?shí)驗(yàn)過(guò)程中如何來(lái)使用絕對(duì)定量和相對(duì)定量的分析方法。51絕對(duì)定量分析方法511絕對(duì)定量分析方法的使用條件在這里我將舉例來(lái)說(shuō)明我們?cè)趯?shí)驗(yàn)過(guò)程中，何種實(shí)驗(yàn)需要用絕對(duì)定量來(lái)進(jìn)行分析。醫(yī)生對(duì)一個(gè)乙肝病人的每毫升血液中HBV DNA的精確拷貝數(shù)感興趣。首先醫(yī)生要從病人血液中提取DNA，然后通過(guò)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)來(lái)確定HBV病毒DNA的copy數(shù)。通過(guò)病人樣品的Ct值和設(shè)置梯度稀釋的已知HBV對(duì)照樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較，醫(yī)生就能確定病

16、人血液中HBV病毒DNA的copy數(shù)。從這個(gè)例子，我們也可以看出，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，如果最終的結(jié)果是對(duì)未知樣品的定量描述，并不依賴(lài)別的樣品的性質(zhì)的時(shí)候，就應(yīng)該使用絕對(duì)定量進(jìn)行分析。512絕對(duì)定量數(shù)據(jù)處理（舉例）：確定某病人的血液提取的HBV病毒的精確量如：PCR反應(yīng)結(jié)束后，我們得到如下數(shù)據(jù)：copies/ml        Ct1        Ct2        Ct3     

17、0;  Mean Ct        STD5×103        27.61        27.58        27.84        27.67667        0.135×104&

18、#160;       24.25        24.42        24.55        24.40667        0.085×105        21.11       

19、; 21.04        21.16        21.10333        0.065×106        18.05        18.06        18.21    

20、;    18.10667        0.08BLANK        None        None        None                sample      &

21、#160; 23.25        23.46        23.39        23.36667        0.05注：平行樣的Ct值之間的差<0.5時(shí)表示重復(fù)性較好直接從熒光PCR儀上就可以得到標(biāo)準(zhǔn)曲線：從標(biāo)準(zhǔn)曲線可以看出： r20.9995，大于0.98，標(biāo)準(zhǔn)差都在0.2范圍內(nèi)，而E=10-1/-3.2013=2.04，擴(kuò)增

22、效率（2.041）×100%=104%，表示定量準(zhǔn)確，可將未知樣品的Ct值帶入方程：23.36667= -3.2013 X + 30.827  可得X2.33所以copies(5×104/2) ×2.335.825×104但我們需要注意的是，標(biāo)準(zhǔn)曲線只可能用于推算稀釋梯度范圍內(nèi)的未知樣本的量，而不能外推稀釋梯度外的未知樣本的含量。所以，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)過(guò)程中盡可能使未知樣品的濃度在標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋范圍內(nèi)。52相對(duì)定量分析方法521相對(duì)定量分析方法的使用條件同絕對(duì)定量分析類(lèi)似，我將舉例來(lái)說(shuō)明我們?cè)趯?shí)驗(yàn)過(guò)程中何種實(shí)驗(yàn)需要用相對(duì)定量來(lái)進(jìn)行分析。我們?nèi)?/p>

23、果想知道經(jīng)過(guò)藥物處理過(guò)的組織和未處理的組織中某一目的基因的表達(dá)水平是否有差異，相差多少倍？我們可以選擇以下2種方式：1)我們可以從等量的2種組織中提取RNA，分別進(jìn)行目的基因的反轉(zhuǎn)錄特異性熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)來(lái)確定目的基因在2種組織中的表達(dá)量，結(jié)果可以反映等量的2種組織中目的基因表達(dá)量的比率。2）如果我們之前已經(jīng)確定2種組織中看家基因如GAPDH的表達(dá)量相等，那么，我們就可以從大約等量（不需要等量）的2種組織中分別提取RNA，通過(guò)RT-qPCR實(shí)驗(yàn)來(lái)確定2種組織中目的基因和看見(jiàn)基因的表達(dá)水平。藥物處理組織的目的基因的表達(dá)量可由2種組織中看家基因和未處理組織中目的基因的表達(dá)量共同來(lái)確定。2種分析方

24、法的差異就在于用的標(biāo)準(zhǔn)有所不同，方法1）中的標(biāo)準(zhǔn)是2種組織的量相等；方法2）中的標(biāo)準(zhǔn)是2種組織中看家基因如GAPDH的表達(dá)量恒定不變；522相對(duì)定量數(shù)據(jù)處理（舉例2-Ct法）：藥物處理后和處理前某組織X基因表達(dá)量的變化5221溶解曲線繪制與分析熔解曲線的設(shè)置是在整個(gè)PCR完成后進(jìn)行，從60升至95，每升高1儀器會(huì)自動(dòng)收集熒光信號(hào)，得到的熔解曲線是逐漸下降的過(guò)程，且在Tm值下降最快，為方便分析，我們將溫度與熒光強(qiáng)度的變化求導(dǎo)，即得到單峰的熔解曲線，這樣我們就可以證明引物的特異性良好，實(shí)驗(yàn)結(jié)果不受非特異性擴(kuò)增和引物二聚體的干擾（如下圖，左為GAPDH基因，右為X基因）。5222數(shù)據(jù)處理 

25、 樣品    X基因 Mean Ct值    GAPDH基因 Mean Ct值    Ct    Ct    2-Ct    未處理樣品    26.52    20.34    6.18            藥物處理樣品    24.18