2006年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)

1、20062006年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)演講人：演講人： 魏瑋魏瑋RNARNA干擾機(jī)制干擾機(jī)制一一 獲獎(jiǎng)?wù)吆?jiǎn)介獲獎(jiǎng)?wù)吆?jiǎn)介安德魯安德魯法爾法爾( (Andrew Fire) ) 19591959年出生于美國(guó)加利福尼亞州圣克年出生于美國(guó)加利福尼亞州圣克拉拉縣拉拉縣19831983年獲美國(guó)麻省理工學(xué)院生物學(xué)博年獲美國(guó)麻省理工學(xué)院生物學(xué)博士學(xué)位士學(xué)位 現(xiàn)任斯坦福大學(xué)斯坦福醫(yī)學(xué)院病理學(xué)現(xiàn)任斯坦福大學(xué)斯坦福醫(yī)學(xué)院病理學(xué)和遺傳學(xué)教授和遺傳學(xué)教授 克雷格克雷格梅洛（梅洛（Craig C. Mello ）19601960年年 出生于美國(guó)出生于美國(guó)19901990年獲得哈佛大學(xué)生物年獲得哈佛大學(xué)生物學(xué)博士學(xué)位

2、學(xué)博士學(xué)位 現(xiàn)任美國(guó)哈佛大學(xué)馬薩諸現(xiàn)任美國(guó)哈佛大學(xué)馬薩諸塞州醫(yī)學(xué)院分子醫(yī)學(xué)教授塞州醫(yī)學(xué)院分子醫(yī)學(xué)教授 二二 RNAi 機(jī)制機(jī)制 1.1.RNAi 背景背景 RNA interference 由雙鏈由雙鏈RNA（Double Strand RNA簡(jiǎn)稱簡(jiǎn)稱dsRNA）指導(dǎo)的，在特定酶參與）指導(dǎo)的，在特定酶參與下，以外源或內(nèi)源下，以外源或內(nèi)源mRNA為降解目標(biāo)，在轉(zhuǎn)錄后為降解目標(biāo)，在轉(zhuǎn)錄后水平上使特異性靶基因發(fā)生的沉默現(xiàn)象水平上使特異性靶基因發(fā)生的沉默現(xiàn)象 生物界普遍存在的一種古老而進(jìn)化的高度保守生物界普遍存在的一種古老而進(jìn)化的高度保守的生物學(xué)現(xiàn)象的生物學(xué)現(xiàn)象 存在于從真菌到高等植物、從無(wú)脊椎動(dòng)物到

3、哺存在于從真菌到高等植物、從無(wú)脊椎動(dòng)物到哺乳動(dòng)物的大多數(shù)真核生物中，原核生物暫未發(fā)現(xiàn)乳動(dòng)物的大多數(shù)真核生物中，原核生物暫未發(fā)現(xiàn)2. 2. RNAi的發(fā)現(xiàn)的發(fā)現(xiàn) 19901990年，科學(xué)家年，科學(xué)家Rich Jorgensen將產(chǎn)生紫色素的基因置將產(chǎn)生紫色素的基因置于一個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子后導(dǎo)入開(kāi)紫花的矮牽牛中，希望得到紫色于一個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子后導(dǎo)入開(kāi)紫花的矮牽牛中，希望得到紫色更深的花，但結(jié)果是：矮牽?；ㄍ耆噬ò曜兂闪税赘畹幕?，但結(jié)果是：矮牽?；ㄍ耆噬?，花瓣變成了白色。當(dāng)時(shí)認(rèn)為這是導(dǎo)入的基因和其相似的內(nèi)源基因同時(shí)都色。當(dāng)時(shí)認(rèn)為這是導(dǎo)入的基因和其相似的內(nèi)源基因同時(shí)都被抑制，并將之稱為被抑制，并將之稱為

4、協(xié)同抑制協(xié)同抑制 19951995年，康奈爾大學(xué)的年，康奈爾大學(xué)的Su Guo博士在用反義博士在用反義RNA阻斷阻斷線蟲(chóng)基因表達(dá)的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)：反義線蟲(chóng)基因表達(dá)的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)：反義RNARNA（anti sense RNA）和正義和正義RNARNA（ sense RNA）都阻斷了基因的表達(dá)）都阻斷了基因的表達(dá) 19981998年，年，Andrew Fire和和Craig Mello將反義將反義RNARNA和正義和正義RNA同時(shí)注射到秀麗隱桿線蟲(chóng)（同時(shí)注射到秀麗隱桿線蟲(chóng)（Caenorhabditis elegans）比單獨(dú)注射反義比單獨(dú)注射反義RNARNA誘導(dǎo)基因沉默的效率高誘導(dǎo)基因沉默的效率高10

5、10倍倍 3.3.RNAi機(jī)理機(jī)理3.1 3.1 dsRNA的形成的形成 基因組中基因組中DNA反向重復(fù)序列的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物反向重復(fù)序列的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 DNA同時(shí)轉(zhuǎn)錄了反義同時(shí)轉(zhuǎn)錄了反義RNARNA和正義和正義RNARNA的互相結(jié)合的互相結(jié)合 病毒病毒RNA 復(fù)制中間體復(fù)制中間體 以細(xì)胞中單鏈以細(xì)胞中單鏈RNA 為模板，由細(xì)胞或病毒的為模板，由細(xì)胞或病毒的RNA 在有關(guān)酶的催化下合成在有關(guān)酶的催化下合成dsRNA等等 3.2 3.2 siRNA( (干擾性小干擾性小RNA small interfering RNA，簡(jiǎn)稱，簡(jiǎn)稱siRNA) )的形成的形成 RNaseIII家族中特異識(shí)別雙鏈家族中特異識(shí)別

6、雙鏈RNARNA的一員的一員 含有解旋酶活性以及含有解旋酶活性以及dsRNA結(jié)合域和結(jié)合域和PAZ結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)3.213.21核酸內(nèi)切酶核酸內(nèi)切酶Dicer（1）dsRNA在細(xì)胞中大量擴(kuò)增在細(xì)胞中大量擴(kuò)增（2） dsRNA在細(xì)胞中達(dá)到一定量時(shí)，核酸內(nèi)切酶在細(xì)胞中達(dá)到一定量時(shí)，核酸內(nèi)切酶Dicer識(shí)別并與之結(jié)合形成酶識(shí)別并與之結(jié)合形成酶- -dsRNA復(fù)合體復(fù)合體（3）核酸內(nèi)切酶核酸內(nèi)切酶Dicer 對(duì)siRNA進(jìn)行切割，產(chǎn)生進(jìn)行切割，產(chǎn)生21-21-23nt23nt長(zhǎng)的長(zhǎng)的dsRNA小片段，即小片段，即siRNA3.223.22 siRNA形成過(guò)程形成過(guò)程3.23 3.23 siRNA的特征性結(jié)構(gòu)

7、：的特征性結(jié)構(gòu)： siRNA 的序列與所作用的靶的序列與所作用的靶mRNA 序列具有同序列具有同源性源性 siRNA 兩條單鏈末端為兩條單鏈末端為55端磷酸和端磷酸和33端羥基端羥基 正義鏈與反義鏈各有正義鏈與反義鏈各有2121個(gè)堿基，其中個(gè)堿基，其中1919個(gè)堿基配個(gè)堿基配對(duì)，在每條鏈的對(duì)，在每條鏈的33端都有端都有2 2個(gè)不配對(duì)的堿基（圖個(gè)不配對(duì)的堿基（圖1 1）。）。 圖圖1 1 siRNA示意圖示意圖 3.3 3.3 RISC的形成和發(fā)揮效應(yīng)的形成和發(fā)揮效應(yīng)siRNA和核糖核酸酶復(fù)合物結(jié)合，形成和核糖核酸酶復(fù)合物結(jié)合，形成RNARNA誘導(dǎo)誘導(dǎo)的基因沉默復(fù)合體的基因沉默復(fù)合體（RNA-i

8、nduced silencing complex,簡(jiǎn)稱簡(jiǎn)稱 RISC） 3.32 3.32 RISC 蛋白成分蛋白成分內(nèi)切核酸酶、外切核酸酶、解旋酶、同源內(nèi)切核酸酶、外切核酸酶、解旋酶、同源RNA 鏈搜索活性酶、鏈搜索活性酶、Argonaute等等 3.31 RISC的形成的形成 Argonaute有一個(gè)月牙型的底座由三部分組成，有一個(gè)月牙型的底座由三部分組成，分別為分別為N-N-端（端（amino-terminal）、中部（）、中部（middle）和和PIWI區(qū)域（區(qū)域（PIWI domain）。月牙底座上面有）。月牙底座上面有一個(gè)一個(gè)PAZ部分，由莖桿結(jié)構(gòu)支撐。部分，由莖桿結(jié)構(gòu)支撐。Arg

9、onature蛋白蛋白有一個(gè)凹槽貫穿整個(gè)蛋白，凹槽內(nèi)壁帶正電有利有一個(gè)凹槽貫穿整個(gè)蛋白，凹槽內(nèi)壁帶正電有利于與于與RNA帶負(fù)電的磷酸骨架結(jié)合帶負(fù)電的磷酸骨架結(jié)合 3.33 3.33 Argonaute蛋白蛋白 RISC的特有成分，被比喻成的特有成分，被比喻成“切薄片的機(jī)切薄片的機(jī)器器”。 圖圖2 2 siRNA引導(dǎo)引導(dǎo)mRNA被切割的模型被切割的模型 (1) (1) RISC中的中的siRNA依賴依賴ATP水解釋放的能量而水解釋放的能量而解旋，雙鏈轉(zhuǎn)變成單鏈而使復(fù)合體被激活，得到解旋，雙鏈轉(zhuǎn)變成單鏈而使復(fù)合體被激活，得到活性活性RISC。(2) (2) siRNA解旋后，解旋后，siRNA單鏈

10、的單鏈的33端伸入端伸入PAZ的裂縫中，整個(gè)單鏈沿著的裂縫中，整個(gè)單鏈沿著PAZ伸展開(kāi)，同時(shí)目的伸展開(kāi)，同時(shí)目的片段片段mRNA結(jié)合于新月型底座。結(jié)合于新月型底座。siRNA反義鏈與反義鏈與mRNA互補(bǔ)區(qū)域結(jié)合，形成雙鏈互補(bǔ)區(qū)域結(jié)合，形成雙鏈(3) (3) 在離單鏈在離單鏈siRNA5 5端端9 9個(gè)堿基處個(gè)堿基處, ,由由RNA酶切酶切割割mRNA，阻斷，阻斷RNA的翻譯，達(dá)到在的翻譯，達(dá)到在RNA水平上水平上干擾基因表達(dá)的效果干擾基因表達(dá)的效果 3.33 3.33 效應(yīng)階段效應(yīng)階段紫色紫色 正義正義RNARNA段段藍(lán)色藍(lán)色 反義反義RNARNA段段綠色綠色 目標(biāo)信使目標(biāo)信使RNARNA圖圖

11、4 RNAi4 RNAi原原理示意圖：理示意圖： siRNA 形成后另外作為一種特殊引物形成后另外作為一種特殊引物, ,在在RNA 依賴依賴RNA聚合酶（聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase， 簡(jiǎn)稱簡(jiǎn)稱 RdRp) ) 作用下以靶作用下以靶mRNA 為為模板合成模板合成dsRNA, ,后者在后者在Dicer酶的作用下又可被酶的作用下又可被降解形成新的降解形成新的siRNA，新生成的，新生成的siRNA再進(jìn)入上再進(jìn)入上述循環(huán)述循環(huán)3.34 3.34 siRNA 特殊的保障機(jī)制特殊的保障機(jī)制隨機(jī)降解隨機(jī)降解性多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)性多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)3.5 3.5 siRNA目標(biāo)位

12、點(diǎn)的篩選目標(biāo)位點(diǎn)的篩選 (1) (1) 在預(yù)定沉默的在預(yù)定沉默的mRNA中找一段中找一段21nt21nt的序列，的序列，起始是起始是AAAA(2) (2) 找找2 24 4個(gè)小片段的個(gè)小片段的RNA，通過(guò)，通過(guò)SECs（siRNA expression cassettes，簡(jiǎn)稱簡(jiǎn)稱SECs）篩選最有效的）篩選最有效的siRNA(3) (3) 在在19nt19nt的的RNA片斷中不能含有連續(xù)片斷中不能含有連續(xù)4 4個(gè)個(gè)T T或或A A的區(qū)域的區(qū)域(4) (4) 通過(guò)通過(guò)BLAST 確定片斷的特異性；確定片斷的特異性；(5) (5) 片斷片斷GC%GC%應(yīng)該在應(yīng)該在30%30%50%50%1. 1

13、. 開(kāi)展基因治療的新途徑開(kāi)展基因治療的新途徑 一基因家族的多個(gè)基因具有一段同源性很高一基因家族的多個(gè)基因具有一段同源性很高的保守序列這一特性，的保守序列這一特性， 設(shè)計(jì)針對(duì)這一區(qū)段序列設(shè)計(jì)針對(duì)這一區(qū)段序列的的dsRNA分子，只注射一種分子，只注射一種dsRNA即可以產(chǎn)生多即可以產(chǎn)生多個(gè)基因表達(dá)同時(shí)降低的表現(xiàn)，也可同時(shí)注射多種個(gè)基因表達(dá)同時(shí)降低的表現(xiàn)，也可同時(shí)注射多種dsRNA而將多個(gè)序列不相關(guān)的基因同時(shí)剔除。而將多個(gè)序列不相關(guān)的基因同時(shí)剔除。三三 RNAi的應(yīng)用的應(yīng)用 抗腫瘤治療抗腫瘤治療 RNAi可用于抑制癌基因的表達(dá)可用于抑制癌基因的表達(dá) 傳染性疾病傳染性疾病 根據(jù)病原體如病毒、細(xì)菌等的致

14、根據(jù)病原體如病毒、細(xì)菌等的致病基因序列，以及生物體內(nèi)與疾病發(fā)生相關(guān)的基病基因序列，以及生物體內(nèi)與疾病發(fā)生相關(guān)的基因序列，設(shè)計(jì)和制備與這些基因序列有同源序列因序列，設(shè)計(jì)和制備與這些基因序列有同源序列的的dsRNA，轉(zhuǎn)入動(dòng)植物內(nèi)使有關(guān)的疾病基因，轉(zhuǎn)入動(dòng)植物內(nèi)使有關(guān)的疾病基因“沉沉默默”，從而達(dá)到治療的效果。，從而達(dá)到治療的效果。 AIDS治療治療 利用利用siRNA抑制病毒再生或傳抑制病毒再生或傳染所需的蛋白質(zhì)的生成。優(yōu)勢(shì)在于能夠不損傷染所需的蛋白質(zhì)的生成。優(yōu)勢(shì)在于能夠不損傷細(xì)胞而只抑制病毒蛋白質(zhì)。細(xì)胞而只抑制病毒蛋白質(zhì)。 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，通過(guò)RNAi的方法使導(dǎo)致血的方法使導(dǎo)致血膽固醇升高的基因膽固醇升高的基因“沉默沉默”。 美國(guó)哈佛醫(yī)學(xué)院的科學(xué)家成功地利用美國(guó)哈佛醫(yī)學(xué)院的科學(xué)家成功地利用RNA干擾技術(shù)治愈了實(shí)驗(yàn)鼠的肝炎。干擾技術(shù)治愈了實(shí)驗(yàn)鼠的肝炎。 2. 2. 功能基因組的研究功能基因組的研究 由于由于RNAi具有高度的序列專一性，可以準(zhǔn)確具有高度的序列專一性，可以準(zhǔn)確地使特定基因沉默，獲得功能喪失或降低突變，地使特定基因沉默，獲得功能喪失或降低突變，這樣當(dāng)某一特定基因被這樣當(dāng)某一特定基