本科實(shí)驗(yàn)講義

1、醫(yī)學(xué)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)講義（供臨床醫(yī)學(xué)、口腔、護(hù)理、藥學(xué)、預(yù)防醫(yī)學(xué)等使用）青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室二00六年六月目錄實(shí)驗(yàn)一 直接凝集反應(yīng)血型（1）實(shí)驗(yàn)二 類(lèi)風(fēng)濕因子膠乳凝集試驗(yàn)（3）實(shí)驗(yàn)三 抗鏈球菌溶血素“O”膠乳試驗(yàn)（4）實(shí)驗(yàn)四 試管凝集反應(yīng)（5）實(shí)驗(yàn)五 單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)（8）實(shí)驗(yàn)六 雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)（10）實(shí)驗(yàn)七 對(duì)流免疫電泳（13）實(shí)驗(yàn)八 火箭電泳（16）實(shí)驗(yàn)九 免疫電泳（19）實(shí)驗(yàn)十 補(bǔ)體在溶血反應(yīng)中的作用（21）實(shí)驗(yàn)十一 密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞（23）實(shí)驗(yàn)十二 E玫瑰花環(huán)形成實(shí)驗(yàn)（24）實(shí)驗(yàn)十三 人外周血淋巴細(xì)胞亞群的檢測(cè)（27）實(shí)驗(yàn)十四 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)（29）實(shí)驗(yàn)十五 動(dòng)物過(guò)敏性

2、休克（32）實(shí)驗(yàn)十六 肥大細(xì)胞脫顆粒試驗(yàn)（33）實(shí)驗(yàn)十七 中性粒細(xì)胞的吞噬作用（36）實(shí)驗(yàn)十八 巨噬細(xì)胞的吞噬作用（37）實(shí)驗(yàn)十九 間接免疫熒光法檢測(cè)抗核抗體（39）實(shí)驗(yàn)二十 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（42）實(shí)驗(yàn)二十一 免疫層析實(shí)驗(yàn)（45）實(shí)驗(yàn)二十二 血清三碘甲狀腺原氨酸（T3）放射免疫測(cè)定（47）實(shí)驗(yàn)二十三 免疫印跡實(shí)驗(yàn)（50）實(shí)驗(yàn)室規(guī)則一、每次實(shí)驗(yàn)前必須將有關(guān)的課堂講授理論及實(shí)驗(yàn)講義進(jìn)行預(yù)習(xí)，以了解本次實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及目的、方法，以免發(fā)生錯(cuò)誤，并可提高實(shí)驗(yàn)效果。二、進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室必須穿隔離衣。不準(zhǔn)穿拖鞋。三、在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)絕對(duì)禁止吸煙及飲食。四、一切標(biāo)本及材料應(yīng)嚴(yán)格按照指定的方式進(jìn)行使用及觀察，不得隨意亂動(dòng)，更

3、不得攜出室外。五、凡用過(guò)的吸管、玻片應(yīng)放在指定的消毒缸內(nèi)，其他物品也應(yīng)放在指定地點(diǎn)，不得亂放。六、應(yīng)愛(ài)護(hù)顯微鏡，用完后應(yīng)清潔鏡頭，顯微鏡對(duì)號(hào)入座。七、實(shí)驗(yàn)完畢后，整理桌面、地面、用具等，需培養(yǎng)的物品要放入孵育箱，關(guān)好水、電、門(mén)窗。八、愛(ài)護(hù)公物，損壞公物，應(yīng)向教師報(bào)告，進(jìn)行登記，酌情處理。九、應(yīng)用易燃品要嚴(yán)防火災(zāi)，嚴(yán)禁酒精燈互相直接碰頭點(diǎn)燃，以免酒精外溢，引起燃燒。十、必須認(rèn)真觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，按時(shí)交實(shí)驗(yàn)報(bào)告。實(shí)驗(yàn)一 凝集反應(yīng)（Agglutination）血型顆粒性抗原與相應(yīng)的抗體在一定條件下出現(xiàn)凝集物的現(xiàn)象稱(chēng)為凝集反應(yīng)，或稱(chēng)直接凝集反應(yīng)（direct agglutination）。若將可溶性抗原吸

4、附或偶聯(lián)至無(wú)關(guān)載體顆粒，使之成為致敏的載體顆粒，再與相應(yīng)抗體結(jié)合而出現(xiàn)的凝集現(xiàn)象稱(chēng)為間接凝集反應(yīng)（indirect agglutination），如果載體顆粒是紅細(xì)胞，則稱(chēng)間接血凝。如將抗體吸附在載體顆粒上，然后與相應(yīng)的可溶性抗原結(jié)合而出現(xiàn)的凝集現(xiàn)象稱(chēng)為反向間接凝集反應(yīng)。一、原理紅細(xì)胞表面具有不同的抗原，而在人類(lèi)血清中天然存在有對(duì)紅細(xì)胞的不同凝集素（抗體）。當(dāng)紅細(xì)胞與相應(yīng)凝集素混合時(shí)，在有電解質(zhì)參加下，可以產(chǎn)生凝集現(xiàn)象。根據(jù)人類(lèi)紅細(xì)胞膜上抗原的不同，可分為、和四種血型。型血的紅細(xì)胞膜上有抗原，血清中則含有抗抗體；型血紅細(xì)胞膜上有抗原，血清中含有抗抗體；型血紅細(xì)胞膜上不含和抗原，血清中含有抗和抗

5、抗體；型血紅細(xì)胞膜上同時(shí)有和兩種血型抗原，血清中無(wú)抗和抗抗體。當(dāng)不同血型的人進(jìn)行輸血時(shí)，紅細(xì)胞表面抗原與相應(yīng)的凝集素結(jié)合，在補(bǔ)體的作用下可發(fā)生溶血現(xiàn)象，故臨床上給病人輸血時(shí)，必須進(jìn)行血型鑒定。同時(shí)尚需進(jìn)行交互配血試驗(yàn)，以復(fù)查定型時(shí)有無(wú)錯(cuò)誤，或其它不規(guī)則凝集素的存在。二、材料(一)標(biāo)準(zhǔn)抗A及抗B血清。(二)生理鹽水，小試管，毛細(xì)吸管，載玻片，牙簽或小玻棒，刺血針，酒精棉球等。三、方法(一)用酒精棉球消毒被檢者的耳垂或指尖，用刺血針扎破皮膚，然后用毛細(xì)吸管采血，并將其注入含生理鹽水的小試管內(nèi)，混勻使之成為血球懸液(濃度為1)。(二)取潔凈玻片一張，用蠟筆在中間劃分為二，并于其上角分別標(biāo)記“抗A”“

6、抗B”，分別將標(biāo)準(zhǔn)抗A和抗B血清加一滴于其上。(三)用毛細(xì)吸管取待檢紅細(xì)胞懸液各加一滴于抗A及抗B血清中，然后用牙簽或小玻棒將其攪拌均勻。(四)將玻片平持手中，前后左右轉(zhuǎn)動(dòng)，使之充分混勻，置室溫中10 15分鐘。觀察有無(wú)凝集發(fā)生，如觀察不清，可放在低倍顯微鏡下觀查。四、結(jié)果如有凝集，可見(jiàn)紅細(xì)胞凝集成小塊，背景液體較澄清；無(wú)凝集者，紅細(xì)胞呈均勻分散，背景液體混濁。檢查結(jié)果可參閱下表：不同血型檢查結(jié)果抗血清 抗血清 血型 A B O AB五、注意事項(xiàng)(一)室溫保持在20左右。若低于10以下，易出現(xiàn)冷凝集現(xiàn)象而造成假陽(yáng)性的誤判結(jié)果。(二)用牙簽或小玻棒將待檢紅細(xì)胞懸液分別于抗A及抗B血清混勻時(shí)，不能

7、用同一端同時(shí)在兩種血清中攪拌，而應(yīng)分別用兩端攪拌。六、報(bào)告要求結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分析血型鑒定在實(shí)際應(yīng)用中有何意義？血型不合輸血引起的溶血是如何發(fā)生的？實(shí)驗(yàn)二 類(lèi)風(fēng)濕因子膠乳凝集試驗(yàn)（RF latex agglutination）一、原理利用人IgG致敏的顆粒性膠乳抗原與相應(yīng)抗體的免疫凝集反應(yīng)，測(cè)定患者血清中的類(lèi)風(fēng)濕因子（RF）二、材料1 變性IgG致敏膠乳懸液2 陰、陽(yáng)性對(duì)照血清。3 血清稀釋液：生理鹽水。4 黑色方格玻璃板、吸管、試管、吸量管等。三、操作1 將待檢標(biāo)本用生理鹽水1:20稀釋備用。2 在黑色方格玻璃板上取三個(gè)格，每格分別加稀釋待檢血清、陽(yáng)性對(duì)照血清和陰性對(duì)照血清1滴，然后每格均加一

8、滴膠乳試劑。3 充分混勻，2分鐘內(nèi)觀察結(jié)果。四、結(jié)果判斷 肉眼觀察凝集強(qiáng)弱，出現(xiàn)清晰凝集者為陽(yáng)性，無(wú)明顯凝集者為陰性。若需作定量測(cè)定，可將血清作倍比稀釋?zhuān)貜?fù)上述測(cè)定，以血清最高稀釋度所出現(xiàn)的凝集，即為RF滴度。五、注意事項(xiàng)1 使用前將試劑充分搖勻。2 血清和試劑的液滴大小要一致。3 血清和試劑要充分混合。4 反應(yīng)以室溫為宜。六、報(bào)告要求RF實(shí)驗(yàn)的原理及實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄。實(shí)驗(yàn)三 抗鏈球菌溶血素“O”膠乳試驗(yàn)一、原理正常機(jī)體的血清中含有一定量的抗鏈球菌溶血素“O”抗體（ASO），實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)首先加入一定量的溶血素“O”溶液，可全部結(jié)合正常血清中的ASO，患者血清中ASO超過(guò)正常范圍，所以可以與隨后加入

9、的溶血素“O”致敏的膠乳顆粒（ASO膠乳試劑）反應(yīng)，出現(xiàn)凝集。二、材料 溶血素“O”溶液。 ASO膠乳試劑（溶血素“O”致敏的膠乳顆粒）。 陽(yáng)性控制血清。 陰性控制血清。 生理鹽水。6黑色方格玻璃板、試管、吸管、毛細(xì)滴管、小木簽等。三、方法1 血清標(biāo)本用生理鹽水1:50稀釋?zhuān)槐販缁睢? 在反應(yīng)板各格子上分別滴加稀釋血清以及陽(yáng)性和陰性對(duì)照血清一滴，各再滴加溶血素“O”溶液一滴，輕輕搖動(dòng)2分鐘，使其充分混勻，均勻分布于方格內(nèi)。3 滴加ASO膠乳試劑一滴，輕輕搖動(dòng)8分鐘，室溫為20，將反應(yīng)板平放在實(shí)驗(yàn)桌上，有清晰凝集者為陽(yáng)性，不出現(xiàn)清晰凝集者為陰性。4 陽(yáng)性者的1:50稀釋血清，進(jìn)一步稀釋為1:8

10、0，再重復(fù)步驟2和3，有清晰凝集者為強(qiáng)陽(yáng)性。四、結(jié)果判斷在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)觀察，有清晰凝集者為陽(yáng)性，不出現(xiàn)清晰凝集者為陰性。五、注意事項(xiàng)1 加入ASO膠乳并輕輕搖動(dòng)8分鐘后，應(yīng)盡快記錄結(jié)果，此后時(shí)間再出現(xiàn)的清晰凝集不列為陽(yáng)性。2 室溫若分別降低或升高10°C，反應(yīng)時(shí)間則分別延長(zhǎng)和縮短2分鐘。六、報(bào)告要求ASO膠乳實(shí)驗(yàn)的原理及實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄。實(shí)驗(yàn)四 試管凝集反應(yīng)（Tube Agglutination）一、原理試管凝集反應(yīng)為半定量試驗(yàn)方法，用已知抗原作為診斷菌液與一系列稀釋的受檢血清混合保溫后，觀察每管內(nèi)抗原凝集程度，以判定待檢血清中有無(wú)相應(yīng)的抗體及其效價(jià)。通常以產(chǎn)生明顯凝集現(xiàn)象的最高血清稀釋

11、度為血清中抗體的效價(jià)，亦稱(chēng)滴度(titer)。二、材料(一)待檢血清 用生理鹽水110稀釋?zhuān)?.1毫升血清原液 + 0.9毫升生理鹽水）(二)傷寒桿菌“H”診斷菌液(三)傷寒桿菌“O”診斷菌液(四) 生理鹽水、試管、吸管等三、方法(一)稀釋血清1潔凈小試管16只，分兩排排列于試管架上，每排8只，依次用蠟筆注明號(hào)碼，每管用吸管加入生理鹽水0.5毫升。2吸取110待檢血清0.5毫升，加入第1排中的第1管，于管內(nèi)連續(xù)吹打三次，使血清與鹽水充分混合(吹打時(shí)注意勿使液體溢出管外)，吸出0.5毫升注入第2管。同樣予以混合后吸出0.5毫升注入第3管，以此類(lèi)推作倍比稀釋到第7管，自第7管中吸取0.5毫升棄去，

12、第8管做對(duì)照。3同法，吸取110待檢血清0.5毫升加入第二排中的第1管，并依次如上法予以稀釋。 血清菌液含量表血清 1 2 3 4 5 6 7 8菌液（ml） 110 120 140 180 1160 1320 1640 鹽水傷寒桿菌“O”傷寒桿菌“H”最后稀釋度 120 140 180 1160 1320 1640 11280對(duì)照(二)加菌液1吸取傷寒桿菌“H”菌液，加入第一排各管中，每管0.5毫升(由鹽水對(duì)照開(kāi)始，依次由后向前加入)。此時(shí)血清稀釋倍數(shù)又增加1倍。2同法于第二排中加入傷寒桿菌“O”菌液0.5毫升。3將各管振蕩混勻，放37水浴箱中24小時(shí)或放入37孵育箱中過(guò)夜，次日取出觀察結(jié)果

13、。以出現(xiàn)“+”凝集的最高血清稀釋度(血清的最后稀釋度)為該抗體效價(jià)。四、結(jié)果如血清中含有與該菌相應(yīng)的抗體，則可與該菌起凝集反應(yīng)，凡能凝集者則細(xì)菌之凝集塊下沉于管底，上面液體完全澄清或略為澄清，依照凝塊之大小與液體澄清的程度而決定反應(yīng)的強(qiáng)弱，并以“+”表示之?！?” 細(xì)菌完全凝集，凝集塊大，管底可見(jiàn)大而邊緣不整的白色凝集塊，液體澄清“+” 細(xì)菌大部分凝集，凝集塊較大，液體稍微混濁“+” 細(xì)菌部分凝集，液體混濁“+” 細(xì)菌極少數(shù)凝集，液體混濁“-” 不凝集，液體渾濁度與對(duì)照管相同五、注意事項(xiàng)(一)先觀察鹽水對(duì)照管，管底沉淀物呈園形，邊緣整齊，輕輕振搖，細(xì)菌分散仍呈混濁現(xiàn)象。(二)實(shí)驗(yàn)管應(yīng)自第1管看

14、起，如有凝集，可見(jiàn)管底有沉淀凝集塊，邊緣不整齊，液體上部澄清?！癏”菌液的凝集呈棉絮狀，輕搖即升起，容易搖碎?！癘”菌液的凝集呈緊密顆粒狀，不易搖碎，往往粘于管底，因每管抗原抗體比例不同，凝集程度有差別。六、報(bào)告要求記錄并分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。了解待測(cè)血清對(duì)傷寒桿菌“H”或傷寒桿菌“O”的凝集效價(jià)的臨床意義。實(shí)驗(yàn)五 單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)(Single Agar Diffusion Test)一、原理本試驗(yàn)為一定量試驗(yàn)，將一定量抗體均勻混入瓊脂中傾注于玻片上，待凝固后打孔，將抗原加入孔內(nèi)，抗原由圓孔中央向四周擴(kuò)散，若遇相應(yīng)抗體便發(fā)生特異性結(jié)合，在二者比例合適處圍繞孔的周?chē)纬扇榘咨某恋憝h(huán)，環(huán)的大小與抗原含

15、量成正比，因此事先用不同濃度的已知抗原做實(shí)驗(yàn)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線便可求出未知抗原的含量(本實(shí)驗(yàn)以IgG定量測(cè)定為例)。二、材料（一）器材：1. 載玻片。2. 打孔器（外徑3mm）。3. 不銹鋼挑針。4. 微量注射器（10ul）。5. 有蓋搪瓷盒（內(nèi)鋪有濕潤(rùn)的海綿墊）。6. 測(cè)定尺。7. 溫箱、三角燒瓶等其它常用儀器。（二）試劑：1. pH 8.6，0.1M巴比妥緩沖液。2. 1瓊脂凝膠： 稱(chēng)取10g優(yōu)質(zhì)瓊脂粉置1000ml三角燒瓶中加人蒸餾水500ml，水浴煮沸使瓊脂熔解，然后再加入500ml上述熱pH 8.6巴比妥緩沖液，同時(shí)加萬(wàn)分之一硫柳汞，混勻后分裝于150ml三角燒瓶中，4冰箱保

16、存?zhèn)溆谩?. 1鞣酸。4. 參考血清：IgG。參考血清均事先用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)抗原進(jìn)行過(guò)標(biāo)化，標(biāo)明其中各種免疫球蛋白的含量。5.診斷血清（抗體）：羊抗人IgG血清。6. 待檢血清（抗原）：人血清。三、方法(一)稱(chēng)取優(yōu)質(zhì)瓊脂3克，加生理鹽水200毫升，在水浴中加熱融化。(二)吸4ml瓊脂待其冷卻至5060，加入Ab(按工作濃度)，混勻后立即倒入玻璃板上，厚度為1.2毫米，待凝固。(三)用打孔器(或用直徑與其一致的鋼管或玻璃管)打孔，孔距1.2 1.5厘米，兩排距離2厘米。如下圖：(四)加入不同稀釋度(1:10、1:20、1:40、1:80)的抗原約10微升，抗原液面與瓊脂板相平為宜。(五)置濕盒內(nèi)，37

17、。24小時(shí)后取出泡入生理鹽水內(nèi)23小時(shí)換水?dāng)?shù)次，再泡在1鞣酸內(nèi)10分鐘。四、結(jié)果以毫米為單位測(cè)量沉淀環(huán)和直徑，以已知的抗原濃度為橫坐標(biāo)，沉淀環(huán)的直徑為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后從標(biāo)準(zhǔn)曲線上即可查到待測(cè)樣品中IgG的含量。注：1.IgG含量可用國(guó)際單位(I.U/ml)表示，也可用mg/ml表示。 2.血清中IgG正常值范圍：IgG：12.0±2.62mg/mlIgA：2.00±0.50mg/mlIgM：1.10±0.30mg/ml五、注意事項(xiàng)(一)打孔時(shí)，應(yīng)注意使孔之邊緣整齊。(二)加樣時(shí)，樣品液面應(yīng)與免疫板平齊，過(guò)多或過(guò)少將影響其準(zhǔn)確性。六、報(bào)告要求繪圖記錄和解釋

18、實(shí)驗(yàn)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)六 雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)(Double Agar Diffusion Test)一、原理在瓊脂內(nèi)抗原和抗體向四處擴(kuò)散，在最恰當(dāng)?shù)谋壤幮纬煽乖贵w沉淀線，觀察這種沉淀線的位置、形狀以及對(duì)比關(guān)系，可作出對(duì)抗原或抗體的定性分析。二、材料器材：1. 潔凈玻片（2.6×7.6cm）。2. 打孔器（外徑3mm），不銹鋼挑針。3. 溫箱，有蓋搪瓷盒，微量加樣器。試劑：1. pH 8.6，0.1M巴比妥緩沖液。2. 1.2瓊脂凝膠：稱(chēng)取12g優(yōu)質(zhì)瓊脂粉,置1000ml三角燒瓶中，加蒸餾水500ml，水浴煮沸使瓊脂溶解，然后加入500ml上述緩沖液，內(nèi)加萬(wàn)分之一硫柳汞后混勻，分裝150ml

19、三角燒瓶?jī)?nèi)，4保存?zhèn)溆谩?. 診斷血清（甲胎蛋白抗體），待測(cè)血清，陰性對(duì)照血清。三、方法1取一清潔載玻片，傾注3.54.0毫升加熱熔化的1.2%瓊脂制成瓊脂板。2凝固后，用直徑3毫米打孔器打孔，孔間距為5毫米。孔的排列方式如下圖所示。圖 雙向瓊脂擴(kuò)散原抗體孔位置示意圖3用微量加樣器于中央孔加抗體，于周?chē)准痈鞣N抗原。加樣時(shí)勿使樣品外溢或在邊緣殘存小氣泡，以免影響擴(kuò)散結(jié)果。4加樣后的瓊脂板收入濕盒內(nèi)置37溫箱中擴(kuò)散2448小時(shí)。四、結(jié)果觀察：若凝膠中抗原抗體是特異性的，則形成抗原抗體復(fù)合物，在兩孔之間出現(xiàn)一清晰致密白色的沉淀線，為陽(yáng)性反應(yīng)。若在72小時(shí)仍未出現(xiàn)沉淀線則為陰性反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)時(shí)至少要做一

20、陽(yáng)性對(duì)照。出現(xiàn)陽(yáng)性對(duì)照與被檢樣品的沉淀線發(fā)生融合，才能確定待檢樣品為真正陽(yáng)性。五、結(jié)果分析：瓊脂擴(kuò)散結(jié)果受許多因素影響?？乖禺愋耘c沉淀線形狀的關(guān)系：在相鄰兩完全相同的抗原與抗體反應(yīng)時(shí)，則可出現(xiàn)兩單沉淀線的融合。反之，如相鄰抗原完全不同時(shí)，則出現(xiàn)沉淀線之交叉；兩種抗原部分相同時(shí)，則出現(xiàn)沉淀線的部分融合。見(jiàn)下圖。圖 雙擴(kuò)散試驗(yàn)結(jié)果示意圖A：已知抗體 a、b：陽(yáng)性對(duì)照c、d、e、f：被檢材料抗原濃度與沉淀線形狀的關(guān)系：兩相鄰抗原濃度相同，形成對(duì)稱(chēng)相融合的沉淀線；如果兩抗原濃度不同，則沉淀線不對(duì)稱(chēng)，移向低濃度的一邊。見(jiàn)圖。圖 抗原特異性與沉淀線形狀的關(guān)系b、 b：抗體 A、A、B：抗原A、B完全不同

21、 A、A部分相同溫度對(duì)沉淀線的影響：在一定范圍內(nèi)，溫度高擴(kuò)散快。通常反應(yīng)在0-37下進(jìn)行。在雙向擴(kuò)散時(shí)，為了減少沉淀線變形并保持其清晰度，可在37下形成沉淀線，然后置于室溫或冰箱（4）中為佳。瓊脂濃度對(duì)沉淀線形成速度的影響：一般來(lái)說(shuō)，瓊脂濃度越大，沉淀線出現(xiàn)越慢。參加擴(kuò)散的抗原與抗體間的距離對(duì)沉淀線形成的影響：抗原、抗體相距越遠(yuǎn)，沉淀線形成的越慢，所以在微量玻片法時(shí)，孔間距離以0.25-0.5cm為好，距離遠(yuǎn)影響反應(yīng)速度。當(dāng)然孔距過(guò)遠(yuǎn)，沉淀線的密度過(guò)大，容易發(fā)生融合，有礙對(duì)沉淀線數(shù)目的確定。時(shí)間對(duì)沉淀線的影響：沉淀線形成一般在1-3天出現(xiàn)，14-21天出現(xiàn)的數(shù)目最多。玻片法可在1-2小時(shí)出現(xiàn)，

22、一般觀察72小時(shí)，放置過(guò)久可出現(xiàn)沉淀線重合消失。六、報(bào)告要求：繪圖記錄和解釋實(shí)驗(yàn)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)七 對(duì)流免疫電泳(Counter Immunoelectrophoresis, CIEP )一、原理對(duì)流免疫電泳是在瓊脂擴(kuò)散基礎(chǔ)上結(jié)合電泳技術(shù)而建立的一種簡(jiǎn)便而快速的方法。此方法能在短時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)結(jié)果，故可用于快速診斷，敏感性比雙向擴(kuò)散技術(shù)高1015倍。在pH88.6的緩沖液中，蛋白質(zhì)抗原帶負(fù)電，故由陰極移向陽(yáng)極。抗體雖然也是蛋白質(zhì)，但等電點(diǎn)比抗原高，所帶陰離子少，且分子量較大，移動(dòng)緩慢，同時(shí)因電滲作用(電滲是電場(chǎng)中溶液對(duì)于固體的相對(duì)移動(dòng)。瓊脂是酸性物質(zhì)，在堿性溶液中，它帶負(fù)電，而與它接觸的溶液帶正電，因此

23、液體向陰極移動(dòng)，產(chǎn)生電滲)反而向陰極泳動(dòng)。因此，在電場(chǎng)作用下，抗原向陽(yáng)極方向移動(dòng)，抗體向陰極方向泳動(dòng)，形成對(duì)流，在抗原抗體比例合適處，形成白色沉淀線。此法常用于AFP等的檢測(cè)。二、材料（一）器材：1. 潔凈玻板（2.6×7.6cm）。2. 打孔器（外徑3mm）。3. 不銹鋼挑針。4. 電泳槽及電泳儀。5. 萬(wàn)用電表。6. 溫箱、有蓋搪瓷盒及其它常用儀器。（二）試劑：1. pH 8.6，0.05M巴比妥緩沖液。2. 1.2瓊脂：用上述緩沖液加熱溶解配制，內(nèi)加萬(wàn)分之一硫柳汞，4保存。3. 甲胎蛋白陽(yáng)性對(duì)照血清（或臍帶血）。4. 甲胎蛋白抗血清。5. 甲胎蛋白陰性對(duì)照血清。三、方法：1.

24、取熱溶的1.2瓊脂4.5ml，澆于2.6×7.6cm玻璃板上，待瓊脂凝固后，放入有蓋搪瓷盒的海綿墊上，置4保存?zhèn)溆谩?. 用時(shí)取瓊脂板打孔，孔徑0.3cm，孔距0.40.5cm，孔底補(bǔ)以少量瓊脂，如下圖： 3. 用滴管按順序第1、3列加抗原（待測(cè)樣品，陽(yáng)性及陰性甲胎蛋白對(duì)照）。2、4列加甲胎蛋白抗血清，至完全充滿(mǎn)孔為止，防止溢出孔外，每個(gè)樣品需更換一支滴管。4. 將上述加好樣的瓊脂板置電泳儀上，抗體端接上正極，抗原端接上負(fù)極，（每泳完一次調(diào)換陰陽(yáng)極保持液體電解離子平衡）。用濾紙或紗布做引橋，板端電壓34V/厘米。通電12小時(shí)(或45分鐘)，然后取下觀察結(jié)果，如若沉淀線不清楚，可置一定

25、濕度的盒內(nèi)，置37孵育箱4小時(shí)(或取掉濾紙引橋，在電泳槽內(nèi)放置4小時(shí))再觀察。四、結(jié)果觀察在黑色背景上方，用散射光多個(gè)角度觀察，在對(duì)孔之間有白色沉淀線即為陽(yáng)性對(duì)照應(yīng)出現(xiàn)明顯的白色沉淀線。如果沉淀?xiàng)l紋不清晰，于37保溫?cái)?shù)小時(shí)可增強(qiáng)沉淀?xiàng)l紋的清晰度。五、影響結(jié)果的因素（1） 抗原抗體的比例：抗原抗體比例適應(yīng)時(shí)容易出現(xiàn)沉淀帶，反之不易發(fā)生。當(dāng)抗體濃度恒定時(shí)，被檢血清含甲胎蛋白濃度高時(shí)，作10倍、20倍或更高倍數(shù)稀釋可以提高陽(yáng)性率。隨稀釋度的增加，抗原抗體的比例發(fā)生變化，沉淀線由靠近抗血清孔逐步移向兩孔中間，并可出現(xiàn)不典型的沉淀線如弧形、八字須形、斜線形，這些也是陽(yáng)性，應(yīng)予注意。（2） 幾組電泳緩沖液

26、，其電泳結(jié)果以巴比妥鈉鹽酸緩沖液靈敏度最高。巴比妥巴比妥鈉次之。Tris緩沖液更差。（3）電壓與電流小時(shí)電泳時(shí)間需要長(zhǎng)些，電壓電流增大時(shí)，電泳時(shí)間可更短。但電壓過(guò)高則孔徑變形，電流過(guò)大抗原抗體蛋白易變性，干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。六、注意事項(xiàng)(一)抗原孔與抗體孔之間的距離不易太寬。(二)電泳儀中的液體量應(yīng)充足，防止紗布做引橋時(shí)不導(dǎo)電。(三)電壓應(yīng)適當(dāng)。七、報(bào)告要求：記錄并分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)八 火箭免疫電泳(Rocket Immunoelectrophoresis, RIE )一、原理火箭電泳實(shí)際是一種定量免疫電泳。其原理為：在電場(chǎng)作用下，抗原在含定量抗體的瓊脂介質(zhì)中泳動(dòng)，二者比例在合適時(shí)在較短時(shí)間內(nèi)形成狀

27、似火箭或錐形的沉淀線，而此沉淀線的高度常與抗原量成正比關(guān)系，因此本法可以測(cè)定樣品中抗原的含量。二、材料（一）器材：1. 潔凈玻璃板（7×11.5cm）。2. 打孔器（外徑5mm），不銹鋼挑針。3. 電泳儀及電泳槽，紗布。4. 微量加樣器。（二）試劑： 1. 1瓊脂糖：稱(chēng)取1g優(yōu)質(zhì)瓊脂糖粉置，100ml三角燒瓶中，加pH 8.6，0.025M巴比妥緩沖液50ml，水浴煮沸使瓊脂糖粉溶解，然后加入50ml上述緩沖液，內(nèi)加萬(wàn)分之一硫柳汞后混勻即可。 2. pH 8.6，0.05M巴比妥緩沖液： 將單向瓊脂擴(kuò)散用的pH 8.6，0.1M巴比妥緩沖液，以蒸餾水作1:2稀釋即可用于電泳槽，也可用

28、于制備1瓊脂糖。 3. 抗血清：羊抗人IgG診斷血清（效價(jià)1:80）。 4. 標(biāo)準(zhǔn)抗原（參考血清）：同單向瓊脂擴(kuò)散。 5. 1鞣酸生理鹽水。6. 凝膠指示劑：配制見(jiàn)“免疫電泳試驗(yàn)”。三、方法1. 做瓊脂板：取加熱溶解的1瓊脂糖24ml,冷至56,加入一定量的羊抗人IgG診斷血清,使診斷血清的最終稀釋度符合瓶簽所標(biāo)的“工作濃度”充分混勻,迅速澆板(板四周打蠟,平放)。 2. 打孔：瓊脂凝固后，如下圖用打孔器打孔，孔間距0.5cm，用針挑去孔內(nèi)瓊脂柱。 3. 加樣：以微量加樣器向第1、2孔內(nèi)準(zhǔn)確加入待檢血清30ul，其余孔依次加入不同稀釋度的參考血清各30ul，最后一孔加指示劑30ul。 4. 電

29、泳：反應(yīng)板的打孔端放于陰極一側(cè)，另一端放于陽(yáng)極一側(cè)，兩端用三層紗布搭橋，在pH 8.6，0.05M巴比妥緩沖液的電泳槽內(nèi)進(jìn)行電泳，端電壓34Vcm，電流12mAcm，電泳45小時(shí)。5. 電泳結(jié)束后，將反應(yīng)板浸泡于1鞣酸生理鹽水中， 15分鐘后觀察結(jié)果。四、結(jié)果判斷陽(yáng)性結(jié)果可見(jiàn)清晰的火箭形沉淀峰，自小孔中心至火箭峰頂?shù)木嚯x，作為沉淀峰的高度，以已知標(biāo)準(zhǔn)抗原含量的對(duì)數(shù)作橫座標(biāo)，沉淀峰高度作縱座標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。用此標(biāo)準(zhǔn)曲線可計(jì)算出待檢標(biāo)本中的IgG。五、影響結(jié)果的因素1. 所用瓊脂要選擇無(wú)電滲或電滲很小的，否則火箭形狀不規(guī)則。2. 注意電泳終點(diǎn)時(shí)間，如火箭電泳頂部呈不清晰的云霧狀或圓形皆提示未達(dá)終

30、點(diǎn)。3. 標(biāo)本數(shù)量多時(shí)，電泳板應(yīng)先置電泳槽上，搭橋并開(kāi)啟電源（電流要小）后再加樣。否則易形成寬底峰形，使定量不準(zhǔn)。4. 作IgG定量時(shí)，由于抗原和抗體的性質(zhì)相同，火箭峰因電滲呈紡錘狀。5. 火箭電泳作為抗原定量智能測(cè)定 g/ml 以上的含量，如低于此水平則難以形成可見(jiàn)的沉淀峰。六、報(bào)告要求記錄并分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)九 免疫電泳實(shí)驗(yàn)(Immunoelectrophoresis, IEP )一、原理免疫電泳實(shí)驗(yàn)是先將抗原物質(zhì)在瓊脂凝膠中做電泳分離，然后于凝膠槽中加入抗體血清。使抗原抗體進(jìn)行雙向擴(kuò)散，在比例適宜部位形成特異的抗原抗體沉淀弧線。每條沉淀弧線代表一組抗原抗體復(fù)合物，故可用抗原成分分析；且可

31、以根據(jù)其遷移率與抗體所出現(xiàn)的特異反應(yīng)進(jìn)行鑒定。二、材料（一）器材：1. 玻璃載玻片（26×76mm）。2. 打孔器（外徑3mm）。3. 尖頭不銹鋼挑棒。4. 挖槽刀。5. 電泳儀，電泳槽及萬(wàn)用電表。6. 有蓋搪瓷盒（內(nèi)鋪有濕海綿墊）。（二）試劑：1. pH 8.6，0.05M巴比妥緩沖液。2. 1.2瓊脂：取1.2g優(yōu)質(zhì)瓊脂粉置1000ml三角燒瓶中，加入上述緩沖液500ml，水浴煮沸使瓊脂粉溶解，然后再加入500ml上述熱緩沖液，同時(shí)加萬(wàn)分之一硫柳汞， 混勻后分裝于150ml三角燒瓶中，4水箱保存?zhèn)溆谩?. 凝膠指示劑配制： 葡萄糖 0.5g 偶氮胭脂紅 0.1g或氨基黑10B，0

32、.1g pH 8.6，0.05M巴比妥緩沖液20ml，保存于4冰箱備用。三、方法1.瓊脂板制備：將潔凈之載玻片置于平臺(tái)上,用吸管吸取4ml熱溶的1.2瓊脂溶液于載玻片上，待凝固后按下圖打孔及開(kāi)槽。2.加樣：用不銹鋼挑棒挑去小孔中瓊脂，用毛細(xì)滴管（或加樣器）加入待檢樣品充滿(mǎn)小孔。一般待檢樣品的pH與離子強(qiáng)度最好能與瓊脂相同。蛋白含量一般在20mgml以下，否則需要用緩沖液稀釋后再進(jìn)行電泳。 3.加指示劑:為了便于控制電泳泳動(dòng)速度，可在待測(cè)樣品孔中加少許凝膠指示劑，氨基黑10B或偶氮胭脂紅染色白蛋白，因此，可根據(jù)染料的移動(dòng)，指示蛋白成分的泳動(dòng)。 4.電泳：瓊脂板兩端以三層吸水性強(qiáng)的濾紙為電橋，每邊

33、覆蓋1cm，控制電壓46伏/cm，電泳1.5小時(shí)，一般當(dāng)指示劑泳動(dòng)至離末端1cm處，停止電泳，為了防止電泳后兩個(gè)電泳槽中的緩沖液pH與離子強(qiáng)度改變，每次電泳后應(yīng)更換正負(fù)電極或?qū)刹劬彌_液混合。5.擴(kuò)散：電泳后用不銹鋼挑棒挑去槽內(nèi)瓊脂，然后加入相應(yīng)抗體充滿(mǎn)槽內(nèi)，置鋪有海綿墊的搪瓷盒內(nèi)，放在25溫箱中擴(kuò)散2472小時(shí)，連續(xù)觀察結(jié)果至沉淀弧線完全清晰為止。四、結(jié)果判斷電泳擴(kuò)散后可以直接觀察，也可染色后觀察。無(wú)色標(biāo)本觀察需在黑色背景下，用斜射光觀察，必要時(shí)借助放大鏡（25倍為宜）。染色標(biāo)本與上述相反，需在白色背景下，斜射光觀察才清楚。五、影響結(jié)果的因素抗原含量越多，則反應(yīng)沉淀線越接近抗體槽，形成的沉淀

34、弧較粗，反之，則形成的沉淀線較細(xì)。以此可做細(xì)微的蛋白質(zhì)組分分析。通過(guò)與正常血清形成的沉淀弧數(shù)量、位置和形態(tài)進(jìn)行比較，可分析標(biāo)本中所含抗原成分的性質(zhì)和含量。該法常用于血清蛋白種類(lèi)分析，如骨髓瘤及性聯(lián)丙種球蛋白血癥的診斷。六、報(bào)告要求記錄并分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)十 補(bǔ)體在溶血反應(yīng)中的作用(Action of Complement in Hemolysis)一、原理紅細(xì)胞與相應(yīng)抗體(溶血素)結(jié)合成抗原抗體復(fù)合物，可通過(guò)經(jīng)典途徑激活補(bǔ)體，導(dǎo)致紅細(xì)胞的溶解，呈現(xiàn)溶血現(xiàn)象。二、材料(一)2綿羊紅細(xì)胞(二)1100溶血素(兔抗綿羊紅細(xì)胞抗體)(三)130補(bǔ)體(新鮮豚鼠血清)(四)生理鹽水、小試管三、方法（一）取

35、潔凈小試管3支，用蠟筆分別標(biāo)記“1”、“2”、“3”。（二）每支小試管加入2綿羊紅細(xì)胞懸液0.5ml。（三）于“1”號(hào)管內(nèi)分別加入1100溶血素0.5ml和130補(bǔ)體0.5ml（四）于“2”號(hào)管內(nèi)分別加入1100溶血素0.5ml和生理鹽水0.5ml（五）于“3”號(hào)管內(nèi)分別加入130補(bǔ)體0.5ml和生理鹽水0.5ml。（六）置37水浴15分鐘。四、結(jié)果“1”號(hào)管紅細(xì)胞出現(xiàn)溶血現(xiàn)象?！?”號(hào)管和“3”號(hào)管紅細(xì)胞均勻沉淀于管底。五、注意事項(xiàng)(一)鹽水、綿羊紅細(xì)胞、溶血素均應(yīng)新鮮配制。夏季宜將試劑置4預(yù)冷，以穩(wěn)定補(bǔ)體效價(jià)。(二)所用試管應(yīng)潔凈。六、報(bào)告要求記錄并分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)十一 密度梯度離心法分

36、離單個(gè)核細(xì)胞一、原理常用來(lái)分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）的分層液比重是 1.077±0.001 的 聚 蔗糖(Ficoll)-泛影葡胺(Urografin)(FH)分層液。Ficoll是蔗糖的多聚體，呈中性，平均分子量為400,000，當(dāng)密度為1.2gml仍未超出正常生理性滲透壓,也不穿過(guò)生物膜。紅細(xì)胞、粒細(xì)胞比重大，離心后沉于管底；淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的比重小于或等于分層液比重，離心后漂浮于分層液的液面上，也可有少部分細(xì)胞懸浮在分層液中。吸取分層液液面的細(xì)胞，就可從外周血中分離到單個(gè)核細(xì)胞二、器材1. 水平離心機(jī)，顯微鏡。2. 細(xì)胞計(jì)數(shù)板，血紅蛋白吸管。 試劑：1. Hank&#

37、39;s液（無(wú)鈣鎂）應(yīng)用液。2. 淋巴細(xì)胞分離液：（比重1.0771.078）。三、操作取抗凝全血作白細(xì)胞計(jì)數(shù)(肝素稀釋液1000單位ml,采2ml血約需0.025ml1滴放入管中）。抗凝全血2ml加等量Hank's液，邊加邊搖充分混勻。用滴管將稀釋血沿管壁徐徐加入已盛有2ml淋巴細(xì)胞分離液的試管中，使血液平鋪于淋巴細(xì)胞分離液之上。離心2000轉(zhuǎn)分20分鐘。用滴管吸出單個(gè)核細(xì)胞層的細(xì)胞，加入預(yù)先準(zhǔn)備好的5ml Hank's液中，用滴管混勻，離心1500轉(zhuǎn)分10分鐘，棄上清，將試管底部的細(xì)胞充分混勻， 再加足量Hank's液，洗滌2次（每次1500轉(zhuǎn)分，5分鐘）。將細(xì)胞懸

38、液體積還原至1ml，取樣計(jì)數(shù)分別記錄白細(xì)胞數(shù)和單個(gè)核細(xì)胞數(shù)。 四、結(jié)果 白細(xì)胞回收率： 分離后淋巴細(xì)胞懸液ml數(shù)×每ml單個(gè)核細(xì)胞數(shù) ×100 全血ml數(shù)×全血中每ml單個(gè)核細(xì)胞數(shù) 淋巴細(xì)胞純度（）： 分離后淋巴細(xì)胞總數(shù) ×100 分離后白細(xì)胞總數(shù) 細(xì)胞的活力（）鑒定，用錐蘭液進(jìn)行檢查，染料滲入死細(xì)胞內(nèi)使細(xì)胞著色，活細(xì)胞排斥染料不被著色，顯微鏡下可觀察到二者的區(qū)別。 附： 錐蘭染液的配制：錐蘭1克研磨成粉末，用100ml蒸餾水調(diào)勻或加熱溶解, 濾紙過(guò)濾裝瓶。實(shí)驗(yàn)十二 E玫瑰花環(huán)試驗(yàn)(Erythrocyte Rosette Test)一、原理人類(lèi)T淋巴細(xì)胞

39、表面存有綿羊紅細(xì)胞(sheep red blood cells，RSBC)受體(E受體)。在一定條件下,SRBC可吸附在T淋巴細(xì)胞周?chē)?形成以T淋巴細(xì)胞為核心周?chē)h(huán)繞SRBC狀如玫瑰環(huán)樣的細(xì)胞集團(tuán)。能夠吸附三個(gè)以上SRBC的淋巴細(xì)胞稱(chēng)為T(mén)花環(huán)形成細(xì)胞(T rosette forming cell，TRFC）。E受體是T淋巴細(xì)胞獨(dú)有的表面標(biāo)志，因此E玫瑰花環(huán)試驗(yàn)可用于人外周血中T淋巴細(xì)胞的鑒定和計(jì)數(shù)。是測(cè)定機(jī)體細(xì)胞免疫功能的指標(biāo)之一。臨床上常做為某些疾?。馨拖到y(tǒng)增生性疾病，惡性腫瘤，自身免疫病等）的診斷，判定療效，估計(jì)預(yù)后的參考指標(biāo)。二、材料(一)肝素(25u/ml)，淋巴細(xì)胞分層液(聚蔗糖泛

40、影葡胺)，Hank's液，1SRBC，滅活小牛血清。(二)1ml吸管，注射器、針頭、碘酒等。三、方法(一)1SRBC懸液制備：取脫纖維綿羊血13ml，加等量Hank's液，混勻后1500rpm離心58分鐘，洗3次最后用Hank's液配成1懸液。(二)分離淋巴細(xì)胞1. 取小試管一支加分層液2毫升。2. 取肝素抗凝的待檢血1.5毫升沿管壁輕輕加在分層液上面，切勿混合。3. 2500rpm離心25分鐘。4. 用滴管吸取淋巴細(xì)胞層置另一小試管中，用Hank's液洗二次(2000rpm離心10分鐘)，最后一次用細(xì)胞計(jì)數(shù)(計(jì)數(shù)方法：于另一小試管中，加0.38毫升的細(xì)胞稀釋液

41、與0.02毫升的細(xì)胞懸液混勻，在血球計(jì)數(shù)板上數(shù)出4個(gè)大方格的總數(shù)?？倲?shù)×50×1000每毫升淋巴細(xì)胞數(shù))。并將其配成1×107/ml濃度的淋巴細(xì)胞懸液。(三)花環(huán)形成1. 取107淋巴細(xì)胞/ml懸液0.2ml，1SRBC懸液0.2ml和經(jīng)綿羊紅細(xì)胞吸附后的小牛血清(不經(jīng)吸附也可)0.1毫升，在小試管中混合，置37孵育5分鐘。2. 取出后2000rpm離心5分鐘，放4冰箱20分鐘。3. 取出后輕輕搖動(dòng)重新懸浮細(xì)胞，加半滴美蘭液，用滴管吸細(xì)胞懸液一滴放載玻片上，加蓋玻片后于高倍鏡下計(jì)數(shù)。四、結(jié)果高倍鏡下計(jì)數(shù)200個(gè)以上的淋巴細(xì)胞中TRFC的百分?jǐn)?shù)。凡能結(jié)合三個(gè)以上SR

42、BC者為T(mén)RFC。TRFC（%）= TRFC×100 未形成花環(huán)淋巴細(xì)胞數(shù)TRFC五、注意事項(xiàng)(一)檢測(cè)的血標(biāo)本要新鮮，放置時(shí)間不要超過(guò)34小時(shí)。(二)試驗(yàn)用的SRBC要新鮮，脫纖維血4保存不得超過(guò)10天。(三)綿羊紅細(xì)胞與淋巴細(xì)胞的比例以161501為宜。(四)E花環(huán)計(jì)數(shù)前，應(yīng)輕輕旋浮，不能用滴管用力吹打，否則會(huì)使形成的花環(huán)脫落。六、報(bào)告要求繪圖記錄并分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)十三 人外周血T淋巴細(xì)胞亞群的檢測(cè)(Detection of T Lymphocyte Subsets In Human Peripheral Blood)一、原理T淋巴細(xì)胞表面具有一系列分化抗原，根據(jù)分化抗原的不同

43、可將T細(xì)胞分為不同的亞群，如CD3、CD4、CD8等?？谷薚淋巴細(xì)胞亞群的單克隆抗體(monoclonal antibody，McAb)與T淋巴細(xì)胞表面相應(yīng)抗原特異性結(jié)合，然后以辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的羊抗鼠IgG與細(xì)胞作用，如底物顯色，陽(yáng)性細(xì)胞周邊被染為褐色環(huán)。T淋巴細(xì)胞亞群的檢測(cè)可做為測(cè)定機(jī)體細(xì)胞免疫功能的指標(biāo)及用于各種與細(xì)胞免疫功能異常有關(guān)疾病的輔助診斷。二、材料(一)新鮮肝素抗凝血；(二)淋巴細(xì)胞分層液；(三)pH7.4的PBS；(四)丙酮福爾馬林固定液；(五)抗人淋巴細(xì)胞亞群McAb CD3/CD4/CD8；(六)HRP羊抗鼠IgG

44、；(七)底物液；(八)Maryer's蘇木素染液。三、方法(一)淋巴細(xì)胞分離。1. 取肘正中靜脈血1ml，加入肝素(25u/ml)抗凝的小試管內(nèi)。2. 取小試管一只加淋巴細(xì)胞分層液1ml。3. 取肝素抗凝的待檢血1ml沿管壁輕輕加在分層液面上，切勿混合。4. 2500rpm離心25分鐘。5. 用滴管吸取淋巴細(xì)胞層之細(xì)胞置一小試管中，用PBS液洗二次(2000rpm離心10分鐘)最后一次作細(xì)胞計(jì)數(shù)(計(jì)數(shù)方法：于另一小試管中加0.38毫升細(xì)胞稀釋液與0.02毫升的細(xì)胞懸液混勻，在血球計(jì)數(shù)上取出4個(gè)大方格的總數(shù)(總數(shù)×50×1000每毫升淋巴細(xì)胞數(shù))。并將其配成1

45、5;106個(gè)細(xì)胞/ml的懸液。6. 將淋巴細(xì)胞懸液涂于10孔抗原片上，每孔20l，一份標(biāo)本涂3片，空氣中干燥。7. 將玻片放入4丙酮福爾馬林固定液中固定30秒。PBS洗兩次，每次5分鐘，吹干。(二)酶免疫染色1. 三孔分別加McAb CD3/CD4/CD8 20l/孔，置濕盒374050分鐘。PBS洗三次，每次5分鐘，吹干。2. 加HRP羊抗鼠IgG，每孔20l，置濕盒3045分鐘，沖洗同上。3. 加底物液顯色約30分鐘，顯微鏡下控制顯色時(shí)間，(顯色較深時(shí)方可終止反應(yīng))用水沖洗，干燥。4. Maryer's蘇木素復(fù)染1030秒，(不可過(guò)長(zhǎng))流水沖洗，干燥。四、結(jié)果加蒸餾水一滴，壓蓋玻片

46、，高倍鏡或油鏡下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。凡細(xì)胞周邊被染為褐色環(huán)者判為陽(yáng)性，至少計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，計(jì)算其陽(yáng)性率。陽(yáng)性率（） 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)×100淋巴細(xì)胞總數(shù)正常值：CD3：6070；CD4：4050；CD8：2030五、注意事項(xiàng)(一)檢測(cè)的血標(biāo)本要新鮮，放置時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)(34小時(shí))。(二)一份標(biāo)本涂一張抗原片，同時(shí)檢測(cè)CD3、CD4、CD8，要加單抗時(shí)及洗滌過(guò)程中難免“串門(mén)”，可將多份標(biāo)本CD3、CD4、CD8集中于不同玻片上，并分缸洗滌。(三)Maryer's蘇木素復(fù)染時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，最好控制在1020秒。(四)顯色要充分，顯微鏡下見(jiàn)細(xì)胞周?chē)^深時(shí)方可。(五)本試劑盒所用HRP羊抗鼠I

47、gG因批號(hào)不同，其稀釋度可能有差異。詳見(jiàn)工作濃度。附錄(一)丙酮福爾馬林固定液配制Na2 HPO4 20mg，KH2PO4 100mg，H2O2 30ml，丙酮45ml，福爾馬林25ml，過(guò)濾，調(diào)pH至6.6，置4備用。(二)底物液配制：3.3二氨基聯(lián)苯二胺鹽酸鹽(DAB)60mg，PBS100ml，30H2O2 30ml六、報(bào)告要求了解實(shí)驗(yàn)原理，報(bào)告檢測(cè)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)十四 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)(Lymphocyte Transformation Test)一、原理淋巴細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)，受到特異性抗原(如蛋白衍生物PPD，purified protein derivative)或非特異性有絲分裂原(如

48、：PHA，ConA)刺激后，可轉(zhuǎn)化成體積增大，代謝旺盛，蛋白與核酸合成增加，并能進(jìn)行分裂的淋巴母細(xì)胞。淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的高低，可反映機(jī)體的細(xì)胞免疫功能水平。因此，淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)可做為測(cè)定機(jī)體細(xì)胞免疫功能的試驗(yàn)之一。臨床上常作為某些疾病診斷，療效判斷、及估計(jì)預(yù)后的參考指標(biāo)。二、材料(一)新鮮肝素抗凝血、植物血凝素(phytohemagglutihin，PHA)、細(xì)胞培養(yǎng)液、甲醇、瑞氏染液。(二)培養(yǎng)瓶、試管、滴管、玻片等。三、方法(一)采血取待檢靜脈血3.5毫升，注入含有肝素的抗凝管中(25l/ml)，混勻。(二)培養(yǎng)在盛有2.5毫升營(yíng)養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中加入0.5毫升肝素抗凝血，同組共做四瓶。(三)

49、在上述兩個(gè)培養(yǎng)瓶中，每瓶加入200微克PHA，做為試驗(yàn)管，其余兩瓶不加PHA做為對(duì)照。(四)將瓶塞塞緊，平置于37溫箱中，培養(yǎng)三天，(于48小時(shí)后檢查培養(yǎng)液酸堿度，用5NaHCO3調(diào)節(jié)pH至7.27.4)。(五)培養(yǎng)完畢，取出培養(yǎng)物移入試管，并用吸管吹打聚集成團(tuán)的細(xì)胞，然后離心（1000rpm）5分鐘，棄去上清液吸取白細(xì)胞層，置另一小試管中，用毛細(xì)吸管將細(xì)胞吹散，取一滴置于載玻片上，用載玻片均勻推開(kāi)，待玻片干后，用甲醇固定5分鐘，用瑞特氏染液染色。四、結(jié)果每張片需觀察頭、體、尾三段，每段和縱列(目的是減少推片中細(xì)胞分布產(chǎn)生的誤差)，每張計(jì)數(shù)200個(gè)以上細(xì)胞，計(jì)算淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化百分率。 （一）細(xì)胞

50、形態(tài)：淋巴母細(xì)胞：細(xì)胞體積明顯增大，約1220um，形態(tài)不整齊，核膜清楚，核染色質(zhì)疏松呈細(xì)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，核內(nèi)可見(jiàn)14個(gè)核仁，胞漿崐變寬，核與胞漿比例變小，胞漿堿性明顯增加，胞漿內(nèi)可見(jiàn)小空泡，胞漿邊緣可出現(xiàn)偽足。過(guò)渡型母細(xì)胞：為未完全轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞，約1216um，核染色質(zhì)變疏松，有的見(jiàn)核仁，胞漿增多，嗜堿性增強(qiáng)。成熟淋巴細(xì)胞：與未經(jīng)培養(yǎng)的外周循環(huán)中小淋巴細(xì)胞形態(tài)一致，其直徑為68um，核染色質(zhì)致密，無(wú)核仁，胞漿比核略大，輕度堿性。 根據(jù)以上各細(xì)胞的形態(tài)，觀察結(jié)果時(shí)和為轉(zhuǎn)化細(xì)胞，為未轉(zhuǎn)化細(xì)胞。 轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞數(shù) 淋巴細(xì)胞化率×100 轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞未轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞 （二）正常值：正常情況下

51、轉(zhuǎn)化率為6080，但由于實(shí)驗(yàn)條件和操作技巧，可有一定出入。如為5060時(shí)偏低，50以下則為降低。五、注意事項(xiàng)(一)PHA用前必需測(cè)定轉(zhuǎn)化反應(yīng)的劑量。劑量太大，對(duì)細(xì)胞有毒性，劑量太小不足以刺激細(xì)胞轉(zhuǎn)化。(二)實(shí)驗(yàn)條件應(yīng)盡量固定，如改變條件，尤其營(yíng)養(yǎng)液，PHA小牛血清等，在正式試驗(yàn)前，應(yīng)進(jìn)行預(yù)試。(三)試驗(yàn)中要求嚴(yán)格無(wú)菌操作，防止污染，否則由于細(xì)菌繁殖使培養(yǎng)液pH下降，細(xì)胞發(fā)育不良，影響細(xì)胞轉(zhuǎn)化。六、報(bào)告要求繪圖記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果(未轉(zhuǎn)化的和轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞)實(shí)驗(yàn)十五 動(dòng)物過(guò)敏性休克(Anaphylactic Shock of Animal)一、原理動(dòng)物過(guò)敏反應(yīng)，是預(yù)先給動(dòng)物注射少量異種蛋白，經(jīng)過(guò)一定的潛

52、伏期，動(dòng)物體內(nèi)可產(chǎn)生特異性IgE類(lèi)抗體，結(jié)合于肥大細(xì)胞及嗜堿性粒細(xì)胞表面的FcR I，使機(jī)體處于致敏狀態(tài)。當(dāng)再次以較大量相同抗原注射后，多價(jià)變應(yīng)原與致敏靶細(xì)胞上兩個(gè)或兩個(gè)以上相鄰IgE的可邊區(qū)結(jié)合，發(fā)生FcRI交聯(lián)，細(xì)胞活化，釋放并合成大量生物活性介質(zhì)，作用于效應(yīng)組織和器官，動(dòng)物可很快地產(chǎn)生嚴(yán)重的過(guò)敏性休克的癥狀。這種反應(yīng)具有嚴(yán)格的特異性，只在大量注入同一致敏原時(shí)才能發(fā)生，用同種抗原小量多次注射可使動(dòng)物脫敏。通過(guò)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步加深型超敏反應(yīng)機(jī)理的理解，提高對(duì)防治青霉素等藥物過(guò)敏反應(yīng)重要性的認(rèn)識(shí)。二、材料(一)動(dòng)物：健康豚鼠（150250g）兩只。(二)抗原：馬（或牛、羊）血清。(三)無(wú)菌注射器及針

53、頭、碘酒精棉球等。三、方法(一)致敏注射取體重250克健康豚鼠甲、乙兩只，甲豚鼠由皮下注射小牛血清0.1毫升致敏，乙豚鼠留作對(duì)照。(二)決定注射經(jīng)23周后取甲、乙兩只豚鼠由心臟注射牛血清1.52毫升。觀察對(duì)比兩者之反應(yīng)。四、結(jié)果甲豚鼠可在注射后幾分鐘內(nèi)有不安、前爪抓鼻、豎毛、咳嗽，繼而產(chǎn)生全身抽搐，大小便失禁，最后因窒息而死亡。乙豚鼠安然無(wú)恙。五、注意事項(xiàng)(一)前后所用抗原相同。(二)決定注射時(shí)，應(yīng)保證抗原物質(zhì)注射入心臟內(nèi)。六、報(bào)告要求結(jié)合超敏反應(yīng)的理論，分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)十六 肥大細(xì)胞脫顆粒試驗(yàn)（Degranulation of Mast cell）一、原理肥大細(xì)胞包括結(jié)締組織肥大細(xì)胞和黏膜肥大細(xì)胞，結(jié)締組織肥大細(xì)胞分布于皮下小血管