生化實驗報告離子交換柱層析分離純化蔗糖酶

1、沖戸必象實驗報告二、實驗內(nèi)容和原理 四、實驗方法和步驟 六、實驗結(jié)果和分析一、實驗?zāi)康暮鸵笕嶒灢牧虾椭饕獌x器 五、實驗數(shù)據(jù)記錄和處理 七、實驗討論和心得一、實驗?zāi)康暮鸵?、學(xué)習(xí)離子交換層析的基本原理2、學(xué)習(xí)離子交換層析分離蛋白質(zhì)的基本方法和技術(shù)3、學(xué)習(xí)蔗糖酶活性檢測的基本原理和方法二、實驗內(nèi)容和原理1、離子交換層析由于蔗糖酶的偏酸性，所以在7.3緩沖液的環(huán)境中，粗分離純化樣品蔗糖酶帶負(fù)電荷， 因此我們用陰離子交換劑可以先與蔗糖酶樣品可逆交換吸附，然后通過用鹽離子強度逐漸提 高的洗脫液，使蔗糖酶和其他雜蛋白質(zhì)的電荷被中和，與離子交換劑的親和力降低，把不同 的蛋白質(zhì)按所帶電荷的強弱逐一被洗

2、脫下來，從而達(dá)到分離蔗糖酶的目的。2、酶活力檢測蔗糖酶是一種水解酶，它能蔗糖水解為等量的葡萄糖和果糖（還原糖）。（50C水解）3.5 -二硝基水楊酸與還原糖共熱被還原成棕紅色的氨基化合物，在一定范圍內(nèi)還原糖的量和反應(yīng)液的顏色深度成正比。（100C顯色）三、實驗材料和主要儀器1、實驗材料蔗糖酶粗分離純化（溶解即為樣品川）2、實驗試劑20 7.3 緩沖液20（1 ） 7.3緩沖液0.2乙酸緩沖液，4.55%蔗糖溶液3，5-二硝基水楊酸試劑3、實驗儀器（1）高速冷凍離心機（2）層析柱（© 1.0 X 20 cm ） （1 支/ 組）(3) ? (1 套 / 組)(4) 部分收集器及收集試管

3、(4管)(1臺/組)(5) 20C冰箱(保存樣品用)(6) 微量移液槍200、1000(7) 1.5離心管(留樣品川和樣品W用)(8) 7離心管(留樣品W用)(9) 恒溫水浴(50C、100C)空白對照(1)樣品管(n)(10) 試管、移液管、試管架等四、實驗方法和步驟1、儀器連接(1) 接通各儀器電源，將泵頭分別放置 A, B兩個溶液瓶中。注意B為含溶液。(2) 點擊電腦桌面上軟件圖標(biāo)，打開軟件。選擇，點擊，進(jìn)入操作界面。點擊(3) 在操作界面的工具欄，點擊。出現(xiàn)窗口，調(diào)節(jié)為1，確定。2、裝柱與平衡(1) 檢查層析柱的兩端接頭，底端有膜的置于下方。(2) 程序暫停。將層析柱放入卡槽，上端接頭

4、與混合器()相連，下端接頭與樣品閥()相 連。(3) 平衡一個柱體積(約2020)3、加樣停止加入20 7.3 緩沖液。待緩沖液液面與膠體表面相切時，程序暫停。旋開柱上方接 頭，用膠頭滴管緩慢將5蔗糖酶蛋白樣品溶液(樣品川)加入層析柱中，注意順著柱壁滴加， 盡可能保持膠面平整。程序繼續(xù)，使樣品溶液進(jìn)入膠體，待樣品溶液完全進(jìn)入膠體后，程序 暫停，用少量洗脫緩沖液將殘余在層析柱壁上端的樣品洗下，并完全進(jìn)入膠體后，再加緩沖 液至一定高度。4、洗脫(梯度洗脫法)(1) 加樣后，先用進(jìn)行洗脫，洗去未被凝膠吸附的雜蛋白(20左右)；(2) 待層析柱流出液在儀器上繪出的基線穩(wěn)定，在程序主界面的工具欄f f

5、f， 在兩個框內(nèi)均填入100,點擊，最后點擊一次，開始梯度洗脫。每2接一管，當(dāng)上升至8時, 開始測定各管的蔗糖酶活力；(3) 將蔗糖酶活力高的若干管酶液(2-3管)合并，測量總體積 V4(樣品W),樣品用7離 心管20 C保存。5、蔗糖酶活力檢測0.2乙酸緩沖液，4.50.50.55%蔗糖溶液0.50.5蒸餾水1.00.95部分收集的酶液/0.0550 C水浴53.5 二硝基水楊酸試劑（）0.50.5100 C水浴2蒸餾水3.03.0觀察顏色五、實驗數(shù)據(jù)記錄和處理上次實驗粗提取的蔗糖酶蛋白溶液 V3=12.3本次實驗加樣的蔗糖酶蛋白溶液 V3' =5.0蔗糖酶活力高的兩管酶液合并后 V

6、4=4.0六、實驗結(jié)果和分析1、洗脫曲線a10iC3040SO708aICCl»IKdfeKrgjrfcFi（1）曲線 在55-70時，曲線有兩個峰值，這是未被凝膠吸附的雜蛋白的體現(xiàn)。 85-95的峰值性狀較為“規(guī)準(zhǔn)”，但經(jīng)過活性檢測發(fā)現(xiàn)為雜蛋白。 105-120有一個峰值較小的峰，經(jīng)過活性檢測其中含有活性較高的蔗糖酶。實驗名稱：離子交換柱層析分離純化蔗糖酶姓名：吳逸璇學(xué)號:3170100207（2） 在73左右，B的值瞬間上升，這是由于操作失誤導(dǎo)致的。當(dāng)時直接把的閥門由A 轉(zhuǎn)換到B,而沒有一個梯度的上升。但好在及時止損，開始了正確的操作。正確操作：“在程序主界面的工具欄 f f ，

7、在兩個框內(nèi)均填入100，點擊， 最后點擊一次，開始梯度洗脫?！保?）的值隨著B濃度的增長而增長（導(dǎo)電性增加）。顏色比實際顏色要淺，實際顏色更深），說明在對應(yīng)的兩個時間段內(nèi)洗脫出活性較高的蔗糖 酶。七、實驗討論和心得1、 如上所述，在層析柱流出液在儀器上繪出的基線穩(wěn)定后進(jìn)行 B的梯度洗脫時，進(jìn)行了錯 誤的操作（直接將 的閥門由A轉(zhuǎn)換到B），這導(dǎo)致了 B濃度的突然上升，在之后一段時間內(nèi)， 較高濃度的B可能將柱上部分蔗糖酶與雜蛋白一起洗脫下去，導(dǎo)致之后的第一個峰沒能夠檢 測出目標(biāo)蛋白。2、什么是梯度洗脫？梯度洗脫（）又稱為梯度淋洗或程序洗脫。在同一個分析周期中，按一定程度不斷改變流動 相的濃度配比，稱為梯度洗脫。在同一個分析周期中，按一定程度不斷改變流動相的濃度配 比，稱為梯度洗脫。從而可以使一個復(fù)雜樣品中的性質(zhì)差異較大的組分能按各自適宜的容量 因子k達(dá)到良好的分離目的。梯度洗脫的優(yōu)點：1.縮短分析周期；2.提高分離能力；3.峰型得到改善，很少拖尾；4增加 靈敏度。但有時引起基線漂移。3、心得這次實驗使用的主體儀器是？，這臺儀器的存在大大改良且簡化了實驗