20S人參皂苷Rh2對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和周期的影響

1、20_S_人參皂苷Rh_2對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和周期的影響李秋影 炎璐璐 馬曉慧 張莉華 張?zhí)m蘭 郭治昕（1. 天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津300193；2. 天津天士力研究院藥理毒理所，天津3004410）摘要：目的 研究20（S）-人參皂苷Rh2對(duì)人結(jié)腸癌Cacao-2和HT-29細(xì)胞增殖及周期的影響。方法 采用熒光微孔法測(cè)定20（s）-人參皂苷Rh2對(duì)人結(jié)腸癌Cacao-2、HT-29細(xì)胞增殖的影響：利用顯微鏡觀察給藥后HT-29細(xì)胞形態(tài)變化：流式細(xì)胞術(shù)分析20（s）-人參皂苷Rh2對(duì)HT-29細(xì)胞周期分布的影響。結(jié)果 20（S）-人參皂苷Rh2對(duì)Caco-2、HT-29細(xì)胞生長(zhǎng)有抑制作用，并呈劑

2、量依賴性：20（S）-人參皂苷Rh2作用48h后，對(duì)HT-29、Caco-2細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為19.68、26.79g/ml；流式細(xì)胞分析結(jié)果現(xiàn)實(shí)，與對(duì)照組細(xì)胞相比，20（S）-人參皂苷Rh2能顯著減少HT-29細(xì)胞的G0/G1期和G2/M期細(xì)胞比例，增加D期細(xì)胞比例。結(jié)論 20（S）-人參皂苷Rh2可抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞增殖，主要原因是阻滯細(xì)胞處于S期關(guān)鍵詞： 20（S）-人參皂苷Rh2：HT-29：Caco-2：細(xì)胞增殖：細(xì)胞周期中圖分類號(hào)：R996 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1001-1528（2001）11-1874-05人身為五加科人參屬植物人參Panax ginsen

3、g C.A.meyer的干燥根，是已有幾千年應(yīng)用歷史的名貴中藥。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，人參中包含有機(jī)酸、維生素、糖類、無(wú)機(jī)鹽、固醇、寡肽、多糖、揮發(fā)油類和人參皂苷等多種成分，具有抗腫瘤、抗衰老、抗輻射等多種生物活性。人參皂苷Rh2作為人參中一類主要生物活性成分，在癌癥的治療方面具有較強(qiáng)的活性，其中一人參皂苷-Rg3為主要成分的抗癌新藥參一膠囊已作為中藥一類新藥上市。大量研究表明，人參皂苷Rh2也同樣具有較好的抗癌活性，如通過(guò)抑制端粒酶活性從而誘導(dǎo)肝癌SMMC-7721細(xì)胞分化、通過(guò)介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)Caspase一類半肽氨酸蛋白酶進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)進(jìn)而誘導(dǎo)人黑色素腫瘤細(xì)胞A375-S2細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)凋亡以及逆

4、轉(zhuǎn)耐藥的白血病細(xì)胞等。藥代動(dòng)力學(xué)研究表明，人參皂苷-Rh2主要在肝、胃腸道分布；并通過(guò)線粒體途徑包括P53、CASP5等多靶點(diǎn)誘導(dǎo)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞凋亡，國(guó)內(nèi)也有文獻(xiàn)初步報(bào)道人參皂苷Rh2可抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW620和LOVO生長(zhǎng)。從結(jié)構(gòu)上，人參皂苷Rh2可分為S型和R型的構(gòu)象，其中20（S）-人參皂苷Rh2單體（20（S）-G-Rh2）是植物中分離的主要構(gòu)型。但20（S）-G-Rh2單體對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞Ht-29和Caco-2的影響目前還未見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在觀察20（S）-G-Rh2對(duì)人結(jié)腸癌Caco-2和Ht-29細(xì)胞增殖及對(duì)周期的影響，以期為新藥研發(fā)和臨床治療結(jié)腸癌提供理論依據(jù)。1 材

5、料和儀器20（s）-G-Rh2（天津天士力藥物研究院現(xiàn)代中藥研究所，純度為90%）：DMEM培養(yǎng)基（GIBCO-BRL公司）；胎牛血清（G1BCO-BRL公司）；二乙酸熒光素Flourescein Diacetate,FDA（Sigma）；Cell Cy-cle Phase Determination Kit（Cayman Chemical Com-pany）；流失細(xì)胞儀FACSCcalibur（Bechman Dickson公司）；Caco-2、HT-29細(xì)胞由西河醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心引進(jìn)，由本實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)；2 方法2.1 細(xì)胞培養(yǎng)于傳代 將HT-29和Caco-2細(xì)胞至于37，飽和濕

6、度5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，均用含10%熱滅活胎牛血清，1%的抗生素（青霉素100mg/L和鏈霉素100mg/;）的DMEM完全培養(yǎng)基。細(xì)胞呈單層生長(zhǎng)，達(dá)80%左右融合時(shí)，采用0.25%的胰酶和0.02%EDTA（1：1）混合消化液（胰酶）消化傳代，取生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。2.2 熒光微孔法監(jiān)測(cè)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HT-29、Caco-2細(xì)胞，用胰酶消化，用DMEM完全培養(yǎng)基配成單個(gè)細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104個(gè)/mL。接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔接種100L，于37，飽和濕度5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后換液，空白對(duì)照組為DMEM培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組每孔加入50-12.

7、5g/mL5個(gè)濃度的20（2）-G-Rh2（用DMEM培養(yǎng)基配置）處理48h，每個(gè)濃度組及對(duì)照組君左3個(gè)平行孔。48h后吸棄板中培養(yǎng)基，加入100L含2.5g/mL二乙酸熒光素的PBS重復(fù)洗2變，甩去PBS并吸棄板中剩余的PBS，Leica DM16000B 電動(dòng)倒置熒光相對(duì)顯微鏡在激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為488nm和530nm下，測(cè)定每孔的熒光強(qiáng)度。根據(jù)熒光強(qiáng)度計(jì)算藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率，并求算出半數(shù)抑制濃度（IC50），實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率%=（1-給藥組熒光強(qiáng)度/對(duì)照組熒光強(qiáng)度）×100%2.3 顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HT-29、Caco-2細(xì)胞，用胰酶

8、消化，用完全培養(yǎng)基配成單個(gè)細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104個(gè)/mL，每孔2mL細(xì)胞懸液細(xì)胞懸液種于放置蓋玻片的6孔板中，培養(yǎng)細(xì)胞爬片生長(zhǎng)。培養(yǎng)24h，帶細(xì)胞在蓋玻片上貼壁良好后，加入0.2mL20g/mL20（S）-G-Rh2處理細(xì)胞48h，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HT-29細(xì)胞，用胰酶混合消化液消化，用完全培養(yǎng)基配成單個(gè)細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104 個(gè)/mL。接種于6孔培養(yǎng)板中，每孔接種2mL，于37，飽和濕度為5%CO2培養(yǎng)箱中，每孔接種2mL，于37 ，飽和濕度5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，換無(wú)血清的DM

9、EM培養(yǎng)液同步化24h，加不同濃度的20（S）-G-Rh2處理細(xì)胞24h，加不同濃度的20（S）-G-Rh2處理細(xì)胞24h后，經(jīng)胰酶（不加EDTA）消化，Assaybuffer洗2遍，（3000rpm，3min），加入固定液固定2h，上機(jī)前離心棄去固定液，加入100mg/LR-Nase和5g/L碘化丙啶（PI）染色劑，染色避光30min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期變化。2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理用SPSS10.0軟件完成統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，軟件完成統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差即（±S）表示，組間分析比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3. 結(jié)果 3.1 20（S）-G

10、-Rh2對(duì)Caco-2和HT-29細(xì)胞增殖的影響 二乙酸熒光素（FDA）可透過(guò)細(xì)胞膜并脫脂釋放熒光素積累在活細(xì)胞中，激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為488nm和530nm，常用于檢測(cè)細(xì)胞存活率。本研究采用FDA為熒光指標(biāo)劑建立了微孔板法進(jìn)行20（S）-G-Rh2對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞Caco-2和HT-29的增殖影響研究。結(jié)果顯示，20-（S）-G-Rh2對(duì)Caco-2和HT-29細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用，其抑制作用隨藥物濃度而增強(qiáng)，呈現(xiàn)較好的劑量依賴性。計(jì)算藥物對(duì)HT-29和Caco-2細(xì)胞的半數(shù)抑制率（IC50）分別為19.68g/mL和25.79g/mL。（結(jié)果如表1，圖1、2）。3.2 顯微鏡觀察細(xì)胞形

11、態(tài)學(xué)變化 20g/mL 20（S）-G-Rh2處理48h后的HT-29細(xì)胞較空白對(duì)照組細(xì)胞成群貼壁生長(zhǎng)、細(xì)胞透亮，折光性好。而給藥組細(xì)胞之間互相脫離，顏色加深，貼壁細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞輪廓消失。（見(jiàn)圖3）。3.3 20（S）-G-Rh2對(duì)HT29細(xì)胞周期的影響20（S）-G-Rh2處理24h后細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期各時(shí)相細(xì)胞數(shù)。結(jié)果顯示;20g/mL 20（S）-Gh2處理24h后HT-29細(xì)胞在細(xì)胞周期的分布發(fā)生嫻熟性的變化。對(duì)照組G0/G1期、G2/M期、G2/M期、S期細(xì)胞比例分別為（76.78±4.0）%、（3.61±2.1）%和（19.60±3.5

12、9）%、（0.8±1.21）%及（54.54±2.17）%：給藥組20（S）-G-Rh2的G0/G1期和G2/M期細(xì)胞比例明顯的減少，S期細(xì)胞比例升高，與對(duì)照組有顯著性差異（P<0.05），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，（建表2，圖4）。4 討論結(jié)腸癌是胃腸道中常見(jiàn)的惡性腫瘤，臨床主要以手術(shù)治療并術(shù)后放療和化療為主要治療手段，但對(duì)晚期效果不佳。人參皂苷是人參的主要生物活性成分，人參皂苷單體中G-Rh2具有抑癌活性，并對(duì)正常組織毒性甚低。目前體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：通過(guò)對(duì)細(xì)胞周期的影響，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而時(shí)間和劑量依賴性的抑制多種多種腫瘤細(xì)胞的增殖。但20（S）-人參皂苷Rh2對(duì)人結(jié)直腸

13、癌細(xì)胞Caco-2和HT-29的研究還未見(jiàn)到報(bào)道,因此本研究通過(guò)體外培養(yǎng)人結(jié)腸癌細(xì)胞Caco-2和HT-29細(xì)胞，考察20（S）-G-Rh2對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡及細(xì)胞周期的影響做初步的探究。本研究結(jié)果表明，20（S）-G-Rh2可抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞Caco-2和HT-29細(xì)胞生長(zhǎng)，且這一變化在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)存在劑量依賴性，其IC50分別為19.68和26.79g/mL。顯微鏡下現(xiàn)實(shí)：當(dāng)一定劑量的20（S）-G-Rh2作用48h后的人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29出現(xiàn)明顯的細(xì)胞死亡形態(tài)。腫瘤的發(fā)生是一個(gè)多步驟、多因素、多階段改變的過(guò)程，其中細(xì)胞周期調(diào)控失控被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生的重要機(jī)制。細(xì)胞凋亡可發(fā)生在細(xì)胞周期的各個(gè)時(shí)相。采用流式細(xì)胞分析技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞周期研究，結(jié)果顯示：20（S）-G-Rh2能顯著減少HT-29細(xì)胞的G0/G1期和G2/M期細(xì)胞比例，增加S期細(xì)胞比例，說(shuō)明20（S）-G-Rh2可阻滯人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29于S期。與-拉帕醌阻滯結(jié)腸癌細(xì)胞SW480、SE620和DLD-1于S期進(jìn)而導(dǎo)致凋亡的機(jī)制相同。綜上所述，2