ELISA完全總結

1、ELISA緩沖液配方 書中ELISA封閉液：含5%脫脂奶粉或者5%BSA的PBS，請問5%BSA指的也是質量分數(shù)嗎？，因為師姐筆記寫的是體積分數(shù)，網(wǎng)上查了查也沒弄清楚，請指教。樣品稀釋液可以直接就用PBS稀釋嗎？文獻上提到稀釋液中也含脫脂奶粉或BSA，請指教PBST中吐溫-20的體積分數(shù)為0.05%，這個含量是固定的嗎？1.含5%脫脂奶粉或者5%BSA的PBS，5%BSA用質量分數(shù)即可；2.樣品稀釋液一般可以用洗液直接稀釋，也可加入一些蛋白（如脫脂奶粉或BSA）或牛、兔等血清，要根據(jù)你的試驗而定；3.至于PBST中吐溫-20的體積分數(shù)，可以0.05%0.2%，可以在你試驗過程中摸索。4.提供一

2、般科研用簡單配方，這些你都可以在網(wǎng)上或別人的文章中查到，僅供參考：洗滌緩沖液(PH7.4 PBS)：0.15MKH2PO4 0.2克Na2HPO4·12H2O2.9克NaCl8.0克KCl0.2克Tween-200.050.5ml加蒸餾水至1000ml封閉液：牛血清白蛋白(BSA) 5克加洗滌緩沖液至100ml。稀釋液：牛血清白蛋白(BSA) 1克加洗滌緩沖液至100ml 或以羊血清、兔血清等血清與洗滌液配成510使用。BSA最好現(xiàn)配，價格又比脫脂奶粉貴，所以宜少量現(xiàn)用現(xiàn)配！BSA一般是質量體積比，正如樓上所說，1%3%為宜，如果實在是結果假陽性多，可加到5%！TBST中吐溫的濃度與

3、你的洗滌強度（洗滌次數(shù)，洗滌時間，振蕩幅度）有關，需要按實驗數(shù)據(jù)來變化！ 一、操作步驟用于檢測未知抗體的間接法1.       包被：用0.05MpH9.6碳酸鹽包被緩沖液將抗原稀釋至蛋白質含量為110µg/mL。在每個聚苯乙烯板的反應孔中加0.1mL，37溫育2小時。棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。（簡稱洗滌，下同）2.       封閉：間接法測定中，封閉一般是不可少的，最常用的封閉劑是0.05%-0.5%的牛血清白蛋白，每孔中加0.1 mL，37

4、溫育1-2小時，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。（同時做空白孔、陰性對照孔及陽性對照孔）3.       加樣：加一定稀釋的待檢樣品（未知抗體）0.1 mL于上述已包被之反應孔中，置37孵育1小時。然后用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。（同時做空白孔、陰性對照孔及陽性對照孔）4.       加酶標抗體：于各反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標抗體（經(jīng)滴定后的稀釋度）0.1 mL。37孵育0.5-1小時，洗滌3次，最后一遍用DDW洗滌，DEA（二乙醇氨）緩沖液平衡5min

5、。5.       加底物液顯色：于各反應孔中加入臨時配制的100µL 1mg/mL的PNPP，3045分鐘顯色。6.       終止反應：于各反應孔中加入1M氫氧化鈉0.05mL。7.       結果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結果：反應孔內(nèi)顏色越深，陽性程度越強，陰性反應為無色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺，以“”、“”號表示。也可測定OD值：在ELISA檢測儀上，于405nm處，以空白對照孔調(diào)

6、零后測各孔OD值，若大于規(guī)定的陰性對照OD值的2.1倍，即為陽性。計算公式：（待測樣OD空白OD）（陰性對照OD空白OD）。若兩者比值大于2.1可判讀為陽性。二、試劑配方：1.       試劑（1）       包被緩沖液（pH9.6 0.05M碳酸鹽緩沖液）：Na2CO3 1.59克 NaHCO3 2.93克 加蒸餾水至1000mL。（2）       洗滌緩沖液（pH7.4 PBS）：0.15M KH2PO4

7、0.2克 Na2HPO4·12H2O 2.9克 NaCl 8.0克 KCl 0.2克 Tween-20 0.05 0.5mL 加蒸餾水至1000mL。（3）       稀釋液：牛血清白蛋白（BSA）0.1克 加洗滌緩沖液至100mL。（4）       終止液（1M NaOH）：4克NaOH溶于80mL DDW中，加DDW定容至100毫升。（5）       底物緩沖液（pH9.8二乙醇氨）：二乙醇氨97

8、mL，加水至900mL，HCl調(diào)pH至9.8，定容至1L。（6）       PNPP：取5mg底物緩沖液，按1mg/mL加入PNPP。反應前10min配制此溶液。（7）       酶聯(lián)緩沖液（pH7.4）：PVP（MW24000）20.0g；Tween-20 0.5mL；BSA2.0g；MgCl2·6H2O0.2g。上述藥品溶于PBS溶液中，定容至1L。2.       器材：（1） 

9、0;     聚苯乙烯塑料板（簡稱酶標板）40孔或96孔，ELISA檢測儀，50µL加樣器，塑料滴頭，小毛巾，洗滌瓶。（2）       小燒杯、玻璃棒、試管、吸管和量筒等。（3）       4冰箱，37孵育箱。1. 包被抗原的選擇 包被抗原可分為天然蛋白、重組蛋白和小分子抗原三大類。天然蛋白需經(jīng)純化才能用直接吸附法包被，對于含雜質較多的抗原可以采 用間接捕獲法包被（先用能夠與目的抗原反應的物質如抗體直接吸附在酶標板上，再通

10、過特異性反應使抗原固相化）。經(jīng)純化的重組蛋白一般皆可直接包板。小分子 抗原比如多肽以及一些小分子有機化合物，由于分子量太小，往往難于直接吸附在酶標板上，一般都先使其與無關蛋白質如BSA等偶聯(lián)，偶聯(lián)物吸附于固相載體 上。  2.包被液的選擇 一般常用的是pH9.6的碳酸鹽緩沖液，如果包被的抗原在堿性條件下不穩(wěn)定的話，也可以使用pH7.2的磷酸 鹽緩沖液。 3.包被溫度的選擇 通常是4-8度條件下過夜或者37度保溫2小時，我們強烈建議4-8度條件下包被，有利于蛋白活性的保 持。  4.包被濃度的選擇 包被的最適濃度隨固相載體和包被物的性質變化，一般蛋白質的包

11、被濃度為1-5ug/ml，要明確針對特定包 被抗原的最適包被濃度需要通過實驗來確定。  包板后需要封閉嗎？應該選擇什么樣的封閉體系？  封閉是否必要，取決于ELISA的模式 及具體的實驗條件。一般說來，雙抗體夾心法，只要酶標記物是高活性的，操作時洗滌徹底，不經(jīng)封閉也可得到滿意的結果。而在間接法測定中，封閉一般是必不可 少的。常用的封閉劑有0.05%-0.5%的BSA、10%的小牛血清、1%明膠、5%的脫脂奶粉，AbMART推薦使用5%脫脂奶粉，價廉而且 封閉能力強，不過5%脫脂奶粉只適合短期內(nèi)使用，不宜長期保存，所以試劑盒中較少使用。 ELIS

12、A雙抗體夾心法原理、特點和實驗步驟1、原理ELISA 的基礎是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。結合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學活性，酶標記的抗原或抗體既保留其免疫學活性，又保留酶的活性。受檢標本與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與液體中的其他物質分開。加入酶標記的抗原或抗體，通過反應也結合在固相載體上。加入酶反應的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標本中受檢物質的量直接相關，根據(jù)呈色的深淺進行定性或定量分析。酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應的結果，使測定方法達到很高的敏感度。2、特點某些分泌型蛋白，用siRNA 干

13、擾后可以用ELISA 進行檢測。3、ELISA 實驗流程示圖（以雙抗體夾心法為例） 4、試劑與耗材（1） 包被緩沖液 （pH 9.6 0.05 M 碳酸鹽緩沖液）：（2）洗滌緩沖液 （pH 7.4，0.15 M PBS）：（3）稀釋液：（4）終止液（2 M H2SO4）： （5）底物緩沖液 （pH 5.0）：（6）四甲基聯(lián)苯胺（TMB）使用液：（7）2，2-連氮基-雙-3-乙基-苯丙噻唑啉磺胺（ABTS）使用液：（8）抗原、抗體和酶標記抗體：按說明書處理。（9）標準品：用稀釋液稀釋成梯度濃度溶液。（10）96 孔聚苯乙烯塑料板 （酶標板）。2、實驗步驟（雙抗體夾心法）：（1）包被：用包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質含量為1-10 g/mL。在酶標板反應孔中加0.1 mL，4過夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗板3 次，每次3 min。（2）加樣：加一定濃度稀釋的待檢樣品（同時做空白對照，陰性對照孔及陽性對照）0.1 mL 于上述已包被的反應孔中，置濕盒中，37， 1 hr。用洗滌緩沖液洗板3 次，每次3 min。（3）加酶標抗體：于各反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標抗體 （經(jīng)滴定后的稀釋度） 0.1ml。37，0.5 - 1