氟硼二吡咯-葉酸光敏劑的制備及其體外光動(dòng)力活性研究

1、氟硼二吡咯-葉酸光敏劑的制備及其體外光動(dòng)力活性研究Mei-Rong Ke, Sin-Lui Yeung, Dennis K. P. Ng,Wing-Ping Fong,and Pui-Chi Lo香港中文大學(xué)，生命科學(xué)學(xué)院，化學(xué)系。文摘：制備了兩種共軛體系延長(zhǎng)的氟硼二吡咯光敏劑并用各種光譜分析方法進(jìn)行了表征。相比于人類(lèi)乳腺癌MCF-7細(xì)胞，這些偶聯(lián)物對(duì)高表達(dá)葉酸受體的人類(lèi)鼻咽癌KB細(xì)胞展現(xiàn)出更高的光細(xì)胞毒性。含更短的寡甘醇鏈的偶聯(lián)物（化合物11a），由于有更高的細(xì)胞吸收活性及稍低的聚合趨勢(shì)，因此對(duì)這兩種癌細(xì)胞株的光細(xì)胞毒性有特別大的區(qū)別，其對(duì)KB細(xì)胞的IC50值(0.06M)比MCF-7低了4

2、3倍,而相比于另一個(gè)含更長(zhǎng)鏈的同類(lèi)物（化合物11b），IC50值只低了六倍。鏈的長(zhǎng)度也會(huì)影響他們的亞細(xì)胞定位，化合物11a對(duì)KB細(xì)胞的內(nèi)網(wǎng)顯示高親和力,化合物11 b則主要是定位于溶酶體上。1.引言：開(kāi)發(fā)出新穎高效的光動(dòng)力治療光敏劑(PDT)1-4已成為學(xué)術(shù)界的研究熱點(diǎn)，除了經(jīng)典的四吡咯衍生物，如卟啉、卟吩、脫鎂葉綠酸和酞菁，氟硼二吡咯（BODIPY）衍生物也有成為光敏劑的希望，這歸因于它們可通過(guò)化學(xué)方法改變骨架獲得理想的光學(xué)及光物理性質(zhì)，以及即使在水介質(zhì)中也具有的相對(duì)高穩(wěn)定性。然而這一領(lǐng)域的研究并沒(méi)有被充分地發(fā)展起來(lái)。如最近的兩篇評(píng)述文章所報(bào)道的，大部分的BODIPY光敏劑僅限于吸收帶在近紅

3、外區(qū)的硫唑嘌呤-BODIPY，而那些非硫唑嘌呤類(lèi)BODIPY則很少被研究，盡管它們?cè)诒贿m當(dāng)修飾后吸收帶也位于近紅外區(qū)，并表現(xiàn)出優(yōu)越的光動(dòng)力活性，而且在內(nèi)消旋位置也可以引入一個(gè)額外的功能基團(tuán)。我們最近報(bào)道了一系列聚乙二醇聯(lián)苯乙烯BODIPY衍生物，他們的細(xì)胞攝取、亞細(xì)胞定位和光細(xì)胞毒性受苯乙烯基取代基影響很大。其中含五個(gè)三乙二醇鏈的化合物對(duì)人類(lèi)大腸癌HT29細(xì)胞顯示出了最高的效力，其IC50僅為7nM。作為本研究的擴(kuò)展,在此我們報(bào)告兩個(gè)在內(nèi)消旋位置與葉酸通過(guò)三唑環(huán)橋寡甘醇鏈接的類(lèi)似物,包括他們的制備和體外光動(dòng)力活性。我們也研究了鏈的長(zhǎng)度對(duì)其性質(zhì)的影響。在高效光敏劑的開(kāi)發(fā)方面，一個(gè)主要的挑戰(zhàn)是提高

4、選擇性，以使它們可以?xún)?yōu)先定位在腫瘤部位并發(fā)揮功效。一個(gè)常見(jiàn)的策略是通過(guò)直接共軛結(jié)合目標(biāo)配體,如單克隆抗體、蛋白質(zhì),多肽,類(lèi)固醇和葉酸10-12。在這些藥物靶向性載體中，葉酸特別引人注意，這是因?yàn)樗麄兊牡头肿恿?、高穩(wěn)定、高組織滲透性,和非致敏性，更重要的是，那些真核細(xì)胞生物合成核苷酸所需的基于蝶呤的維生素對(duì)葉酸受體有很高的親和力，這在大多數(shù)上皮癌細(xì)胞中表現(xiàn)的非常明顯，但在正常組織中并不如此。因此，作為一個(gè)提高藥物腫瘤選擇性的有效方法，葉酸作為各種成像和治療藥劑載體已被廣泛研究。有潛在應(yīng)用于PDT的葉酸共軛的許多光敏劑已見(jiàn)報(bào)道，包括卟啉、脫鎂葉綠酸、卟吩、細(xì)菌葉綠素和包埋光敏劑的量子原子團(tuán)以及納米

5、粒子。我們相信,通過(guò)葉酸-苯乙烯組聯(lián)BODIPY，得到的偶聯(lián)物能表現(xiàn)出更強(qiáng)的腫瘤選擇性,從而有利于靶向PDT。2.結(jié)果和討論2.1合成和表征線路圖1顯示了這些偶聯(lián)物的合成路線。首先用羥基BODIPY130與溴丙炔2或炔基甲苯磺酸鹽3在K2CO3存在下于丙酮中反應(yīng)得到相應(yīng)的取代產(chǎn)物4a和4b。為了通過(guò)重原子效應(yīng)促進(jìn)系間竄越和單線態(tài)氧的生成，化合物4a和4b分別通過(guò)在乙醇中與碘和碘酸混合反應(yīng)得到相應(yīng)產(chǎn)物5a和5b。然后通過(guò)Knoevenagel縮合反應(yīng)與對(duì)三乙二醇苯甲醛632反應(yīng)得到聯(lián)苯乙烯BODIPY化合物7a和7b。這一修飾可以延長(zhǎng)它的共軛體系使吸收帶轉(zhuǎn)移至紅色,從而有利于光滲透到組織中。乙二

6、醇鏈則用于提高此染料的親水性、生物相容性和細(xì)胞攝取率。然后將葉酸8與2-【2-（2-疊氮乙氧）乙氧基】乙胺9在DCC和吡啶存在下于DMSO中反應(yīng)得到同分異構(gòu)體-和-酰胺基的疊氮葉酸10，如高效液相色譜分析（圖1）所示，這兩個(gè)同分異構(gòu)體的比例約為3:7，這是由于葉酸的-羧基的空間位阻較小，反應(yīng)活性高因此以酰胺在位的產(chǎn)物（如線路圖1中所示）為主，這與其他文獻(xiàn)的報(bào)導(dǎo)相符。20,33,34這兩種混合物未經(jīng)分離，直接與炔基聯(lián)苯乙烯BODIPYs 7 a和7 b進(jìn)行點(diǎn)擊反應(yīng)，分別得到化合物11a和11b。這兩個(gè)化合物通過(guò)高效液相色譜純化并用紫外-可見(jiàn)特征光譜和高分辨率電噴霧（ESI）質(zhì)譜進(jìn)行了表征。如圖S

7、1b和S1c所示，與10的信號(hào)相比，11a和11b信號(hào)的分辨率不高，尤其是11b。所有其他新化合物也都用各種光譜學(xué)分析方法和元素分析方法進(jìn)行了充分的表征。2.2.電子吸收及光物理性質(zhì)我們?cè)贒MF中測(cè)定了11a和11b的紫外可見(jiàn)光譜，兩個(gè)光譜在662nm有一個(gè)強(qiáng)的Q帶，并嚴(yán)格遵守朗伯-比爾定律，這表明這兩種偶聯(lián)物在DMF中的聚合效應(yīng)并不明顯。在610nm激發(fā)波長(zhǎng)下，這些偶聯(lián)物在687nm（11a）或689nm(11b)發(fā)射熒光，其熒光量子產(chǎn)率（F）為0.20，相對(duì)于未取代鋅（II)酞菁(ZnPc) (F = 0.28)35，這些化合物的熒光發(fā)射較弱，這歸因于兩個(gè)碘原子促進(jìn)了系間竄越并減少了通過(guò)熒

8、光發(fā)射弛豫的可能。36其電子吸收和熒光數(shù)據(jù)如表1所示。 為檢測(cè)這些化合物的光敏效率，我們?cè)贒MF中用1,3-二苯基異苯并呋喃(DPBF)作為單線態(tài)氧捕捉劑對(duì)它們的單線態(tài)氧量子產(chǎn)率進(jìn)行了研究。這個(gè)猝滅劑的光降解速率是通過(guò)監(jiān)控其在415nm波長(zhǎng)的吸光度隨時(shí)間的變化測(cè)定的。在圖S3中可以看到，這兩種偶聯(lián)物的單線態(tài)氧量子產(chǎn)率與常用參考物ZnPc是相當(dāng)?shù)摹?.3體外研究化合物11a和11b體外光動(dòng)力活性是以高表達(dá)葉酸受體(FR+)37的人類(lèi)鼻咽癌KB細(xì)胞和低表達(dá)葉酸受體(FR-)38的MCF-7細(xì)胞為受體研究的。其劑量-生存曲線如圖1所示。這兩種化合物在黑暗環(huán)境中基本沒(méi)有細(xì)胞毒性，而在光照下則都呈現(xiàn)出了

9、細(xì)胞毒性。11a的光細(xì)胞毒性強(qiáng)度（對(duì)KB細(xì)胞的IC50 = 0.06 M，對(duì)MCF-7 細(xì)胞的 IC50 = 2.56 M)和11b的光細(xì)胞毒性強(qiáng)度（對(duì)KB細(xì)胞的IC50 = 0.18 M，對(duì)MCF-7 細(xì)胞的 IC50 = 1.00 M)明顯隨細(xì)胞種類(lèi)而變，相比之下，光毒性更強(qiáng)的不含葉酸的BODIPY7b其差別較小（對(duì)KB細(xì)胞的IC50 = 0.02 M，對(duì)MCF-7 細(xì)胞的 IC50 = 0.06 M)。一般來(lái)說(shuō)，KB細(xì)胞較MCF-7細(xì)胞更易受光動(dòng)力作用影響。值得一提到的是，11a對(duì)這兩種癌細(xì)胞的光毒性強(qiáng)度的差別非常大，其對(duì)KB細(xì)胞的IC50值比MCF-7細(xì)胞低了43倍，而化合物11b只低

10、了6倍，7b只低了3倍。這些結(jié)果表明這兩個(gè)葉酸修飾的光敏劑11a和11b對(duì)FR+KB細(xì)胞展現(xiàn)了更高的親和力，其選擇性和光細(xì)胞毒性強(qiáng)度依賴(lài)與介于光敏劑和葉酸之間的乙二醇鏈的長(zhǎng)度，乙二醇鏈較短的偶聯(lián)物11a表現(xiàn)出對(duì)KB細(xì)胞更強(qiáng)的靶向性和更高的光細(xì)胞毒性。連接鏈對(duì)其他一些葉酸修飾的抗腫瘤藥劑的影響也被研究過(guò)。17,39,40例如Guaragna等人制備了兩種分別通過(guò)氨基乙基和偽-縮二氨酸連接葉酸的抗癌藥物苯丁酸氮芥，并用三種FR+和FR-白血病細(xì)胞株評(píng)估的它們的細(xì)胞特異性和細(xì)胞毒性。39結(jié)果表明，這兩種化合物對(duì)FR+細(xì)胞展現(xiàn)了高的特異性而且它們的抗腫瘤活性與未被修飾的苯丁酸氮芥相當(dāng)。相比之下，在一系

11、列的帶有二硝基苯基作為半抗原基團(tuán)的葉酸修飾的化合物中，它們的抗腫瘤活性和潛在致敏性的變化則取決于連接鏈，盡管它們對(duì)葉酸受體有相近的親和力。40對(duì)于Schneider等人報(bào)道的兩種葉酸-卟啉偶聯(lián)物，17發(fā)現(xiàn)連接鏈為乙二醇基的化合物比另一個(gè)連接鏈為烷基的化合物顯示出更強(qiáng)的光細(xì)胞毒性，它們的半抑制光劑量值相差三倍。我們的研究結(jié)果表明，對(duì)于葉酸偶聯(lián)物，即使性質(zhì)相同，連接鏈的不同長(zhǎng)度也會(huì)對(duì)其特異性和細(xì)胞毒性產(chǎn)生顯著的影響。為了進(jìn)一步揭示葉酸基團(tuán)的靶向作用，我們進(jìn)行了對(duì)照實(shí)驗(yàn)，將FR+KB細(xì)胞與11a（0.06M，即其IC50值）和游離葉酸（0.50M）共培養(yǎng)24h，然后進(jìn)行光動(dòng)力療法實(shí)驗(yàn)。發(fā)現(xiàn)細(xì)胞存活率

12、從50%上升至94%，這一結(jié)果清楚地表明增加游離葉酸會(huì)減少細(xì)胞對(duì)11a的攝取，從而降低它的光細(xì)胞毒性。為解釋11a和11b不同的光細(xì)胞毒性強(qiáng)度，我們通過(guò)紫外-可見(jiàn)光譜和熒光光譜研究了它們?cè)赗PMI瓊脂培養(yǎng)基中的聚合行為，如圖2所示，與11a的相比，11b的Q帶因吸收峰左肩增強(qiáng)而變寬，其熒光發(fā)射也稍微減弱。這表明在瓊脂培養(yǎng)基中11b較11a的聚合傾向稍大，也許是因?yàn)轭~外的三乙二醇鏈與鄰近的寡甘醇鏈產(chǎn)生了偶極-偶極相互作用。它們的光細(xì)胞毒性也可以通過(guò)熒光顯微鏡觀察KB細(xì)胞對(duì)它們的攝取來(lái)進(jìn)一步論述。這些細(xì)胞先與11a或11b一起培養(yǎng)24h，然后分別拍攝亮視場(chǎng)圖像和熒光圖像（圖3a）,從而得到細(xì)胞內(nèi)的

13、平均熒光強(qiáng)度（圖3b）?？梢?jiàn)11a的細(xì)胞內(nèi)熒光比11b強(qiáng)得多（大約3倍），這意味著更多的細(xì)胞攝取。因此，11a對(duì)KB細(xì)胞的更高的光細(xì)胞毒性可歸因于在生物環(huán)境中較高的細(xì)胞攝取率和較低的聚合傾向，從而提高單線態(tài)氧量子產(chǎn)率。8,9為了評(píng)估11a中葉酸基團(tuán)的靶向性質(zhì)，我們用FR+KB和FR-MCF-7細(xì)胞進(jìn)一步測(cè)定了其細(xì)胞攝取率。在于11a共培養(yǎng)24h后，KB細(xì)胞顯示出強(qiáng)的細(xì)胞內(nèi)熒光，而MCF-7細(xì)胞則明顯較弱（圖4a）。KB細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度是MCF-7細(xì)胞的5倍（圖4b）.這一結(jié)果表明11a中的葉酸基團(tuán)可以促進(jìn)聯(lián)苯乙烯BODIPY光敏劑進(jìn)入高表達(dá)葉酸受體的腫瘤細(xì)胞中。我們也研究了11a和11b在K

14、B細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位。這些細(xì)胞先與這兩個(gè)化合物一起培養(yǎng)24h，然后分別用Lyso-Tracker DND 26, Mito-Tracker Green FM, 和ER-Tracker Green (15 min)染色,這些染料分別是特異性的溶酶體、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的熒光染料。如圖5所示，11a產(chǎn)生的熒光與ER-Tracker產(chǎn)生的熒光相重疊，與Lyso-Tracker的熒光部分重疊，而與Mito-Tracker的熒光不重疊，這表明化合物11a對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有很高的親和力，也可以吸附到溶酶體上。而11b則傾向于積累在溶酶體上，部分在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。因此，連接鏈的長(zhǎng)度也影響該化合物的亞細(xì)胞定位。2.4結(jié)論我們制備

15、并表征了兩種葉酸-聯(lián)苯乙烯BODIPY化合物并研究了它們的體外光動(dòng)力活性。相比于FR-MCF-7細(xì)胞，兩種化合物都對(duì)FR+KB細(xì)胞表現(xiàn)出更高的光細(xì)胞毒性，尤其是11a，它對(duì)KB細(xì)胞的IC50比對(duì)MCF細(xì)胞低43倍。此外，連接聯(lián)苯乙烯BODIPY與葉酸的鏈的長(zhǎng)度也影響它們的聚合傾向、細(xì)胞攝取和亞細(xì)胞定位，從而導(dǎo)致不同的光細(xì)胞毒性效果。鏈更短的11a更為有效，對(duì)于靶向PDT是一個(gè)很有前途的光敏劑。3.實(shí)驗(yàn)部分一般來(lái)說(shuō)，所以反應(yīng)都是在氮?dú)鈿夥障逻M(jìn)行的。DMSO以氫化鈣減壓蒸餾，THF和甲苯則分別用鈉-二苯甲酮和鈉蒸餾。通過(guò)硅膠色譜柱（70-230目）和相應(yīng)洗脫液進(jìn)行純化，尺寸排阻色譜法則是用Bio-

16、Rad Bio-Beads S-X1beads(200-400目)以THF為洗脫液。所以其他溶劑和試劑都是試劑純級(jí)的并直接使用的?；衔?30，331和632按文獻(xiàn)方法制備。1H和13C1HNMR是在CDCl3中用Bruker AVANCE III 400光譜儀（1H，400，13C，100.6MHz）。核磁共振譜是用SiMe4作為標(biāo)準(zhǔn)物（1H, = 7.26，13C, = 77.2)。ESI質(zhì)譜是用Thermo Finnigan MAT 95 XL質(zhì)譜儀測(cè)量的。元素分析是由上海有機(jī)化學(xué)研究所做的。紫外-可見(jiàn)和穩(wěn)態(tài)熒光光譜分別是在Cary 5G UVvisNIR分光光度計(jì)和Hitachi F-

17、7000熒光光譜儀上測(cè)定的。樣品的熒光量子產(chǎn)量(F)是由方程F(sample) =(Fsample/Fref)(Aref/Asample)(n2sample/n2ref)F(ref)41計(jì)算的，ZnPc是在DMF中按文獻(xiàn)作為參考F(ref) = 0.28。35為減少背景物質(zhì)對(duì)輻射的吸收，發(fā)射光譜是在極稀溶液中獲得的，其吸光度在610nm約為0.04。反相高效液相色譜法是在Apollo-C18色譜柱 (5m,4.6毫米×250毫米)或XBridge-C18色譜柱(5m,10毫米×250毫米)上用日本島津公司CBM-20A控制器SPD-M20A二極管陣列作為檢測(cè)器進(jìn)行的。條件設(shè)

18、置為:溶劑A= 0.1%三氟乙酸(TFA)-蒸餾水;溶劑B =乙腈。凈化參數(shù)為：前7分鐘90% A + 10% B to 0% A + 100% B，然后在23分鐘內(nèi)改為0% A + 100% B并保持3分鐘，然后在2分鐘內(nèi)改為90% + 10%,最后保持在這個(gè)條件5分鐘。流量固定在4.0毫升每分鐘。分析參數(shù)如下：90% A + 10% B 在35分鐘內(nèi)變?yōu)?0% A + 100% B并保持15分鐘，然后在兩分鐘內(nèi)改為90% A + 10% B并保持3分鐘。流量固定在0.8毫升每分鐘。 1,3,5,7-四甲基-8-（4-炔丙氧苯基）-氟硼二吡咯（4a）：將BODIPY1(0.50 g, 1.4

19、7 mmol),溴丙炔(2) (0.87 g, 7.35 mmol),K2CO3 (1.02 g, 7.38 mmol)混合于丙酮（30ml）中加熱回流7h。然后抽真空除去揮發(fā)物。殘留物與水（100ml）混合，然后用CH2Cl2（50ml*3）萃取。有機(jī)相合并后用Na2SO4干燥并減壓蒸干。用硅膠柱層析純化，以己烷-CHCl3(3:2,v / v)作為洗脫液，得到橙色固體(0.51克,91%)。1H NMR (CDCl3): 7.20 (d, J = 8.8 Hz, 2 H,ArH), 7.09 (d, J = 8.8 Hz, 2 H, ArH), 5.98 (s, 2 H, pyrrole-

20、H), 4.76(d, J = 2.4 Hz, 2 H, CH2), 2.56 (s, 7 H, CH3 and CH), 1.42 (s, 6 H,CH3). 13C1H NMR (CDCl3): 158.2, 155.5, 143.2, 141.6, 131.9,129.3, 128.1, 121.3, 115.7, 78.1, 76.0, 56.1, 14.7. MS (ESI): m/z 401M + Na+ (100%). HRMS (ESI): m/z calcd for C22H21BF2N2NaOM + Na+ 401.1607, found 401.1614. Anal. C

21、alcd for C22H21BF2N2O:C, 69.86; H, 5.60; N, 7.41. Found: C, 69.72; H, 5.46; N, 7.42.1,3,5,7-四甲基-8-（4-（3,6,9-三氧-9-炔丙基-壬基）苯基）-氟硼二吡咯（4b）：如4a步驟，將BODIPY 1(0.15 g, 0.44 mmol)、炔基甲苯磺酸鹽3 (0.30 g, 0.88 mmol) 和 K2CO3 (0.18 g, 1.32 mmol) 在丙酮中反應(yīng)的4b，由硅膠柱層析純化，以己烷/乙酸乙酯(3:2,v / v)作為洗脫液。得到橙色粘性固體(0.14克,63%)。1H NMR (CD

22、Cl3): 7.14 (d, J = 8.8 Hz, 2 H, ArH),7.01 (d, J = 8.8 Hz, 2 H, ArH), 5.96 (s, 2 H, pyrrole-H), 4.20 (d, J =2.4 Hz, 2 H, CH2), 4.17 (t, J = 4.4 Hz, 2 H, CH2), 3.90 (t, J = 4.4 Hz, 2H, CH2), 3.753.77 (m, 2 H, CH2), 3.693.73 (m, 6 H, CH2), 2.54(s, 6 H, CH3), 2.42 (t, J = 2.4 Hz, 1 H, CH), 1.41 (s, 6 H,

23、 CH3).13C1H NMR (CDCl3): 159.3, 155.1, 143.1, 141.8, 131.7, 129.0,127.0, 121.0, 115.1, 79.6, 74.6, 70.7, 70.5, 70.3, 69.6, 69.0, 67.4, 58.3,14.5, 14.4. MS (ESI): m/z 533 M + Na+ (100%). HRMS (ESI): m/zcalcd for C28H33BF2N2NaO4 M + Na+ 533.2399, found 533.2391.Anal. Calcd for C28H33BF2N2O4: C, 65.89;

24、 H, 6.52; N, 5.49. Found: C,65.59; H, 6.54; N, 5.45.1,3,5,7-四甲基-8-（4-炔丙氧苯基）-2,6-二碘氟硼二吡咯（5a）：將碘酸(0.47 g, 2.64 mmol)溶于少量水中后與BODIPY 4a (0.50 g, 1.32 mmol)和碘(0.84 g, 3.31 mmol)一起加入乙醇（40ml）中。50加熱2h。冷卻后，減壓蒸餾，油狀產(chǎn)物用硅膠柱純化，洗脫液為己烷/ CHCl3(3:2,v / v)，得到明亮的紅色固體(0.64克,77%)。1H NMR (CDCl3): 7.17 (d,J = 8.8 Hz, 2 H,

25、ArH), 7.12 (d, J = 8.8 Hz, 2 H, ArH), 4.78 (d, J = 2.4Hz, 2 H, CH2), 2.64 (s, 6 H, CH3), 2.57 (t, J = 2.4 Hz, 1 H, CH), 1.44(s, 6 H, CH3). 13C1H NMR (CDCl3): 158.6, 156.8, 145.5, 141.3,131.8, 129.2, 127.7, 116.1, 85.8, 78.0, 76.2, 56.2, 17.3, 16.2. MS (ESI):m/z 630 M+ (48%) and 611 M F+ (70%). HRMS

26、(ESI): m/zcalcd for C22H19BF2I2N2O M+ 629.9646, found 629.9650. Anal.Calcd for C22H19BF2I2N2O: C, 41.94; H, 3.04; N, 4.45. Found: C,41.70; H, 3.01; N, 4.45. 1,3,5,7-四甲基-8-（4-（3,6,9-三氧-9-炔丙基-壬基）苯基）-2,6-二碘氟硼二吡咯（5b）：與5a相同，將BODIPY 4b(0.40 g, 0.78 mmol) 與碘酸(0.28 g, 1.57 mmol)和碘 (0.50 g, 1.96 mmol) 加入 EtO

27、H (50 mL)中得到5b，用硅膠柱分離，以CH2Cl2/CHCl3 (1:1, v/v)洗脫得到紅色粘性固體(0.48 g, 80%). 1H NMR (CDCl3): 7.12 (d, J = 8.8 Hz, 2H, ArH), 7.04 (d, J = 8.8 Hz, 2 H, ArH), 4.21 (d, J = 2.4 Hz, 2 H,CH2), 4.20 (t, J = 4.8 Hz, 2 H, CH2), 3.92 (t, J = 4.8 Hz, 2 H, CH2),3.763.79 (m, 2 H, CH2), 3.713.73 (m, 6 H, CH2), 2.64 (s,

28、 6 H,CH3), 2.43 (t, J = 2.4 Hz, 1 H, CH), 1.43 (s, 6 H, CH3). 13C1HNMR (CDCl3): 159.7, 156.4, 145.3, 141.5, 131.6, 128.9, 126.6,115.4, 85.6, 79.6, 74.7, 70.8, 70.5, 70.4, 69.6, 69.0, 67.5, 58.3, 17.2,16.0. MS (ESI): m/z 785M + Na+ (100%). HRMS (ESI): m/z calcdfor C28H31BF2I2N2NaO4 M + Na+ 785.0343,

29、found 785.0343. Anal.Calcd for C28H31BF2I2N2O4: C, 44.12; H, 4.10; N, 3.68. Found: C,44.08; H, 4.10; N, 3.69.1,7-二甲基-3,5-二（4-（3,6,9-三氧代奎氧基）苯乙烯基）-8-（4-炔丙氧苯基）-2,6-二碘氟硼二吡咯（7a）：將5a (0.45 g, 0.71 mmol)，取代苯甲醛6(0.46 g, 1.71 mmol),冰醋酸(2.0 mL, 34.9 mmol),哌啶 (2.4 mL, 24.3 mmol)和少量Mg(ClO4)2 加入甲苯(60 mL)中加熱回流過(guò)夜。

30、反應(yīng)過(guò)程中生成的水由分水器除去?；旌弦航?jīng)減壓蒸餾后用硅膠柱分離，洗脫液為CH2Cl2/甲醇(100:1,v / v).收集綠色帶并旋蒸干，然后由尺寸排阻層析進(jìn)一步純化，使用Bio-beads S-X1beads，四氫呋喃作為洗脫液。油狀產(chǎn)物再用硅膠柱以CH2Cl2/甲醇(100:1,v / v)洗脫，得到深綠色固體(0.20克,25%)。1H NMR (CDCl3): 8.13 (d,J = 16.8 Hz, 2 H, CCH), 7.60 (d, J = 8.8 Hz, 4 H, ArH), 7.58 (d, J =16.8 Hz, 2 H, CCH), 7.20 (d, J = 8.8 H

31、z, 2 H, ArH), 7.13 (d, J = 8.8Hz, 2 H, ArH), 6.96 (d, J = 8.8 Hz, 4 H, ArH), 4.79 (d, J = 2.4 Hz, 2H, CH2), 4.19 (t, J = 4.8 Hz, 4 H, CH2), 3.89 (t, J = 4.8 Hz, 4 H,CH2), 3.753.78 (m, 4 H, CH2), 3.663.72 (m, 8 H, CH2), 3.553.58(m, 4 H, CH2), 3.39 (s, 6 H, CH3), 2.58 (t, J = 2.4 Hz, 1 H, CH), 1.50(s,

32、 6 H, CH3). 13C1H NMR (CDCl3): 160.0, 158.5, 150.5, 145.8,139.2, 138.3, 133.3, 129.8, 129.3, 128.3, 116.8, 116.0, 115.1, 82.8, 78.0,76.2, 72.0, 71.0, 70.8, 70.7, 69.8, 67.6, 59.2, 56.2, 17.8 (some of thesignals are overlapped). MS (ESI): m/z 1153 M + Na+ (55%).HRMS (ESI): m/z calcd for C50H55BF2I2N2

33、NaO9 M + Na+1153.1959, found 1153.1970. Anal. Calcd for C50H55BF2I2N2O9: C,53.12; H, 4.90; N, 2.48. Found: C, 52.73; H, 4.88; N, 2.50.1 ,7-二甲基-3,5-二（4-（3,6,9-三氧代奎氧基）苯乙烯基）-8-（4-（3,6,9-三氧-9-炔丙基-壬基）苯基）-2,6-二碘氟硼二吡咯（7b）：如7a所述，BODIPY 5b (0.20 g, 0.26 mmol)與取代苯甲醛6 (0.17 g, 0.63 mmol)，冰醋酸(1.0 mL, 17.5 mmol)

34、,哌啶(1.2 mL, 12.1 mmol)和少量Mg(ClO4)2 加入甲苯 (50 mL)中反應(yīng)得到7b，純化方法同上，得到深綠色固體(0.13克,40%)。1H NMR (CDCl3): 8.12 (d, J = 16.8 Hz, 2 H, CCH), 7.59 (d, J = 8.8 Hz, 4 H, ArH),7.58 (d, J = 16.8 Hz, 2 H, CCH), 7.15 (d, J = 8.8 Hz, 2 H, ArH),7.05 (d, J = 8.8 Hz, 2 H, ArH), 6.96 (d, J = 8.8 Hz, 4 H, ArH), 4.22 (d,J =

35、 2.4 Hz, 2 H, CH2), 4.174.21 (m, 6 H, CH2), 3.92 (vt, J = 4.8 Hz,2 H, CH2), 3.89 (vt, J = 4.8 Hz, 4 H, CH2), 3.653.79 (m, 20 H,CH2), 3.553.57 (m, 4 H, CH2), 3.38 (s, 6 H, CH3), 2.44 (t, J =2.4 Hz, 1 H, CH), 1.49 (s, 6 H, CH3). 13C1H NMR (CDCl3): 160.0, 159.8, 150.4, 145.8, 139.1, 138.7, 133.3, 129.8

36、, 129.7, 129.3,127.5, 116.9, 115.6, 115.1, 82.7, 79.7, 77.4, 74.7, 72.0, 71.0, 70.7, 70.6,69.8, 69.2, 67.7, 67.6, 59.1, 58.5, 17.8 (some of the signals areoverlapped). MS (ESI): m/z 1285 M + Na+ (100%). HRMS (ESI):m/z calcd for C56H67BF2I2N2NaO12 M + Na+ 1285.2746, found1285.2732. Anal. Calcd for C5

37、6H67BF2I2N2O12: C, 53.27; H, 5.35; N,2.22. Found: C, 53.16; H, 5.26; N, 2.25. 葉酸-二苯乙烯BODIPY11b：如11a所述，BODIPY7b(30.0 mg, 23.8 mol)和疊氮葉酸10 (21.3 mg, 35.6 mol), CuSO4·5H2O(0.9 mg, 3.6 mol)以及抗壞血酸鈉(1.4 mg, 7.1 mol)于DMSO和水(15:1, v/v, 1.6 mL)中反應(yīng)得到11b(12 mg,27%). MS (ESI): m/z 1883 M + Na+ (100%). HRMS

38、 (ESI): m/zcalcd for C81H98BF2I2N13NaO19 M + Na+ 1882.5157, found1882.5101. 經(jīng)HPLC分析其純度為97%。細(xì)胞株和培養(yǎng)條件：KB(ATCC, no. CCL-17)和 MCF-7 (ATCC, no. HTB-22)細(xì)胞保養(yǎng)在RPMI1640(表達(dá)載體，no.23400-021)和小牛血清（10%），青霉素-鏈霉素(100 units mL1 和100 g mL1)中,在一個(gè)96-多孔盤(pán)上每孔1*104（KB）或2*104（MCF-7）細(xì)胞在含5%CO2濕潤(rùn)氣氛中37孵化一夜。光細(xì)胞毒性檢驗(yàn)：化合物11a和11b溶于D

39、MF制得1.9mM溶液，然后用吐溫80稀釋到80M.，再以游離葉酸RPMI1640（表達(dá)載體，no. 27016-021)稀釋到各種濃度。吐溫80溶液和培養(yǎng)基在有光和無(wú)光下均無(wú)細(xì)胞毒性。細(xì)胞用磷酸緩沖液（PBS）沖洗后，與100L這些二苯乙烯BODIPY溶液在375%CO2下培養(yǎng)24h。在室溫光照前再用PBS沖洗，再加入100L培養(yǎng)液。光源系統(tǒng)由300W鹵素?zé)?，冷卻水箱和一個(gè)610nm濾色玻璃（Newport）組成。光照強(qiáng)度( > 610 nm) 為40 mW cm2，20分鐘總照明量為48 J cm2，光照后，細(xì)胞在375%CO2中培養(yǎng)過(guò)夜。細(xì)胞存活率是由MTT法測(cè)定的。42將MTT(

40、USB)的PBS(3 mg mL1, 50 L)溶液加入每個(gè)孔中，在相同環(huán)境中37下培養(yǎng)3h。然后每孔加入十二烷基硫酸鈉溶液(USB,10%按重量計(jì), 50 L)。將板置于烤箱6030分鐘，然后各孔加入80L異丙醇。多孔板在Bio-Rad酶標(biāo)儀上室溫振蕩10s后測(cè)量每孔在540nm的吸光度。空白孔的平均吸光度是由其他孔的讀數(shù)相減得到的。細(xì)胞存活率就可以由以下方程得到：%存活率= (Ai/Acontrol) × 100/n,Ai是第i個(gè)井的吸光度，Acontrol是不含BODIPY孔的平均吸光度。顯微熒光研究：在蓋玻片上涂上2*105的KB或MCF-7細(xì)胞于培養(yǎng)基中，375%CO2中培

41、養(yǎng)過(guò)夜。取出后經(jīng)PBS沖洗后，在11a和游離葉酸培養(yǎng)基(5.0 M, 2 mL)中培養(yǎng)24h，然后用PBS沖洗細(xì)胞，并用Olympus IX 70倒置顯微鏡觀察。激發(fā)波長(zhǎng)610nm是由多波照明燈(Polychrome IV, TILL Photonics)發(fā)射。發(fā)射的熒光是用MetaFluor V 6.3(通用成像)測(cè)定分析的，并可得到平均細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度(每個(gè)樣本共計(jì)24為細(xì)胞)。對(duì)于11a和11b的細(xì)胞攝取研究，在于11a或11b和葉酸培養(yǎng)基(1.0 M, 2 mL)中培養(yǎng)24h后，用PBS沖洗細(xì)胞，用帶有633nm氦氖激光器的Leica SP5聚焦顯微鏡觀察。檢測(cè)650-750nm的熒光，

42、圖像用Leica熒光分析軟件數(shù)據(jù)化分析。便可得到平均細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度(每個(gè)樣本總計(jì)50細(xì)胞)。亞細(xì)胞定位研究：在蓋玻片上涂上2*105的KB或MCF-7細(xì)胞于培養(yǎng)基中，375%CO2中培養(yǎng)過(guò)夜。取出后經(jīng)PBS沖洗后，在11a或11b和游離葉酸培養(yǎng)基(1.0 M, 2 mL)中培養(yǎng)24h。在用Lyso-Tracker的研究中，細(xì)胞與Lyso-Tracker Green DND 26（分子探針，培養(yǎng)基中含量：4.0M）再培養(yǎng)15分鐘。對(duì)用Mito-Tracker 和ER-Tracker的研究中，細(xì)胞與Mito-Tracker Green FM（分子探針，培養(yǎng)基中含量：0.2M）或ER-Tracker

43、 Green（分子探針，PBS中含量：1.0M）再培養(yǎng)15分鐘。所有這些細(xì)胞都用PBS沖洗并以配備488nm和633nm激光燈的Leica SP5共焦顯微鏡觀察。所有顯色劑都被633nm波激發(fā)，并在650-800nm發(fā)射熒光。圖像用Leica熒光分析軟件數(shù)據(jù)化分析。11a和11b的亞細(xì)胞定位是通過(guò)分析該染料和Lyso-Tracker, Mito-Tracker,或ER-Tracker顯色劑的細(xì)胞內(nèi)熒光圖像得出的。4.相關(guān)內(nèi)容4.1輔助信息10，11a，11b的高效液相色譜圖，11a，11b在DMF中的紫外可見(jiàn)色譜圖，ZnPc，11a，11b在DMF中對(duì)DPBF的光降解速率比較，以及4a,4b,

44、5a,5b，7a,7b在CDCl3中的1H、13CNMR。這些材料可通過(guò)互聯(lián)網(wǎng)免費(fèi)獲取：.4.2作者信息相關(guān)作者* D.K.P.N.: phone, +852-3943-6375; fax, +852-2603-5057;e-mail, .hk.* P.-C.L.: phone, +852-3943-1375; fax, +852-3943-1326;e-mail, .hk.注：作者聲明沒(méi)有經(jīng)濟(jì)利益競(jìng)爭(zhēng)。4.3致謝本工作由中國(guó)香港中文大學(xué)資助(2009/10- 2010/11)。4.4使用的縮略短語(yǔ)BODIPY

45、, 氟硼二吡咯; DCC, N,N-二環(huán)己基碳二亞胺;DMF, N,N-二甲基甲酰胺; DMSO, 二甲亞砜;DPBF, 1,3-二苯基異苯并呋喃; ESI,電噴霧電離; PBS, 磷酸鹽緩沖液; PDT, 光動(dòng)力療法; TFA, 三氟乙酸; THF,四氫呋喃; ZnPc, 鋅酞菁; F, 熒光量子產(chǎn)率。5.參考文獻(xiàn)(1) Garland, M. J.; Cassidy, C. M.; Woolfson, D.; Donnelly, R. F.Designing photosensitizers for photodynamic therapy: strategies,challenges a

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