RACE技術(shù)的原理和操作

1、RACE技術(shù)的原理和操作近年來(lái)隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，出現(xiàn)了許多克隆新基因的方法和手段，如圖譜克隆技術(shù)、轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽技術(shù)、mRNA差異顯示技術(shù)二基因組減法技術(shù)以及cDNA文庫(kù)篩選技術(shù)等。但上述方法人多具有實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)、技術(shù)步驟煩瑣且工作量大等特點(diǎn)。cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)（rapid amplification of cDNA ends，RACE）是一種基于PCR從低豐度的轉(zhuǎn)錄本中快速擴(kuò)增cDNA的5'和3'末端的有效方法，以其簡(jiǎn)單、快速、廉價(jià)等優(yōu)勢(shì)而受到越來(lái)越多的重視。經(jīng)典的RACE技術(shù)是由Frohman等（1988）發(fā)明的一項(xiàng)技術(shù)，主要通過(guò)RT-PCR技術(shù)由已知部分cDNA序列

2、來(lái)得到完整的cDNA5'和3'端，包括單邊PCR和錨定PCR。該技術(shù)提出以來(lái)經(jīng)過(guò)不斷發(fā)展和完善，克服了早期技術(shù)步驟多、時(shí)間長(zhǎng)、特異性差的缺點(diǎn)（Frohman等，1995：Schaefer，l995： Chen，1998： Bespalova等，1998： Matz等11999）。對(duì)傳統(tǒng)RACE技術(shù)的改進(jìn)主要是引物設(shè)計(jì)及RT-PCR技術(shù)的改進(jìn)：改進(jìn)之一是利用鎖定引物（lock docking primer）合成第一鏈cDNA，即在oligo（dT）引物的3' 端引入兩個(gè)簡(jiǎn)并的核苷酸【5'-Oligo（dT）16-30MN-3'，M=A/G/C；N=A/G/

3、C/T】，使引物定位在poly（A）尾的起始點(diǎn)，從而消除了在合成第一條cDNA鏈時(shí)oligo（dT）與poly（A）尾的任何部位的結(jié)合所帶來(lái)的影響；改進(jìn)之二是在5' 端加尾時(shí)，采用poly（C），而不是poly（A）；改進(jìn)之三是采用RNase H-莫洛尼氏鼠白血。病毒（MMLV）反轉(zhuǎn)錄酶或選擇嗜熱DNA聚合酶可能在高溫（60 -70）有效地逆轉(zhuǎn)錄mRNA，從而消除了5'端由于高CC含量導(dǎo)致的mRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)逆轉(zhuǎn)錄的影響；改進(jìn)之四是采用熱啟動(dòng)PCR （hot start PCR）技術(shù)和降落PCR（touch down PCR）提高PCR反應(yīng)的特異性。隨著RACE技術(shù)日益完善，

4、目前己有商業(yè)化RACE技術(shù)產(chǎn)品推出，如CLONTECH的MarathoTM技術(shù)和SMARTTM RACE技術(shù)。邢桂春等（2001）先后使用上述兩種試劑盒進(jìn)行RACE反應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用MarathonTM所得到的片斷總是比采用SMARTTM RACE試劑盒到所得到的片斷短。其原因在于MarathonTM技術(shù)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)往往不能真正達(dá)到mRNA的5' 末端。所以認(rèn)為，進(jìn)行RACE反應(yīng)應(yīng)當(dāng)優(yōu)選SMARTTM RACE試劑盒。以下就國(guó)內(nèi)目前應(yīng)用最廣的SMARTTM RACE試劑盒為例，簡(jiǎn)要概述RACE技術(shù)的原理和操作過(guò)程。SMARTTM 3'-RACE的原理利用mRNA的3'末端

5、的poly（A）尾巴作為一個(gè)引物結(jié)合位點(diǎn)，以連有SMART寡核營(yíng)酸序列通用接頭引物的Oligo（dT）30MN作為鎖定引物反轉(zhuǎn)錄合成標(biāo)準(zhǔn)第一鏈cDNA.然后用一個(gè)基因特異引物GSP1（gene specific primer，GSP）作為上游引物，用一個(gè)含有部分接頭序列的通用引物UPM（universal primer，UPM）作為下游引物，以cDNA第一鏈為模板，進(jìn)行PCR循環(huán)，把目的基因3' 末端的DNA片段擴(kuò)增出來(lái)。（見(jiàn)Figure 1）Figure 1.SMARTTM 5'-RACE的原理先利用mRNA的3'末端的poly（A）尾巴作為一個(gè)引物結(jié)合位點(diǎn)，以O(shè)li

6、go（dT）30MN作為鎖定引物在反轉(zhuǎn)錄酶MMLV作用下，反轉(zhuǎn)錄合成標(biāo)準(zhǔn)第一鏈cDNA.利用該反轉(zhuǎn)錄酶具有的末端轉(zhuǎn)移酶活性，在反轉(zhuǎn)錄達(dá)到第一鏈的5'末端時(shí)自動(dòng)加上3-5個(gè)（dC）殘基，退火后（dC）殘基與含有SMART寡核苷酸序列Oliogo（dG）通用接頭引物配對(duì)后，轉(zhuǎn)換為以SMART序列為模板繼續(xù)延伸而連上通用接頭（見(jiàn)Figure 2 ）。然后用一個(gè)含有部分接頭序列的通用引物UPM（universal primer，UPM）作為上游引物，用一個(gè)基因特異引物2（GSP 2 genespecific primer，GSP）作為下游引物，以SMART第一鏈cDNA為模板，進(jìn)行PCR循環(huán)，

7、把目的基因5'末端的cDNA片段擴(kuò)增出來(lái)。最終，從2個(gè)有相互重疊序列的3'/ 5'-RACE產(chǎn)物中獲得全長(zhǎng)cDNA，或者通過(guò)分析RACE產(chǎn)物的3'和5'端序列，合成相應(yīng)引物擴(kuò)增出全長(zhǎng)cDNA。Figure 2.實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，做RACE反應(yīng)實(shí)驗(yàn)實(shí)際操作中仍存在不少困難。因此，對(duì)RACE反應(yīng)條件進(jìn)行反復(fù)摸索是十分必要的。這是因?yàn)椋旱谝?，?'-RACE包含了有3個(gè)連續(xù)的酶反應(yīng)步驟（反轉(zhuǎn)錄、同聚物加尾和PCR擴(kuò)增），每一步都可能導(dǎo)致失敗；第二，擴(kuò)增DNA末端的特異性完全依賴(lài)錨定引物及擴(kuò)增DNA模板樣品的不均一性，因而特異性一般很低，常呈現(xiàn)不清晰的成片條帶或截短的產(chǎn)物背景。因此，使用RACE技術(shù)擴(kuò)增得到的特異末端片段，所獲得的重組克隆最好能夠全部測(cè)序，以排除RACE實(shí)驗(yàn)結(jié)果中擴(kuò)增產(chǎn)物假陽(yáng)性和假陰性，最終有可能獲得新基因的全序列。隨著RACE的不斷改進(jìn)和完善，優(yōu)化條件下PCR擴(kuò)增效率和忠實(shí)性的提高及PCR產(chǎn)物克隆技術(shù)的迅速發(fā)展，RACE必將在基因克隆及基因表達(dá)研究中發(fā)揮越來(lái)越大的作用。RACE的另一種代表方法-Self-L