RT-PCR原理與實(shí)驗(yàn)操作步驟講解(共16頁(yè))

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上RT-PCR原理與實(shí)驗(yàn)操作步驟關(guān)鍵詞：RT-PCR 逆轉(zhuǎn)錄酶 reversetranscriptase 聚合酶 鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 引物設(shè)計(jì) DNA 聚合酶一、知識(shí)背景：1、基因表達(dá)：DNA RNA Protein單拷貝基因表達(dá)存在逐步放大機(jī)制，如一個(gè)蠶絲心蛋白基因 104個(gè)絲心蛋白mRNA（每個(gè)mRNA存活4d，可以合成105個(gè)絲心蛋白） 共合成109個(gè)絲心蛋白。因此單拷貝基因的mRNA表達(dá)水平對(duì)于其功能水平的調(diào)控是非常重要的。2、PCR技術(shù)(olymerase chain reaction)：即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。在模板、引物和四種脫氧核苷酸存在的條件下依賴于DNA聚合酶的酶促

2、反應(yīng)，其特異性由兩個(gè)人工合成的引物序列決定。反應(yīng)分三步：A、變性：通過(guò)加熱使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，形成單鏈DNA；B、退火：將反應(yīng)混合液冷卻至某一溫度，使引物與模板結(jié)合。C、延伸：在DNA聚合酶和dNTPs及Mg2存在下，退火引物沿5' 3'方向延伸。以上三步為一個(gè)循環(huán)，如此反復(fù)。3、逆轉(zhuǎn)錄酶和RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄酶（reverse transcriptase）是存在于RNA病毒體內(nèi)的依賴RNA的DNA聚合酶，至少具有以下三種活性：1、依賴RNA的DNA聚合酶活性：以RNA為模板合成cDNA第一條鏈；2、Rnase水解活性：水解RNANA雜合體中的RNA；3、依賴DNA的DNA

3、聚合酶活性：以第一條DNA鏈為模板合成互補(bǔ)的雙鏈cDNA.二、RT-PCR的準(zhǔn)備：1、引物的設(shè)計(jì)及其原則：1）引物的特異性決定PCR反應(yīng)特異性。因此引物設(shè)計(jì)是否合理對(duì)于整個(gè)實(shí)驗(yàn)有著至關(guān)重要的影響。在引物設(shè)計(jì)時(shí)要充分考慮到可能存在的同源序列，同種蛋白的不同亞型，不同的mRNA剪切方式以及可能存在的hnRNA對(duì)引物的特異性的影響。盡量選擇覆蓋相連兩個(gè)內(nèi)含子的引物，或者在目的蛋白表達(dá)過(guò)程中特異存在而在其他亞型中不存在的內(nèi)含子。2）引物設(shè)計(jì)原則的把握：引物設(shè)計(jì)原則包括a、引物長(zhǎng)度:一般為1530bp ，引物太短會(huì)影響PCR的特異性，引物太長(zhǎng)PCR的最適延伸溫度會(huì)超過(guò)Taq酶的最適溫度，也影響反應(yīng)的特異

4、性。b、堿基分布：四種堿基最好應(yīng)隨機(jī)分布，避免嘌呤或嘧啶的聚集存在，特別是連續(xù)出現(xiàn)3個(gè)以上的單一堿基。GC含量（Tm值）：4060，PCR擴(kuò)增的復(fù)性溫度一般是較低Tm值減去510度。c、 3'端要求：3'端必須與模板嚴(yán)格互補(bǔ)，不能進(jìn)行任何修飾，也不能有形成任何二級(jí)結(jié)構(gòu)的可能。末位堿基是A時(shí)錯(cuò)配的引發(fā)效率最低，G、C居中間，因此引物的3'端最好選用A、G、C而盡可能避免連續(xù)出現(xiàn)兩個(gè)以上的T。d、引物自身二級(jí)結(jié)構(gòu)：引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，否則會(huì)自身折疊成發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)或引物自身復(fù)性。e、引物之間的二級(jí)結(jié)構(gòu)：兩引物之間不應(yīng)有多于4個(gè)連續(xù)堿基互補(bǔ)，3'端不應(yīng)超過(guò)2個(gè)。f、

5、同源序列：引物與非特異擴(kuò)增序列的同源性應(yīng)小于連續(xù)8個(gè)的互補(bǔ)堿基存在。g、5'端無(wú)嚴(yán)格限制：5'末端堿基可以游離，但最好是G或C，使PCR產(chǎn)物的末端結(jié)合穩(wěn)定。還可以進(jìn)行特異修飾（標(biāo)記、酶切位點(diǎn)等）等等。根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇適當(dāng)?shù)囊?。常用引物設(shè)計(jì)軟件如Primer5.0，Oligo6.0等對(duì)于這些條件都可以自行設(shè)置。2、耗材：實(shí)驗(yàn)所用的接觸樣品的耗材如凍存管、槍頭、EP管之類事先都需經(jīng)過(guò)0.1%DEPC水浸泡處理，除去RNA酶，防止操作過(guò)程中RNA降解。然后經(jīng)高壓滅活（滅菌和滅活DEPC）。3、試劑準(zhǔn)備：變性液、水飽和酚、乙酸鈉、氯仿、異丙醇、75%酒精、經(jīng)DEPC處理并高壓的水。三

6、、RNA的提取方法：RTPCR中從細(xì)胞分離的RNA的質(zhì)量至關(guān)重要，包括RNA的純度和完整性。RNA分離的最關(guān)鍵因素是盡量減少RNA酶的污染。但RNA酶活 性非常穩(wěn)定，分布廣泛，除細(xì)胞內(nèi)源性RNA酶外，環(huán)境中也存在大量RNA酶。因此在提取RNA時(shí)，應(yīng)盡量創(chuàng)造一個(gè)無(wú)RNA酶的環(huán)境，包括去除外源性RNA 酶污染和抑制內(nèi)源性RNA酶活性，主要是采用焦碳酸二乙酯（DEPC）去除外源性RNA酶，通過(guò)RNA酶的阻抑蛋白R(shí)nasin和強(qiáng)力的蛋白質(zhì)變性劑如異 硫氰酸胍抑制內(nèi)源性RNA酶。實(shí)驗(yàn)操作步驟一、實(shí)驗(yàn)器具與材料：1、移液槍：1ml、200l、20l、10l、2l2、吸頭：1ml、200l、20l3、勻漿管

7、：5ml4、吸頭臺(tái)：放置1ml吸頭的一個(gè)，放置20l吸頭的一個(gè)5、EP管：1.5ml、0.2ml、100l6、試劑瓶：2個(gè)60ml的棕色試劑瓶（廣口，帶蓋）1個(gè)125ml的白色試劑瓶（放無(wú)水乙醇）7、量筒：50ml、250ml、500ml8、容量瓶：250ml、500ml、1000ml9、試管架：5ml、1.5ml、20l10、鹽水瓶：250ml、500ml各2個(gè)備用，一個(gè)裝無(wú)水乙醇，另一個(gè)裝DEPC水11、鋁制飯盒：4個(gè)12、塑料小飯盒：1個(gè)13、大瓷缸：2個(gè)RT-PCR原理與實(shí)驗(yàn)操作步驟14、錫泊紙：一卷15、卷紙：2卷16、三角燒瓶：帶蓋，稍大二、實(shí)驗(yàn)器具的處理與準(zhǔn)備1、塑料制品：（包括

8、槍頭、EP管、勻漿管等）先將DEPC水從容量瓶中倒入瓷缸中，將塑料制品逐個(gè)浸泡其中，其中小槍頭需要吸管打入DEPC水，過(guò)夜，然后高壓，再烤干備用，實(shí)驗(yàn)前將槍頭等放入吸頭臺(tái)，再高壓一次（EP管）2、玻璃制品：泡酸過(guò)夜，沖洗干凈，蒙錫紙烤干備用（DEPC水泡）（洗凈后先泡1DEPC過(guò)夜，再烤干）3、勻漿器：（包括剪刀、鑷子）先洗凈后，再高壓（不需要泡DEPC）三、試劑配制：1、DEPC水：吸出1ml放在1000ml雙蒸水中配成1DEPC水，放在1000ml容量瓶中靜置4小時(shí)備用。2、75%乙醇：用無(wú)水乙醇 DEPC水配，然后放-20保存（其中DEPC水需先高壓）3、異丙醇：放入棕色瓶中4、氯仿：放

9、入棕色瓶中5、瓊脂糖四、幾種緩沖液的配制：1、電泳緩沖液：Tris 54g硼酸 27.5g0.5M EDTA 20ml？ pH8.0蒸溜水 1000ml5×TBE （貯存液）再將5×TBE稀釋10倍成0.5TBE就可以在電泳時(shí)使用（即工作液濃度），如取50ml貯存液 450ml水-500ml工作緩沖液2、上樣緩沖液：0.25%溴酚藍(lán)0.25%二甲苯青FFRT-PCR原理與實(shí)驗(yàn)操作步驟30%甘油6×緩沖液，4保存五、瓊脂糖凝膠的配制：1、1.0%：1.0g瓊脂糖 100ml電泳緩沖液，微波爐中火30秒至沸騰，熔化的瓊脂物冷卻至60時(shí)加入10mg/ml溴化乙錠2.5l

10、，充分混勻，將溫?zé)岬哪z倒入已置好梳子的膠膜中，在室溫下放置30-45min后現(xiàn)進(jìn)行電泳。2、1.5%:同上，將瓊脂糖的量改為1.5g六、需購(gòu)置的RT-PCR材料：（生工. Tel. .）Taq酶（含MgCl2 Buffer） 200u 70.00dNTP: 1支Oligo(dT)15: 1 OD 40.00 promegaM-MLV: 1支 250.00 promega (Buffer)RNasin: 1支 110- -20DEPC 5g 110.00Trizol 100ml/1瓶 Invitrogen Life technologies- 4Marker: 10g 0.2g/ml 150.

11、00 科威（1543. 994. 697. 515. 377. 231）七、引物合成正義：5-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3反義：5-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-32、par-4:正義：5-GGGACCTCGGAACTCAAC-3反義：5-TGTATCTGCCTGGGACTG-3RT-PCR原理與實(shí)驗(yàn)操作步驟3、退火溫度計(jì)算2（A T） 4（G C）正反義平均數(shù)，再上下波動(dòng)度（±4，或±5）4、引物各合成5 OD，每OD一瓶分裝好5、引物稀釋：加DEPC水量為（l）= ? nmol / OD × 管上所標(biāo)OD數(shù)×

12、;100是為10p mol / l 濃度的引物溶液八、PCR產(chǎn)物電泳先將1-10l左右PCR產(chǎn)物，加已點(diǎn)在紙上的溴酸蘭，反復(fù)吸打混勻后進(jìn)行電泳，一般電流為10mA，電源100V，電泳30分鐘，紫外燈下觀察，滿意的結(jié)果掃描打印。九、幾個(gè)注意點(diǎn)：1、逆轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵步驟是立即冰水??？2、Rt時(shí)，先打開(kāi)PCR預(yù)熱30分鐘。3、RNA抽提前，打開(kāi)離心機(jī)預(yù)冷。TRIzol法抽提總RNA細(xì)胞1×107組織100mg加1mlTRIzol細(xì)胞用1ml加樣器吹至液體澄清且無(wú)細(xì)胞團(tuán)塊勻漿（要徹底，后轉(zhuǎn)至EP管）（組織勻漿量>100mg時(shí)分裝1ml/每EP管）顛倒混勻10下，室溫5分鐘加氯仿1/5體積（

13、0.2ml）（必須按總體積的1/5）顛倒混勻10下，室溫5分鐘4，離心12000g，15分鐘轉(zhuǎn)上層水相（約400l）于另一1.5mlEP管中加等體積異丙醇（約400l），混勻室溫10分鐘4，離心12000g，10分鐘棄上清加冰預(yù)冷的75%乙醇（用DEPC水配）1ml4離心7500g，5分鐘棄上清，空氣干燥5-10分鐘（不能完全干燥）溶于DEPC水中至20l（10l-20l）（可在55-60水中，<10分鐘助溶） 注：1、RNA若用于核酸轉(zhuǎn)移應(yīng)溶解于樣本緩沖液中，否則DEPC溶解2、細(xì)胞組織加TRIzol勻漿后，可在-60放置至少一個(gè)月（甚至可一年以上）3、RNA在75%乙醇中，

14、2-8至少可保存一周，-20至少可保存一年RT-PCR原理與實(shí)驗(yàn)操作步驟兩步法RT-PCR（第一步：逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)）試劑 濃度 體積 終濃度RNA 23l(11.5l)Oligo(dT)15 0.05g/l 4l(2l) 0.005g/l（稀釋10倍后用）混勻，離心，70 5min立即冰水浴，稍離心試劑 濃度 體積 終濃度M-MLV Buffer 5× 8l (4l) 1×dNTP 10mM 2l (1l) 0.5mMRNasin 40U/l 1l (0.5l) 20M-MLV 200U/l 2l (1l) 200U總體積40l（20l）混勻，離心，42 60min95 10min（破壞MLV）4保存兩步法RT-PCRRT-PCR原理與實(shí)驗(yàn)操作步驟（第二步：PCR