毛細(xì)管電色譜法在生物大分子中的應(yīng)用

1、毛細(xì)管電色譜法在生物大分子中的應(yīng)用 1辛?xí)枣?1,王榮 2,劉勇 11蘭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,蘭州 (7300002蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院藥材科,蘭州 (730050E-mail :rhea1001摘 要:毛細(xì)管電色譜法作為一種新的高效分離技術(shù), 近幾年發(fā)展迅速。 本文對毛細(xì)管電色 譜技術(shù)、 毛細(xì)管電色譜柱技術(shù)及毛細(xì)管電色譜技術(shù)在生物大分子的應(yīng)用等方面逐步進(jìn)行了綜 述。毛細(xì)管電色譜法的優(yōu)越性勢必使它成為分離生物大分子的一個新方向。關(guān)鍵詞:毛細(xì)管電色譜法,毛細(xì)管電色譜柱,生物大分子中圖分類號:Q5031.引言隨著生命科學(xué)的迅速發(fā)展,檢測與生命相關(guān)的生物大分子(包括核酸、蛋白質(zhì)、多肽、 酶以及多糖為人類

2、征服疑難雜癥,特別是對腫瘤的預(yù)警、診斷和治療有著重要的意義。生 物大分子的檢測基于組成復(fù)雜、 成分微量或痕量的體系中, 要深入探索和了解生命領(lǐng)域中疾 病的發(fā)病機(jī)理, 需要分辨率強(qiáng)、 檢測靈敏度高和分析速度快的分析方法, 許多常規(guī)的分析技 術(shù)已不能勝任。 以毛細(xì)管電泳、 色譜學(xué)為主要內(nèi)容的現(xiàn)代分離分析技術(shù)極大推動了復(fù)雜體系 中生物大分子的檢測方法學(xué)研究。其中以毛細(xì)管電色譜法 capillary electrochromatography, CEC 具有靈敏度高、 分離度高和分離速度快的特點(diǎn)為代表的分析方法, 已成功地應(yīng)用于無 機(jī)物小分子等領(lǐng)域 1。 近年來, CEC 技術(shù)也被應(yīng)用于分子生物學(xué)領(lǐng)域

3、檢測生物大分子, 為了 更好地將 CEC 技術(shù)用于分子生物學(xué)領(lǐng)域, 建立良好地分離生物大分子的 CEC 方法, 本文主 要對毛細(xì)管電色譜技術(shù)、柱技術(shù)及其在生物大分子中的應(yīng)用進(jìn)行以下綜述。2.毛細(xì)管電色譜技術(shù)原理毛細(xì)管電色譜 (CEC是在毛細(xì)管中填充或在毛細(xì)管壁涂布、鍵合色譜固定相,用電滲 流或電滲流結(jié)合壓力流來推動流動相的一種液相色譜法, 是高效液相色譜法和高效毛細(xì)管電 泳的有機(jī)結(jié)合 2。由于它在毛細(xì)管中填充或在毛細(xì)管內(nèi)壁涂布、鍵合或交聯(lián)了色譜固定相, 因此 CEC 具有高效液相色譜 (HPLC和毛細(xì)管電泳 (CE的雙重優(yōu)勢。它一方面解決了 CE 選擇 性差、難以分離中性物質(zhì)的問題 , 另一方

4、面大大提高了液相色譜的分離效率 3。 CEC 主要依 靠電滲流驅(qū)動流動相 , 所以它具有 CE 塞式流的優(yōu)點(diǎn) , 從而具有與 CE 相似的高效性, 物質(zhì)在 CEC 中的分離是基于樣品分子在固定相與流動相兩相之間作用力的差異和樣品分子間電泳淌度 的差異 4。因此, CEC 技術(shù)具備了高靈敏度,高分辨率和高速的特點(diǎn)。Knox 5進(jìn)行了有關(guān)填充柱電色譜法理論研究工作,弄清了填充柱電色譜法中的峰展寬 及熱效應(yīng),并指出了制約毛細(xì)管電色譜法發(fā)展及應(yīng)用的瓶頸問題。 Tsuda 6研究了電色譜法 中的色譜行為, 設(shè)計了連續(xù)進(jìn)樣電色譜法, 對樣品進(jìn)行了富集。 1991年 Knox 7彌補(bǔ)了早期電 色譜法中的缺陷

5、, 從理論上討論了填料大小、 電解質(zhì)溶液濃度與電滲流速度及柱效間的關(guān)系。 至此,有關(guān)電色譜法的理論基礎(chǔ)已全部建立。 1992年, Yamamoto 等 8發(fā)現(xiàn)電滲流為 0.8 2.6mm/s時,塔板高度無明顯的變化,這為快速分離創(chuàng)造了條件。近年來,隨著電色譜基本 理論的進(jìn)一步完善, 電色譜在生化藥物的分析、 制藥工業(yè)、 手性藥物拆分等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)1本課題得到國家自然基金面上項目(No.20775089的資助。用 9, 特別是 CEC 技術(shù)在分離檢測核酸、 蛋白質(zhì)和小肽等生物大分子方面有廣泛地應(yīng)用前景。 3.毛細(xì)管電色譜柱技術(shù)為了得到較好的分離度,并減少毛細(xì)管柱對大分子化合物的吸附,必須對 C

6、EC 中的毛 細(xì)管柱進(jìn)行修飾。柱子是 CEC 的 “ 心臟 ” ,柱技術(shù)是 CEC 的關(guān)鍵 10,毛細(xì)管電色譜柱在毛細(xì)管 電色譜 (CEC分離體系中占有最重要的地位, 它具有雙重作用:一是作為固定相 , 承擔(dān)對分離 對象的分離任務(wù); 二是在其表面形成雙電層, 在電場作用下產(chǎn)生電滲流, 作為推動力。 因此, 在過去的幾年中, 針對 CEC 特點(diǎn)的柱制備技術(shù)受到極大地關(guān)注并在分離生物大分子方面取得 了一些研究成果。 CEC 的毛細(xì)管柱主要有 3種類型:填充柱、開管柱和整體柱 11。早期填充 柱是發(fā)展最快使用最多的一類, 95%的文獻(xiàn)報道都是使用填充柱進(jìn)行分析, 靈敏度高, 重現(xiàn) 性好。 但填充柱需

7、要在柱尾制作塞子, 由此帶來柱塞效應(yīng), 引入了非均勻性因子引起氣泡的 產(chǎn)生,進(jìn)而使譜帶展寬。同時,塞子的制備具有一定的難度,條件控制不好將影響填充的均 勻性,孔隙若太大流動相滲出,太小易被污染甚至被樣品中的 “ 臟物 ” 阻塞。開管柱雖沒有塞 子問題,固定相均勻,可使用較高的電壓,但相比小,柱容量低,檢測困難。整體柱不需要 封口, 避免了塞子制作的困難以及產(chǎn)生的氣泡問題, 且具有更好的多孔性和滲透性, 即具有 流動相的流通孔又有便于溶質(zhì)進(jìn)行傳質(zhì)的中孔,利于實現(xiàn)生物大分子的快速分離。近幾年發(fā)展迅速毛細(xì)管電色譜整體柱 12-14 (monolithic column, 又稱棒柱 (rod、 連續(xù)床

8、 (continuous bed、無塞柱 (fritles scolumn。它是將單體、引發(fā)劑、致孔劑、交聯(lián)劑、電滲流 產(chǎn)生劑等的混合液 (或懸濁液 灌入毛細(xì)管中,在一定溫度條件下通過原位聚合形成一個棒狀 整體。具有制備方法簡單,內(nèi)部結(jié)構(gòu)均勻,通透性、重現(xiàn)性好,柱效高,固定相表面易于改 性, 無需制備塞子和可進(jìn)行快速分離等優(yōu)點(diǎn)。 主要有聚合物整體柱、 二氧化硅整體柱和以填 充柱為基礎(chǔ)的整體柱。4.毛細(xì)管電色譜法在生物大分子中的應(yīng)用生物大分子包括核酸 (DNA和 RNA 、蛋白質(zhì)、多肽、酶以及多糖等。生命科學(xué)的發(fā)展 給生物大分子分離技術(shù)提出了新的要求。 各種生化、 分子研究都要求得到純的, 以及

9、結(jié)構(gòu)和 活性完整的生物大分子樣品,這就使得其分離技術(shù)在各項研究中起著舉足輕重的作用 15。4.1 毛細(xì)管電色譜法分離核酸核酸是重要的生物大分子,是分子生物學(xué)研究的重要內(nèi)容。核酸分為脫氧核糖核酸 (簡 稱 DNA 和核糖核酸 (簡稱 RNA ,所有生物細(xì)胞都含有這兩類核酸 16。有關(guān)毛細(xì)管點(diǎn)色譜法 分離核酸的報道之一是 Behnke 和 Bayer 用加壓梯度 CEC 洗脫設(shè)備分離寡核苷酸 17。 在研究中, 使用加壓毛細(xì)管電色譜(PEC 變形的加壓梯度電動高效液相色譜,帶電荷分析物在 5µm二 氧化硅凝膠填充的反相中的進(jìn)一步分離, 研究了在相同的梯度洗脫模型中電壓達(dá)到 400V/cm

10、時對分離的影響。 然后對微柱 HPLC 和 MECC 進(jìn)行了直接的對比。 PEC 在微柱 HPLC 柱上應(yīng)用, 電壓時對 EOF 的有影響,這導(dǎo)致了洗脫液的速度隨電場強(qiáng)度增加。使用這個技術(shù),不僅縮短 了時間,而且提高了只使用微柱 HPLC 的效率。電場強(qiáng)度、直接電壓、梯度電壓、 pH 、外壓 的使用,洗脫液成分,特別重要的是流動相梯度,這些參數(shù)的改變能優(yōu)化 PEC 。Kato 等 18采用毛細(xì)管點(diǎn)色譜法中兩種修飾的多孔光聚合溶膠 -凝膠整體柱分離氨基酸混 合物。Hoegger 等 19用聚丙烯酰胺類整體柱分析了氨基酸和多肽。4.2 毛細(xì)管電色譜法分離蛋白質(zhì)隨著生命科學(xué)的迅猛發(fā)展,蛋白質(zhì)組學(xué)已成

11、為當(dāng)今的前沿科學(xué),其重要性和戰(zhàn)略意義 日益顯著 20。發(fā)展新型、快速、高效的蛋白質(zhì)分離分析技術(shù)對蛋白質(zhì)組學(xué)及整個生命科學(xué) 的發(fā)展具有十分重要的意義 21-22。盡管高效液相色譜(HPLC 被公認(rèn)是有效的分離手段之 一,但由于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性,常常導(dǎo)致其色譜行為不理想。毛細(xì)管電泳(CE 作為新 型的分離技術(shù), 具有較高的分離效率, 在大分子的分離方面顯示出卓越的分離性能, 但其缺 乏對分離物的多種選擇性,限制了分離潛力的發(fā)揮。因此,關(guān)于蛋白質(zhì)快速、高效的新型分 離方法的研究備受關(guān)注。 毛細(xì)管電色譜結(jié)合了毛細(xì)管電泳的高效性和高效液相色譜的高選擇 性,是一種新型的微柱分離分析技術(shù) 23,具有快速、

12、高選擇性、溶劑消耗少、樣品上樣量 少、 易于與質(zhì)譜聯(lián)用等優(yōu)越性能, 已成為對蛋白質(zhì)等生物大分子分離分析極具吸引力的方法, 它的出現(xiàn)為蛋白質(zhì)的分離分析提供了一條新的有效途徑 24。 但目前 CEC 主要是以電驅(qū)動流動 相為分離模式 25,操作中易產(chǎn)生氣泡,使其使用受到很大的限制 26。加壓毛細(xì)管電色譜 pressurized capillary electrochromatography, p -CEC 的出現(xiàn)解決了長期限制 CEC 廣泛使用 的問題。 p -CEC 克服了僅靠電滲流驅(qū)動的一些限制因素,可方便地對流動相組成、性質(zhì)、 流速進(jìn)行調(diào)節(jié), 抑制氣泡的形成, 尤其能實現(xiàn)梯度洗脫, 是 CE

13、C 發(fā)展的重要方向 27-28。 目前, 采用梯度加壓毛細(xì)管電色譜已成功地分離了堿性藥物 29和多肽混合物 30-31,取得了很好的 分離效果。Zhao 等 32以 1.5µm無孔硅膠 non-porous silica C18柱為固定相,采用反相梯度 p -CEC ,在 7.5min 內(nèi)成功地分離了核糖核酸酶 A 、細(xì)胞色素 C 、溶菌酶和肌紅蛋白等 4種蛋白質(zhì) 混合物。結(jié)果表明,梯度 p -CEC 用于蛋白質(zhì)的快速高效分離具有很大潛力。Fréchet等 33將二甲基亞砜和脂肪醇作為反應(yīng)物的溶劑,采用 BIS 、丙烯酰胺、丙烯酸丁 酯在柱內(nèi)制成疏水相互作用色譜柱,該柱可在

14、 3min 內(nèi)分離 5種蛋白質(zhì)。4.3 毛細(xì)管電色譜法分離小分子肽CEC 以 HPLC 的固定相的毛細(xì)管柱裝填,流動相以電滲流為動力。由于電滲流不依賴分 子大小和柱長, 故此法適于分離小分子供試品, 并允許增加毛細(xì)管柱長。 目前已證明反相模 式硅膠固定相 CEC 能分離中性小分子肽 34。 Ye 等 35以強(qiáng)陽離子交換填料為固定相的離子交 換毛細(xì)管電色譜 IE-CEC 分離小分子肽。他們研究了供試品緩沖液濃度、 pH 值、電壓對 分離的影響,發(fā)現(xiàn)帶電小分子肽和填料間的靜電作用在 IE-CEC 分離中起重要作用。從十幾 種二至八肽的分離結(jié)果來看,各峰峰形尖銳且分得很開,能完成小分子肽的快速分離。

15、 Fu 等 36研究用親水離子 CEC HI-CEC 分離小分子肽的方法。與前述 Ye 等所用方法類 似,他們采用以親水強(qiáng)陽離子交換為固定相 Polysulfoethyl A的 CEC 分離 9種小肽。證明 親水強(qiáng)陽離子交換固定相能提供穩(wěn)定的陰極電滲流作為流動相的動力; 小分子肽溶質(zhì)與固定 相間的親水作用在 HI-CEC 系統(tǒng)中起主要作用,供試品中的 9種小肽分離效果很好,因此 HI-CEC 也可作為小分子肽分離的有效方法。Horváth等 37嘗試用聚苯乙烯類整體柱上分離多肽,其分離機(jī)理是基于電場中遷移過程 中電滲流、色譜保留、肽三者的共同作用。EIRassiZ 等 38開展了大量

16、的相關(guān)工作,制備了含有羥基和氰基等鍵合基團(tuán)的硅膠整體 柱,成功地分離了中性及帶電化合物、核酸等天然極性成分以及蛋白質(zhì)。5.結(jié)論綜上所述,毛細(xì)管電色譜技術(shù)由于具有高靈敏度、高分辨率和分離速度快等特點(diǎn),廣 泛的應(yīng)用于分離無機(jī)小分子。 隨著生命科學(xué)的發(fā)展, 毛細(xì)管電色譜技術(shù)在分離核酸、 蛋白質(zhì) 和多肽等生物大分子中將有更廣泛的應(yīng)用前景。參考文獻(xiàn)1Krull IS, Sebag A, Stevenson R. Specific applications of capillary electrochromatography to biopolymers, including proteins, nucl

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