課題2　土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù) (4)

1、課題課題2 2 土壤中分解尿素的細(xì)菌的分土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)離與計(jì)數(shù)專題專題2 2微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用. . . 1 1. .分離微生物的原理分離微生物的原理2.2.利用選擇培養(yǎng)基分離細(xì)菌利用選擇培養(yǎng)基分離細(xì)菌3 3. .統(tǒng)計(jì)細(xì)菌數(shù)目的方法統(tǒng)計(jì)細(xì)菌數(shù)目的方法. . . 簡(jiǎn)要地介紹尿素的發(fā)現(xiàn)過(guò)程以及尿素合成的歷史，簡(jiǎn)要地介紹尿素的發(fā)現(xiàn)過(guò)程以及尿素合成的歷史，引導(dǎo)學(xué)生閱讀引導(dǎo)學(xué)生閱讀“課課題背景題背景”知識(shí)，知識(shí)，使學(xué)生明確分解尿素的細(xì)菌的重要性，突出使學(xué)生明確分解尿素的細(xì)菌的重要性，突出課題研究的重課題研究的重要意義，設(shè)計(jì)問(wèn)題，導(dǎo)入要意義，設(shè)計(jì)問(wèn)題，導(dǎo)入新課新課。知道

2、了細(xì)菌分解尿素的原因后，我們?cè)搹摹Ｖ懒思?xì)菌分解尿素的原因后，我們?cè)搹氖裁礃拥耐寥乐蟹蛛x分解尿素的細(xì)菌呢？首先結(jié)合教材上科學(xué)家成功分離什么樣的土壤中分離分解尿素的細(xì)菌呢？首先結(jié)合教材上科學(xué)家成功分離Taq細(xì)菌的案例，分析得出分離微生物的一般規(guī)律，再結(jié)合本節(jié)的目之一細(xì)菌的案例，分析得出分離微生物的一般規(guī)律，再結(jié)合本節(jié)的目之一：要分離分解尿素的細(xì)菌，進(jìn)入選擇培養(yǎng)基的學(xué)習(xí)。知道了分離方法后，：要分離分解尿素的細(xì)菌，進(jìn)入選擇培養(yǎng)基的學(xué)習(xí)。知道了分離方法后，我們?nèi)绾螌?duì)土樣中分解尿素的細(xì)菌進(jìn)行計(jì)數(shù)呢？從而逐層深入依次討論統(tǒng)我們?nèi)绾螌?duì)土樣中分解尿素的細(xì)菌進(jìn)行計(jì)數(shù)呢？從而逐層深入依次討論統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目的方法及設(shè)

3、置對(duì)照的作用。計(jì)菌落數(shù)目的方法及設(shè)置對(duì)照的作用。 在充分分析在充分分析Taq細(xì)菌分離案例的過(guò)程中，讓學(xué)生理解生物與環(huán)境的適細(xì)菌分離案例的過(guò)程中，讓學(xué)生理解生物與環(huán)境的適應(yīng)性，從而真正明白分離微生物的原理，并能從邏輯上給出分離微生物的應(yīng)性，從而真正明白分離微生物的原理，并能從邏輯上給出分離微生物的大致思路，這也為選擇培養(yǎng)基的學(xué)習(xí)打好基礎(chǔ)，并添加典型實(shí)例，讓學(xué)生大致思路，這也為選擇培養(yǎng)基的學(xué)習(xí)打好基礎(chǔ)，并添加典型實(shí)例，讓學(xué)生更好地理解選擇培養(yǎng)基的作用。通過(guò)視頻的直觀性讓學(xué)生掌握細(xì)菌計(jì)數(shù)的更好地理解選擇培養(yǎng)基的作用。通過(guò)視頻的直觀性讓學(xué)生掌握細(xì)菌計(jì)數(shù)的一般方法。一般方法。. . . 尿素的發(fā)現(xiàn)歷史尿

4、素的發(fā)現(xiàn)歷史 1773年，伊萊爾年，伊萊爾羅埃爾（羅埃爾（Hilaire Rouelle）發(fā)現(xiàn)尿素。）發(fā)現(xiàn)尿素。1828年，德國(guó)化學(xué)家弗年，德國(guó)化學(xué)家弗里德里希里德里希維勒首次使用無(wú)機(jī)物質(zhì)氰酸銨（維勒首次使用無(wú)機(jī)物質(zhì)氰酸銨（NH4CNO，一種無(wú)機(jī)化合物，可由氯化銨和，一種無(wú)機(jī)化合物，可由氯化銨和氰酸銀反應(yīng)制得氰酸銀反應(yīng)制得)與硫酸銨人工合成了尿素。本來(lái)他打算合成氰酸銨，卻得到了尿素。與硫酸銨人工合成了尿素。本來(lái)他打算合成氰酸銨，卻得到了尿素。尿素的合成揭開(kāi)了人工合成有機(jī)物的序幕尿素的合成揭開(kāi)了人工合成有機(jī)物的序幕，實(shí)際上開(kāi)辟了有機(jī)化學(xué)。. . . 一、課題背景一、課題背景. . . 芽孢桿菌、

5、小球菌、假單胞桿菌、克氏桿菌、棒狀桿菌、梭狀芽孢桿菌，某些真菌和放線菌也能分解尿素。1 1. .怎樣才能從土壤中分離出分解尿素的細(xì)菌呢？怎樣才能從土壤中分離出分解尿素的細(xì)菌呢？. . . 二、研究思路二、研究思路 （一）篩選菌株（一）篩選菌株水生耐熱細(xì)菌Taq ( Thermus aquaticus )耐高溫的Taq DNA聚合酶美國(guó)微生物學(xué)科布魯克（T.Brock)1966年發(fā)現(xiàn)耐熱細(xì)菌a.提出的問(wèn)題提出的問(wèn)題 如何尋找如何尋找耐高溫耐高溫的酶？的酶？b.解決問(wèn)題的思路解決問(wèn)題的思路 尋找尋找耐高溫耐高溫環(huán)境；環(huán)境；c.原理原理 高溫淘汰其他菌，選出耐高溫細(xì)菌，耐高溫菌種提取耐高溫酶。高溫淘

6、汰其他菌，選出耐高溫細(xì)菌，耐高溫菌種提取耐高溫酶。. . . : :要分離某種微生物，必須根據(jù)該微生物的特要分離某種微生物，必須根據(jù)該微生物的特點(diǎn)，點(diǎn)，包括營(yíng)養(yǎng)、生理、生長(zhǎng)條件等方法：包括營(yíng)養(yǎng)、生理、生長(zhǎng)條件等方法： 抑制大多數(shù)微生物不能生長(zhǎng)，抑制大多數(shù)微生物不能生長(zhǎng)， 造成有利于該菌生長(zhǎng)的環(huán)境。造成有利于該菌生長(zhǎng)的環(huán)境。結(jié)果：結(jié)果：培養(yǎng)一定時(shí)間后，該菌數(shù)量上升，再通過(guò)平板培養(yǎng)一定時(shí)間后，該菌數(shù)量上升，再通過(guò)平板稀釋等方法對(duì)它進(jìn)行純化培養(yǎng)分離。稀釋等方法對(duì)它進(jìn)行純化培養(yǎng)分離。二）實(shí)驗(yàn)室二）實(shí)驗(yàn)室中微生物的篩選原理：中微生物的篩選原理：. . . 選擇培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基 在微生物學(xué)中，將在微生物學(xué)

7、中，將允許允許特定種類的微生物生長(zhǎng)，特定種類的微生物生長(zhǎng)，同時(shí)同時(shí)抑制或阻止抑制或阻止其他種類微生物生長(zhǎng)的培養(yǎng)基。其他種類微生物生長(zhǎng)的培養(yǎng)基。加入青霉素的培養(yǎng)基加入青霉素的培養(yǎng)基: :分離酵母菌、霉菌等真菌分離酵母菌、霉菌等真菌加入高濃度食鹽的培養(yǎng)基加入高濃度食鹽的培養(yǎng)基: :分離金黃色葡萄球菌分離金黃色葡萄球菌不加氮源的無(wú)氮培養(yǎng)基不加氮源的無(wú)氮培養(yǎng)基: :分離自生固氮菌分離自生固氮菌不加含碳有機(jī)物的無(wú)碳培養(yǎng)基不加含碳有機(jī)物的無(wú)碳培養(yǎng)基: :分離自養(yǎng)型微生物分離自養(yǎng)型微生物加入青霉素等抗生素的培養(yǎng)基加入青霉素等抗生素的培養(yǎng)基: :分離導(dǎo)入了目的基因的受體細(xì)胞分離導(dǎo)入了目的基因的受體細(xì)胞. .

8、. KHKH2 2POPO4 4 1.4g 1.4g NaHPO NaHPO4 4 2.1g 2.1g MgSO MgSO4 4 H H2 2O 0.2gO 0.2g 葡萄糖葡萄糖 10.0g10.0g 尿素尿素 1.0g1.0g 瓊脂瓊脂 15.0g15.0g 將上述物質(zhì)溶解后，將上述物質(zhì)溶解后，用蒸餾水定容到用蒸餾水定容到1000mL1000mL。（1）該培養(yǎng)基的配方中，為微生物的生長(zhǎng)提供碳源和氮源的分別是什么物質(zhì)？ （2）此配方能否篩選出產(chǎn)生脲酶的細(xì)菌？為什么？碳源：葡萄糖、尿素碳源：葡萄糖、尿素氮源：尿素氮源：尿素能。只有產(chǎn)生脲酶的能。只有產(chǎn)生脲酶的細(xì)菌能利用尿素作為氮源而生細(xì)菌能利用

9、尿素作為氮源而生存。存。. . . （四）統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目（四）統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目1 1、顯微鏡直接計(jì)數(shù)：、顯微鏡直接計(jì)數(shù)：（1 1）方法：利用）方法：利用血球計(jì)數(shù)板血球計(jì)數(shù)板，在顯微鏡下計(jì)算一定容積里樣，在顯微鏡下計(jì)算一定容積里樣品中微生物的數(shù)量。品中微生物的數(shù)量。不能區(qū)分死菌與活菌；不能區(qū)分死菌與活菌；不適于對(duì)運(yùn)動(dòng)細(xì)菌的計(jì)數(shù)；不適于對(duì)運(yùn)動(dòng)細(xì)菌的計(jì)數(shù)；需要相對(duì)高的細(xì)菌濃度；需要相對(duì)高的細(xì)菌濃度；個(gè)體小的細(xì)菌在顯微鏡下難以觀察；個(gè)體小的細(xì)菌在顯微鏡下難以觀察；（2 2）缺點(diǎn)）缺點(diǎn)顯微鏡直接計(jì)數(shù)法顯微鏡直接計(jì)數(shù)法. . . （四）統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目（四）統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目1 1、顯微鏡直接計(jì)數(shù)：、顯微鏡直接計(jì)數(shù)：2

10、2、活菌計(jì)數(shù)法（間接計(jì)數(shù)法、活菌計(jì)數(shù)法（間接計(jì)數(shù)法) ) （1 1）操作方法：）操作方法： 稀釋涂布平板稀釋涂布平板統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)統(tǒng)計(jì)菌落數(shù) （2 2）原理：）原理： 1 1個(gè)菌落個(gè)菌落1 1個(gè)活菌個(gè)活菌 （3 3）統(tǒng)計(jì)結(jié)果：統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)往往比活菌的實(shí)）統(tǒng)計(jì)結(jié)果：統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)往往比活菌的實(shí)際數(shù)目低，因此統(tǒng)計(jì)結(jié)果一般用菌落數(shù)表示。際數(shù)目低，因此統(tǒng)計(jì)結(jié)果一般用菌落數(shù)表示。 每克樣品中的菌株數(shù)每克樣品中的菌株數(shù)= =（C/V)C/V)* * M M 其中其中C:C:某一稀釋度下平板上生長(zhǎng)的平均菌落數(shù)；某一稀釋度下平板上生長(zhǎng)的平均菌落數(shù)； V: V:所用稀釋液的體積；所用稀釋液的體積； M: M:稀釋倍數(shù)

11、。稀釋倍數(shù)。 當(dāng)樣品的當(dāng)樣品的稀釋度稀釋度足夠高時(shí)足夠高時(shí)，固體培養(yǎng)，固體培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)的一個(gè)菌基表面生長(zhǎng)的一個(gè)菌落，來(lái)源于樣品稀釋落，來(lái)源于樣品稀釋液中的一個(gè)活菌液中的一個(gè)活菌。. . . 例：兩位同學(xué)用稀釋涂布平板法測(cè)定同一土壤樣品中的細(xì)菌數(shù)。例：兩位同學(xué)用稀釋涂布平板法測(cè)定同一土壤樣品中的細(xì)菌數(shù)。從對(duì)應(yīng)稀釋倍數(shù)為從對(duì)應(yīng)稀釋倍數(shù)為10106 6的培養(yǎng)基中，得到以下兩種統(tǒng)計(jì)結(jié)果。的培養(yǎng)基中，得到以下兩種統(tǒng)計(jì)結(jié)果。 1 1、甲同學(xué)在該濃度下涂布了一個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)為、甲同學(xué)在該濃度下涂布了一個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)為230230。 2 2、乙同學(xué)在該濃度下涂布了、乙同學(xué)在該濃度下涂布了A A、

12、B B、C C三個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)三個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)分別為分別為2121、212212、256256，該同學(xué)以這三個(gè)平板上菌落數(shù)的平均值，該同學(xué)以這三個(gè)平板上菌落數(shù)的平均值163163作為統(tǒng)計(jì)結(jié)果。作為統(tǒng)計(jì)結(jié)果。 甲：沒(méi)有甲：沒(méi)有重復(fù)實(shí)驗(yàn)重復(fù)實(shí)驗(yàn)（至少涂布（至少涂布3 3個(gè)平板）個(gè)平板） 乙：乙：A A組結(jié)果誤差過(guò)大，不應(yīng)用于計(jì)算平均值組結(jié)果誤差過(guò)大，不應(yīng)用于計(jì)算平均值你認(rèn)為這兩位同學(xué)的作法正確嗎？你認(rèn)為這兩位同學(xué)的作法正確嗎？如果如果有問(wèn)題，錯(cuò)在哪？有問(wèn)題，錯(cuò)在哪？. . . （四）統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目（四）統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目2 2、活體計(jì)數(shù)法（間接計(jì)數(shù)法、活體計(jì)數(shù)法（間接計(jì)數(shù)法) ). . . （

13、四）統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目（四）統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目. . . 在做本課題實(shí)驗(yàn)時(shí)，利用選擇培養(yǎng)基進(jìn)行尿素分解菌的分離過(guò)程中，從對(duì)應(yīng)稀釋倍數(shù)為106的培養(yǎng)基中，A、B兩同學(xué)分別得到以下兩種統(tǒng)計(jì)結(jié)果。 1、A同學(xué)篩選出150個(gè)菌落。 2、B同學(xué)篩選出50個(gè)菌落。 B認(rèn)為A的培養(yǎng)基被雜菌污染了，或培養(yǎng)基中混入了其他含氮物質(zhì)，因而導(dǎo)致不能分解尿素的細(xì)菌也能在該培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。A確認(rèn)自己的操作無(wú)誤，只是自己所用的土壤樣品不同，但此時(shí)也拿不出能令人信服的證據(jù)。 請(qǐng)你幫助A同學(xué)改進(jìn)實(shí)驗(yàn)，提供具有說(shuō)服力的證據(jù)。分析：一是由于土樣不同，二是由于培養(yǎng)基污染或操作失誤 (或者是混入了其他的含氮物質(zhì))。 究竟是哪個(gè)原因，可以通過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)證

14、明。實(shí)驗(yàn)方案有兩種。一種方案是可以由其他同學(xué)用與A同學(xué)一樣的土樣進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，如果結(jié)果與A同學(xué)一致，則證明A無(wú)誤；如果結(jié)果不同，則證明A同學(xué)存在操作失誤或培養(yǎng)基的配制有問(wèn)題。另一種方案是將A同學(xué)配制的培養(yǎng)基在不加土樣的情況下進(jìn)行培養(yǎng)，作為空白對(duì)照，以證明培養(yǎng)基是否受到污染。通過(guò)這個(gè)事例可以看出，實(shí)驗(yàn)結(jié)果要有說(shuō)通過(guò)這個(gè)事例可以看出，實(shí)驗(yàn)結(jié)果要有說(shuō)服力，對(duì)照的設(shè)置是必不可少的。服力，對(duì)照的設(shè)置是必不可少的。. . . 1 1、設(shè)置對(duì)照的目的：、設(shè)置對(duì)照的目的： 排除排除實(shí)驗(yàn)組中非測(cè)試因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，實(shí)驗(yàn)組中非測(cè)試因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度。提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度。 對(duì)照實(shí)驗(yàn)對(duì)照實(shí)驗(yàn)

15、是指除了是指除了 被測(cè)試被測(cè)試 的條件外，其他條的條件外，其他條件都件都 相同相同 的實(shí)驗(yàn)。滿足該條件的稱為的實(shí)驗(yàn)。滿足該條件的稱為 對(duì)照對(duì)照組，未組，未滿足該條件的稱為滿足該條件的稱為 實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn) 組。組。（五）設(shè)置（五）設(shè)置 對(duì)照對(duì)照. . . 研究思路研究思路菌種篩選菌種篩選統(tǒng)計(jì)菌落菌數(shù)目統(tǒng)計(jì)菌落菌數(shù)目設(shè)置對(duì)照設(shè)置對(duì)照土壤中分解尿素的分離與計(jì)數(shù)土壤中分解尿素的分離與計(jì)數(shù)(1). . . 1.1.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分別是能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分別是( )( ) A.CO A.CO2 2和和N N2 2 B. B.葡萄糖和葡萄糖和NHNH3 3 C.COC.CO

16、2 2和尿素和尿素 D.D.葡萄糖和尿素葡萄糖和尿素2.2.使用選擇培養(yǎng)基的目的是（使用選擇培養(yǎng)基的目的是（ ） A.A.培養(yǎng)細(xì)菌培養(yǎng)細(xì)菌 B.B.培養(yǎng)真菌培養(yǎng)真菌 C.C.使需要的微生物大量繁殖使需要的微生物大量繁殖 D.D.表現(xiàn)某微生物的特定性狀與其他微生物加以區(qū)別表現(xiàn)某微生物的特定性狀與其他微生物加以區(qū)別D DC C3.3.統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目的方法有統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目的方法有 （ ） 涂布平板法涂布平板法 重量法重量法 直接計(jì)數(shù)法直接計(jì)數(shù)法 比濁法比濁法 生理指標(biāo)法生理指標(biāo)法 膜過(guò)濾法膜過(guò)濾法 A. A. B. B. C. C. D. D.D D. . . 5 5通過(guò)配置特殊的培養(yǎng)基可以從混雜的微生物群體中分離通過(guò)配置特殊的培養(yǎng)基可以從混雜的微生物群體中分離出所需的微生物。下列哪項(xiàng)操作最終不能達(dá)到分離出相應(yīng)出所需的微生物。下列哪項(xiàng)操作最終不能達(dá)到分離出相應(yīng)微生物的目的微生物的目的( () )A A在無(wú)氮培養(yǎng)基上可從多種細(xì)菌中分離出圓褐固氮菌在無(wú)氮培養(yǎng)基上可從多種細(xì)菌中分離出圓褐固氮菌B B在缺乏有機(jī)碳源的培養(yǎng)基上可以從多種細(xì)菌中分離得到在