酵母雙雜交體系的新發(fā)展

1、    酵母雙雜交體系的新發(fā)展             作者：佚名時間：2007-11-23 10:32:00                     摘要 酵母雙雜交系統(tǒng)是研究蛋白質(zhì)相互作用的一種有效方法。本文簡要介紹了雙雜交體系的原理、

2、應(yīng)用和自身存在的問題，并對其最新發(fā)展做了重點闡述。 關(guān)鍵詞 酵母雙雜交系統(tǒng)，蛋白質(zhì)一蛋白質(zhì)間相互作用 自從Fields和Song1首先描述了酵母雙雜交系統(tǒng)（yeast two-hybrid system），這一研究蛋白質(zhì)間相互作用的新技術(shù)已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用。它的可行性、有效性在驗證已知蛋白質(zhì)之間的相互作用或篩選與靶蛋白特異作用的候選蛋白的研究中已被證實并被推廣到了諸如細(xì)胞周期調(diào)控、信號傳導(dǎo)、腫瘤基因表達(dá)等多個研究領(lǐng)域，受到越來越多的重視。隨著日益廣泛的應(yīng)用，人們也不斷地對這一技術(shù)進(jìn)行了完善和發(fā)展。 一、酵母雙雜交體系的原理及應(yīng)用 真核細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄激活因子的轉(zhuǎn)錄激活作用是由功能相對獨(dú)立的DNA

3、結(jié)合結(jié)構(gòu)域（binding domain,BD）和轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域（activation domain,AD）共同完成的2，這兩個結(jié)構(gòu)域通過共價或厞共介連接建立的空間聯(lián)系是導(dǎo)致結(jié)合和激活發(fā)生的關(guān)鍵3，4。根據(jù)這一特點，如果使可能存在相互作用的兩種蛋白X和Y分別以和BD/AD形成雜合蛋白的形式的酵母中表達(dá)分布于細(xì)胞核中，X與Y之間的相互作用就可以將BD和AD在空間結(jié)構(gòu)上重新聯(lián)結(jié)為一個整體而與報告基因的上游激活序列（upstream activation sequence）結(jié)合，進(jìn)而發(fā)揮激活轉(zhuǎn)錄的功能，使受調(diào)控的報告基因得到表達(dá)。根據(jù)這一原理，雙雜交系統(tǒng)通過簡便的酵母遺傳分析對報告基因表型進(jìn)行檢測即

4、可實現(xiàn)對于蛋白質(zhì)間相互作用的研究。 迄今為止，應(yīng)用于篩選基因的雙雜交體系已發(fā)展出很多版本。以較早發(fā)展起來的Y190為例，它采用了GAL1-HIS3，GAL1-LacZ雙重報告基因，其中啟動子GAL1由包含轉(zhuǎn)錄因子Ga14的BD特異識別位點的上游激活序列UAS和基礎(chǔ)啟動子（minimai promoter）組成。營養(yǎng)篩選適于作為初篩處理大理篩查對象；顏色篩選則是對雜合蛋白復(fù)合體轉(zhuǎn)錄激活功能的再驗證，易于排除部分假陽性。在酵母Y190中，由于HIS3基因的TATA盒中具有不受GAL1上游激活序列調(diào)控的低水平啟動轉(zhuǎn)錄功能，就使得通過顏色進(jìn)行再次篩選尤為重要。用于雙雜交篩選的表達(dá)質(zhì)粒載體如Ga14系列

5、除能表達(dá)BD或AD與“誘餌X”或“獵物Y”融合的雜合蛋白外，還在該雜合蛋白的N端添加了SV40的核定序列（nuclear localization sequence），使該內(nèi)的蛋白量可以滿足檢測的靈敏度需量。經(jīng)驗證明，應(yīng)用不同體系進(jìn)行檢測的靈敏差異主要取決于控制報告基因表達(dá)的啟動子和DNA結(jié)合序列的特點以及兩種融合蛋白在酵母中的表達(dá)量11。 作為一種高度敏感5、適用于細(xì)胞核內(nèi)外以至于細(xì)胞內(nèi)外多種蛋白質(zhì)在體研究體系，雙雜交系統(tǒng)主要應(yīng)用于：驗證通過其他方法發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)間可能的相互作用；確定蛋白質(zhì)特異相互作用的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域和氨基酸；篩選文庫以得到與已知蛋白質(zhì)存在特異相互作用的蛋白質(zhì)。由于具有相對簡便、

6、快速及不經(jīng)蛋白質(zhì)純化即可相接獲得編碼基因的特點，采用雙雜交體系從cDNA文庫和基因文庫中直接篩選出蛋白質(zhì)間相互作用成為它最具優(yōu)勢之處。由此而鑒定的各種受體、轉(zhuǎn)錄因子、蛋白激酶、磷酸化酶、細(xì)胞骨架蛋白以及參與細(xì)胞周期調(diào)控、腫瘤發(fā)生的蛋白質(zhì)已不勝枚舉6-10。 二、雙雜交系統(tǒng)的缺陷 盡管已被證實為一種非常有效的方法，雙雜交系統(tǒng)也有自身的一些問題和缺點：首先，它并非對所有蛋白質(zhì)適用。由其原理所決定，融合蛋白的相互作用激活報告基因轉(zhuǎn)錄是在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)生的，而表達(dá)的融合蛋白在細(xì)胞內(nèi)能否正確折疊并運(yùn)至核內(nèi)是檢測的前提條件。雖然目前已經(jīng)在表達(dá)質(zhì)粒中插入了核定位序列，但傜不能排除不少必須經(jīng)過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器進(jìn)行翻

7、譯后加工修飾的蛋白質(zhì)尤其是胞外蛋白不能進(jìn)入核內(nèi)，或因產(chǎn)生錯誤的構(gòu)象而影響篩查結(jié)果12。其次，假陽性的發(fā)生較為繁多，在篩庫過程中遇到的假陽性可被簡單分成三型3：型：表達(dá)單獨(dú)的AD-Y融合蛋白即可激活轉(zhuǎn)錄。型：表達(dá)AD-Y融合蛋白和空BD載體即可激活轉(zhuǎn)錄。型：表達(dá)AD-Y融合蛋白與任意BD融合蛋白即可激活轉(zhuǎn)錄。這其中部分假陽性來源于 篩選對象具有類似轉(zhuǎn)錄因子的功能，或在雙雜交體系中能表現(xiàn)出這種特性。再次，部分假陽性原因不清，可能與酵母中其他蛋白質(zhì)的作用有關(guān)。最后，在某些酵母菌株中大量表達(dá)外源蛋白質(zhì)常會帶來毒性作用，從而影響菌株生長及報告基因的表型。為了抑制背景表達(dá)而在培養(yǎng)其中添加的3-AT（3-A

8、minotriazole)或6-Azauracil也對菌株有一定毒性，使一些蛋白質(zhì)間較弱的相互作用可能會因此而被掩蓋14。還應(yīng)意識到的一點是，雖然雙雜交系統(tǒng)可篩選出大量蛋白質(zhì)相互作用，但其中部分蛋白質(zhì)可能處于不同的細(xì)胞類型、細(xì)胞空間或生長發(fā)育的不同時期，生理狀態(tài)下是不可能發(fā)生相互作用的。因此，對于篩選對象和范圍，應(yīng)有一個合適的選擇。 三、酵母雙雜交體系的新發(fā)展 在雙雜交的具體操作中，雖然篩選本身較為簡便，但由于該體系存在一些自身問題，使得篩選的結(jié)果往往會出現(xiàn)幾十、幾百甚至更多的陽性克隆，后續(xù)的分類、鑒別工作直至找到具有意義的基因片段需耗費(fèi)大量的時間及精力。近年來，雙雜交系統(tǒng)的廣泛應(yīng)用促進(jìn)了該系

9、統(tǒng)的不斷改進(jìn)與提高。主要體現(xiàn)在： 1.發(fā)展了酵母菌株的多重篩選機(jī)制。位于報告基因上游的啟動子是決定報告基因表達(dá)靈敏性和特異性最重要的因素，較早的雙雜交系統(tǒng)雖然采用了雙重報告基因，如HIS3和LacZ，但它們是受同一啟動子GAL1的調(diào)控，具有相同的17個堿基的BD識別序列，能激活其中之一者很有可能在另一檢測中亦呈陽性。目前設(shè)計的酵母菌株往往具有不同啟動子調(diào)控下的報告基因。如PJ69-4A14具有三個報告基因：GAL1-HIS3、GAL2-ADE2和GAL7-LacZ，GAL1、GAL2、GAL7都有可被Ga14BD識別的特異序列，且特此之間各不相同，使三種報告基因能同時產(chǎn)生假陽性反應(yīng)的機(jī)率明顯下

10、降。其中GAL2-ADE2，經(jīng)對照實驗檢測為一種靈敏性、特異性均強(qiáng)的報告基因，清除假陽性很有效。 2.表達(dá)型載體的構(gòu)建也正進(jìn)行著幾方面的改進(jìn)。首先，融合蛋白被置于一些可被誘導(dǎo)的啟動子調(diào)控之下，使蛋白質(zhì)在酵母的表達(dá)量能依需要進(jìn)行調(diào)控15。其次，BD或AD與作用蛋白質(zhì)的連接方式也不再只是BD或AD與作用蛋白質(zhì)的連接方式也不再只是BD或AD的C端與蛋白質(zhì)的N端，因為蛋白質(zhì)的N端和其活性也有很大關(guān)系，對于常規(guī)連接找不到作用蛋白的對象，改用N端也許能有不同的發(fā)現(xiàn)11。雙雜交體系中不同載體原來均采用氨芐抗性作為選擇標(biāo)志，現(xiàn)在可被改進(jìn)成具有耐氨芐、卡那霉素或氯霉素等不同耐藥基因的載體16，使得原來繁瑣的從酵

11、母中提取出單一質(zhì)粒的工作變得輕松快捷。 3.用于雙雜交篩選的文庫不但應(yīng)有代表每一基因的足夠豐富的多樣性，而且由于蛋白質(zhì)間發(fā)生作用的位點可能為蛋白質(zhì)多肽鏈的任意位置，所以對每一基因而言，還應(yīng)當(dāng)提供盡可能多地與AD連接位點14。插入片段不易過大，否則因為非特異結(jié)合所導(dǎo)致的假陽性也會明顯增多。選用更適宜的限制性內(nèi)切酶以構(gòu)建適用于雙雜交體系的文庫是綜合提高雙雜交技術(shù)的一個重要方面。 4.鄰近存在的兩個不同交配型的酵母配子體可能交配形成二倍體。利用這一特點，酵母交配（yeast mating）可以很方便地將兩種不同的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入同一酵母菌株17。目前此方法已成為酵母轉(zhuǎn)化的主要替代方法，極大的提高了可以被同時

12、檢測的蛋白質(zhì)數(shù)量。據(jù)此已發(fā)展出一套快速鑒定假陽性的方法6。 5.體內(nèi)進(jìn)行的雙雜交檢測往往需要體外的其他方法來驗證，為了使后續(xù)的采用其他方法再次鑒別蛋白質(zhì)相互作用的步驟更易實施，有報道將雙雜交篩出的基因片段插入一個帶有抗原決定簇標(biāo)記的質(zhì)粒載體，該載體可在哺乳動物細(xì)胞中高水平表達(dá)被抗原決定簇所標(biāo)記的蛋白質(zhì)。用BD-X質(zhì)粒和帶有AD-Y插入的抗原決定簇質(zhì)粒載體共轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞，即可直接進(jìn)行免疫共沉淀檢測。應(yīng)用這一方法已證實了Bcl-XL和Bad/Bax之間的相互作用19。 6.除了在酵母中應(yīng)用外，雙雜交體系也已擴(kuò)展到哺乳動物細(xì)胞20。因為有一個更類似于生理環(huán)境的蛋白質(zhì)合成、加工及反應(yīng)體系，有利于發(fā)

13、現(xiàn)起初的蛋白質(zhì)間相互作用。該體系除了構(gòu)建表達(dá)載體外，還需要構(gòu)建一個可被調(diào)控的報告基因載體共同轉(zhuǎn)染細(xì)胞。氯霉素乙酰素轉(zhuǎn)移酶（Chloramphenicol acetyltransferase）活力檢測，細(xì)胞表面標(biāo)記分子CD4和Hygromycin抗性均可作為報告基因來反映蛋 白間作用的有無與強(qiáng)弱20，21。 綜合利用以上改進(jìn)來構(gòu)建一種更準(zhǔn)確、更有效、更可行的雙雜交體系及配套方法，將會為雙雜交體系研究蛋白質(zhì)間作用提示一個美好前景。 四、結(jié)語 正如人類基因組計劃曾給生物學(xué)家?guī)砭薮笙Ｍ粯樱瑧?yīng)用迅速發(fā)展的雙雜交體系去逐漸架構(gòu)生物體系中紛繁復(fù)雜的蛋白質(zhì)間聯(lián)系，為我們展示了一個獲得大量的生物學(xué)信息的新途

14、徑。盡管對于此方法還有許多不同的認(rèn)識，而且目前尚不能完全正確地估價這些信息的價值，但它畢竟使生物科學(xué)在實現(xiàn)將結(jié)構(gòu)與功能最終結(jié)合為一體這個目標(biāo)上又向前邁進(jìn)了一步。隨著酵母雜交體系的不斷完善和提高，以及在應(yīng)用及處理結(jié)果方面經(jīng)驗的不斷積累，相信基于雙雜交原理而建立的一系列方法將會為生命科學(xué)的進(jìn)展起到積極的推動作用。 參考文獻(xiàn) 1 Fields S,Song O.Nature,1989;340:245 2 Keegan L et al.Science,1986;231:699 3 Brent R,Ptashne M.Cell,1985;43:729 4 Ma J,Ptashne M,Cell,1988

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