表觀遺傳學(xué)第七章siRNA與miRNA介導(dǎo)的調(diào)控

1、表觀遺傳學(xué) 第七章 siRNA與miRNA介導(dǎo)的調(diào)控 Epigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTC Epigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCrTransfer RNA (tRNA)Epigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCrRibosomal RNA (rRNA)Epigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCNature Biotechnology21, 1441 -1446 (2003)r一、RNA干擾及其機(jī)制r二、MicroRNAs在發(fā)育中的調(diào)

2、控作用r三、RNAi與異染色質(zhì)r四、miRNA在癌癥發(fā)生中的作用r五、siRNA的應(yīng)用Epigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCmRNA水平上誘導(dǎo)具有特異性序列的基因沉默的過(guò)程r2. 轉(zhuǎn)錄后沉默：Post-transcriptional gene silencing, PTGSEpigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCr1. RNA干擾：生物體內(nèi)通過(guò)雙鏈RNA分子在nEpigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCr1. 1990年，Rich Jorgensen將由強(qiáng)啟動(dòng)子控制的Chal

3、conesynthasegene轉(zhuǎn)入淡紫色的矮牽?；?加深紫色r2. Hypopigmentation: 許多花出現(xiàn)雜色，甚至紫色消失，變成白色r3. Co-suppressionr1. 1995年，Su Guoand Kenneth J. Kemphues，線蟲r2. 利用反義RNA技術(shù)阻斷線蟲中的par-1基因。在對(duì)照實(shí)驗(yàn)中給線蟲注射正義RNA以期觀察到基因表達(dá)的增強(qiáng)。效地抑制基因的表達(dá)！r3. 然而，正義RNA和反義RNA都能夠有r4. 沉默的效應(yīng)能夠在被注射的動(dòng)物及其后代中保持，雖然RNA轉(zhuǎn)錄本在胚胎早期就發(fā)生降解Epigenetics, 2008-2009, Semester 1,

4、USTC生物w秀w-w專.b心bioo做.c生om物Control dsRNAEpigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCds-gfpRNAYoung larva (幼蟲)Adult (成蟲)adult body wall at high magnification (高放大倍數(shù)的成蟲體壁)No hybridization and staining+antisense+hybridizationadult body wall at high magnification (高放大倍數(shù)的成蟲體壁)Epigenetics, 2008-2009, Semester

5、1, USTC生物w秀w-w專.b心bioo做.c生om物+ hybridization (endogenous mex-3RNA)+dsmex-3RNA+hybridizationEpigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCr2. 外源基因誘導(dǎo)的RNA沉默是植物對(duì)抗病毒和轉(zhuǎn)座子的一個(gè)防御系統(tǒng)Epigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCr1. 植物細(xì)胞可以通過(guò)降解病毒RNA 的方式來(lái)對(duì)抗病毒的入侵，稱為轉(zhuǎn)錄后沉默(PTGS)r1. 從雙鏈RNA產(chǎn)生的小干擾RNA可以用不同機(jī)制關(guān)閉基因的細(xì)胞機(jī)器r2. 為什么外源的dsRNA

6、能夠抑制與其序列同源的基因的表達(dá)？Epigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCrA. Postinitiationmechanisms. miRNA物通過(guò)阻礙翻譯的延伸，或者促使核糖體與mRNA生分離來(lái)抑制mRNA的翻譯rB. Cotranslationalprotein degradation. 做m在多肽鏈翻譯后的同時(shí)使其降解心oc.專o-oi秀bb生wwEpigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCrD. Argonaute招募eIF6，從而阻止大的核糖體亞基與小亞基的結(jié)合Epigenetics, 2008-2009,

7、 Semester 1, USTCrC. Argonaute與eIF4E競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合capEpigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCrE. Argonaute通過(guò)脫腺苷化(deadenylation) 阻止loop mRNA的形成rF. MicroRNA-mediated mRNA decay. miRNA觸發(fā)脫腺苷化并使得底物mRNA decapping域的核糖核酸酶，將dsRNA切割成小的short interfering RNAs(siRNAs) or microRNAs(miRNA)，并將這些產(chǎn)物加載到RISC上r2. RISC (RNA induce

8、d silencing complexes) (RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體): 包含多個(gè)蛋白質(zhì)的復(fù)合物，將與之連接的siRNA或miRNA定位到其靶點(diǎn)并抑制靶基因的表達(dá)Epigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTC生物w秀w-w專.b心bioo做.c生om物r1. Dicer: RNaseIII類似的，包含多個(gè)功能結(jié)構(gòu)r序列的結(jié)構(gòu)組成:物生r1. 一個(gè)PAZ結(jié)構(gòu)域，與做mdsRNA的末端結(jié)合心o賈第鞭毛蟲c.專or2. 兩個(gè)RNaseIII結(jié)構(gòu)-oi秀bb生能結(jié)構(gòu)域wwEpigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCEpigenet

9、ics, 2008-2009, Semester 1, USTCr1. PAZ 結(jié)構(gòu)域與兩個(gè)具有催化活性的RNaseIII結(jié)構(gòu)域分離r2.PAZ結(jié)構(gòu)域與RNaseIII結(jié)構(gòu)域的距離為65 angstrom，與25個(gè)bp的RNA長(zhǎng)度一致r3. Dicer是一個(gè)分子尺，負(fù)責(zé)識(shí)別dsRNA并在特異位點(diǎn)切斷Epigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTC的核心成員2. AGO蛋白質(zhì)一般包含PAZ和PIWI兩種功能結(jié)構(gòu)域3. PAZ與雙鏈siRNA3-端露出的兩個(gè)核苷酸結(jié)合4. PIWI負(fù)責(zé)將雙鏈siRNA切成單鏈5.PAZ和PIWI對(duì)于SiRNA與底物mRNA之間的相互

10、作用是必須的，并負(fù)責(zé)底物的斷裂或轉(zhuǎn)錄抑制6. 不同的AGO具有不同功能，例如人類AGO2負(fù)責(zé)的RISCs能夠割裂底物mRNA，而AGO1和AGO3則不能Epigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCrrrrr生物w秀w-w專.b心bioo做.c生om物r1. Argonaute(AGO): 大的蛋白質(zhì)家族，為RISCs物生做m心oc.專o-oi秀bb生wwEpigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTC物生做m心oc.專o-oi秀bbEpigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCr1. dsRN

11、A首先需要被Dicer相關(guān)的復(fù)合物進(jìn)行處理，然后在Argonaute相關(guān)的復(fù)合物的引導(dǎo)下發(fā)揮功能；r2. Dicer和Argonaute家族的成員在RNA誘導(dǎo)的沉默通路中發(fā)揮功能，不同的組成通過(guò)不同的機(jī)制引起沉默r3. 例如，不同的Epigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCEpigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCr1. MicroRNA(miRNA): 一種非編碼小的RNA (2123 bp)，通過(guò)Dicer剪切其前體RNA (70-90 )所得r2. miRNA以RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物的形式，在動(dòng)物和植物的細(xì)胞中廣泛

12、的表達(dá)，也稱為miRISCsr3. 在發(fā)育的過(guò)程中起著關(guān)鍵性的作用，能夠促使與miRNA序列同源的靶基因的mRNA的降解或者翻譯的抑制r(A) pri-miRNAs的結(jié)構(gòu)r(B) 人類pri-miR-30a RNA 的發(fā)夾環(huán)；Drosha切割位點(diǎn)(箭頭)，Dicer切割位點(diǎn)(三角)Epigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCr1. Pri-miRNA被Drosha切割r2. pre-miRNA被Dicer切割r3. Exportin5 (Exp5) 將miRNA裝運(yùn)到胞質(zhì)中Epigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCr2.

13、 Drosha和Dicer都具有RNaseIII 和dsRNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域Epigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCr1. RIII, RNaseIII 催化結(jié)構(gòu)域; D, dsRNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域; PRORICH, proline-rich結(jié)構(gòu)域; RS-RICH, arginine/serine rich結(jié)構(gòu)域r1. miRNAs發(fā)現(xiàn)的數(shù)量近年來(lái)快速增長(zhǎng)r2. 2006年10月，miRBase9.0，收錄4361個(gè)具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的前體miRNAs，能夠表達(dá)出4167個(gè)miRNA產(chǎn)物r3. Release 12.0，收錄8619個(gè)具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的前體miRNAs

14、，能夠表達(dá)出8273個(gè)miRNA產(chǎn)物Epigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCEpigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCEpigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCr1. miRNAs: 通常21-25bp的非編碼RNA，從大的前體RNA中剪切所得，形成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)。成熟的miRNA一般從前體RNA的發(fā)夾環(huán)的一個(gè)柄上，由RNaseIII剪切所得；至少在動(dòng)物中，絕大多數(shù)的miRNAs與底物的3UTR區(qū)域結(jié)合，抑制其翻譯Epigenetics, 2008-2009, Semester 1,

15、 USTCEpigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCr1. miRNAs和siRNAs都需要Dicer以及RISCs的處理，從而引起轉(zhuǎn)錄后抑制r2. siRNAs和miRNAs的分子特性相似，功能也相似r1. lin-4 和let-7 miRNAs調(diào)控線蟲發(fā)育的時(shí)間點(diǎn)Epigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCr在線蟲的幼蟲發(fā)育期，lin-4下調(diào)LIN-14和LIN-28蛋白質(zhì)的濃度，從而一方面阻止后期發(fā)育，一方面促進(jìn)幼蟲的發(fā)育Epigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCEpigene

16、tics, 2008-2009, Semester 1, USTCEpigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCr1. Forward genetics: lin-4 & let-7 r2.Reverse genetics: miR-181, mir-273Epigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCr1. Asymmetric chemosensory neurons：ASE left (ASEL) and ASE right (ASER), 感受環(huán)境的化學(xué)刺激r2. ASEL表達(dá)gcy-7, ASER表達(dá)gcy-5，化學(xué)

17、受體Epigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCEpigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCr1. 在Zebrafish, Medaka, Mouse, 和Fly中表達(dá)miR-124a和miR-1 r2. miR-124a僅在魚和鼠的腦以及脊髓中表達(dá)，在果蠅的腹神經(jīng)索中表達(dá)r3. miR-1僅在小鼠的肌肉和心臟中表達(dá)r4. miR-124a和miR-1的序列保守性高小鼠果蠅Epigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCrjaw-D的突變對(duì)TCP基因表達(dá)的影響r1. 3種miRNA控制造血干

18、細(xì)胞向淋巴物細(xì)胞的分化過(guò)程：miR-181，miR-223，miR-142sr2. miR-181: 主要在小鼠骨髓的生做B-淋巴m細(xì)胞中表達(dá)r3. miR-223: 骨髓原細(xì)胞心oc.專o-oi秀bb生wwEpigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCEpigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCEpigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCr1. 降低細(xì)胞毒素T淋巴細(xì)胞(cytotoxicT lymphocytes) 識(shí)別裂解的能力r2. 病毒早期轉(zhuǎn)錄腫瘤抗原(Tantigen)r3. 在

19、轉(zhuǎn)錄后期，SV miRNAs結(jié)合早期的腫瘤抗原，并使之降解r4. 降低腫瘤抗原的濃度，從而降低細(xì)胞毒素T淋巴細(xì)胞識(shí)別的Epigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCEpigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCr1. Adenovirus virus-associated 1 (VA1) RNA. r2. 在核里與其它前體miRNA競(jìng)爭(zhēng)與exportin-5的結(jié)合，競(jìng)爭(zhēng)與Dicer的切割r3. 干擾免疫應(yīng)答Epigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCr1. 宿主miR-32與primate

20、foamy virus type 1 結(jié)合限制其擴(kuò)增，病毒的Tas能夠抑制該過(guò)程r2. 肝特異性的miR-122能夠與HCV結(jié)合，使其擴(kuò)增，可能是激活病毒的復(fù)制，或者改變其亞定位Epigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCr1. RNAi調(diào)控異染色質(zhì)的沉默與組蛋白H3K9的甲基化;r2. 在fission yeast中刪除argonaute, dicer等基因，破壞RNAi機(jī)制，發(fā)現(xiàn)動(dòng)點(diǎn)附近的異染色質(zhì)重復(fù)片段表達(dá)異常的轉(zhuǎn)錄本r3. 由H3K9的甲基化缺失導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄激活，損傷動(dòng)點(diǎn)的功能r4. 動(dòng)粒的重復(fù)片段，其轉(zhuǎn)錄沉默的狀態(tài)由H3K9的甲基化以及染色質(zhì)與Swi6

21、結(jié)合所決定。和維持是必須的Epigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCr1. RNAi的分子機(jī)器對(duì)動(dòng)粒重復(fù)片段的異染色質(zhì)化的起始r1. 動(dòng)粒反鏈的轉(zhuǎn)錄片段被物RNAi沉默并降解生r2.動(dòng)粒正鏈轉(zhuǎn)錄本低表達(dá)，被做m心oc.Rdp1擴(kuò)增并產(chǎn)生siRNA專or3. Rdp1與染色質(zhì)結(jié)合-oi秀，促進(jìn)bb生組蛋白w修飾wEpigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCr1. 重復(fù)片段相關(guān)的siRNA(rasiRNA) 通路：r2. 重復(fù)片段的雙鏈的相對(duì)的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄，形成長(zhǎng)鏈dsRNAr3. 由Dicer切割成siRNAsr4. 與RI

22、SC結(jié)合，引起同源DNA的沉默Epigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCr1. dsRNA與染色質(zhì)沉默密切相關(guān)r2. 植物的轉(zhuǎn)基因被同源dsRNA的表達(dá)所沉默，并使同源DNA區(qū)域發(fā)生甲基化r3. 由siRNA介導(dǎo)，甲基轉(zhuǎn)移酶能夠被招募到靶基因的位點(diǎn)Epigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCr1. 人中已發(fā)現(xiàn)695個(gè)miRNAs，命名為：has-miRxr2. miRNA在癌癥發(fā)生中表達(dá)譜的變化: 檢測(cè)334個(gè)哺乳動(dòng)物樣本中的217個(gè)miRNAs的表達(dá)情況r3. 與正常組織相比，miRNAs在腫瘤中的表達(dá)顯著的下調(diào)r4.

23、 與mRNA相比，miRNA的表達(dá)譜是一個(gè)很好的癌癥分類指標(biāo)Epigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCEpigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCEpigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCrGastrointestinal tract (GI): 胃腸道r1. c-Myc調(diào)控的miRNA控制E2F1的表達(dá)r2. c-Myc是一個(gè)具有helixloophelix的亮氨酸拉鏈的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控人類和果蠅基因組中約1015%的基因的表達(dá)r3. c-Myc激活人類13#染色體上成簇的六個(gè)miR

24、NAsr4. E2F1是一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，在c-Myc的下游，促使細(xì)胞周期的發(fā)生Epigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCEpigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCr1. Tet: tetracycline (四環(huán)素)，降低c-Myc的表達(dá)r2. -/-: c-Myc敲除r3. -/-(Myc): c-Myc敲除后再轉(zhuǎn)入外源c-Myc基因Epigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCr1. +/+: 野生型Epigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCr2

25、. 在DNA損傷以及癌基因壓力的情況下，通過(guò)依賴于p53的通路中誘導(dǎo)r3. 在腫瘤及其分化的細(xì)胞株中過(guò)表達(dá)miR-34能夠抑制細(xì)胞周期的過(guò)程Epigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCr1. p53調(diào)控miR-34ac的表達(dá)Epigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCEpigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCr1. SA-Gal：檢測(cè)衰老的細(xì)胞G1SG2/MEpigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTC增，與正常細(xì)胞相比，其表達(dá)量明顯上調(diào)r2. mir

26、-1792的基因簇與c-myc協(xié)同作用，促進(jìn)小鼠中B細(xì)胞淋巴瘤的生長(zhǎng)Epigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCr1. mir-1792的基因簇在人類B細(xì)胞淋巴瘤中擴(kuò)Epigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCr1. 46個(gè)淋巴瘤樣本和47個(gè)直腸癌的樣本vs. 正常組織r2. mir-1792基因簇表達(dá)明顯的上調(diào)Epigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCEpigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCr1. siRNA一般2123bp: 19bp的雙鏈互

27、補(bǔ)區(qū)，兩邊對(duì)稱的、伸出的序列，5-phosphate (P) and 3-hydroxyl (OH) 基團(tuán).r2. 正義siRNA的5端穩(wěn)定性較高，3端穩(wěn)定性較低，切割位點(diǎn)穩(wěn)定性也較低r1. mRNA的ATG下游50-100bp，最好75bp r2. 效率較高的siRNA設(shè)計(jì)模體: AAN19TT, NAN19NN, NARN17YNN, NANN17YNNr3. 50%GC含量(30-70%)r4. 盡量避免三個(gè)連續(xù)相同的核苷酸，尤其是GGGr5. 避免序列上已知是mRNA結(jié)合蛋白質(zhì)位點(diǎn)的部分Epigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTC|化學(xué)合成: 較貴r2. 使用T7啟動(dòng)子體外轉(zhuǎn)錄前體miRNA|體外表達(dá)的dsRNA能夠被大腸桿菌的RNaseIII或RNaseIII-like DICER所切割Epigenetics, 2008-2009, Semester 1, USTCr1. 將外源的siRNA轉(zhuǎn)入細(xì)胞中(暫時(shí)的表達(dá))物生做m心oEpigenetics,