液相色譜法測(cè)定大隆的方法學(xué)研究

1、    液相色譜法測(cè)定大隆的方法學(xué)研究        大?。〝呈舐。┦悄壳皣?guó)際上認(rèn)為毒力最強(qiáng)的抗凝血?dú)⑹髣?，具有靶譜廣、毒力高、使用濃度低、對(duì)第一代抗凝血?dú)⑹笏幃a(chǎn)生抗性的鼠類有效的特點(diǎn)1，大面積滅鼠省工、省餌。大隆生產(chǎn)中如某個(gè)環(huán)節(jié)控制不嚴(yán)格，產(chǎn)品中就會(huì)出現(xiàn)中間體和雜質(zhì)，影響其滅鼠效能。對(duì)殺鼠藥進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，是滅鼠及鼠藥生產(chǎn)中一個(gè)極其重要的環(huán)節(jié)。目前國(guó)內(nèi)、國(guó)際無(wú)大隆標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法2-3。文獻(xiàn)4報(bào)道，高效液相色譜法測(cè)定大隆，樣品前處理需經(jīng)過(guò)萃取過(guò)濾減壓蒸餾萃取過(guò)濾蒸干溶解等8個(gè)步驟

2、。其缺點(diǎn)是操作繁瑣，難掌握，費(fèi)水、費(fèi)電、費(fèi)時(shí)、費(fèi)試劑，大批樣品測(cè)定需要技術(shù)人員也較多。筆者研究的以快速提取法處理樣品，用HPLC定量的實(shí)驗(yàn)方法，大大減少了財(cái)力、人力的消耗，提高了方法的準(zhǔn)確度、靈敏度，加快了檢驗(yàn)速度，每個(gè)樣品可節(jié)約儀器設(shè)備、試劑、水、電等開(kāi)支數(shù)百元，具有很好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。此方法不僅可對(duì)大隆生產(chǎn)原料、原粉、母粉、母液、毒餌進(jìn)行分析，還可監(jiān)測(cè)其它香豆素類殺鼠藥，故可應(yīng)用于誤食鼠藥中毒樣品的分析鑒定。 1實(shí)驗(yàn)部分1.1儀器與試劑1.1.1儀器Beckman 344M型高效液相色譜儀(165紫外檢測(cè)器，427積分儀)、液體快速混合器(江西醫(yī)療器械廠)、粉碎機(jī)(江蘇金壇金城鎮(zhèn)華儀

3、器廠)。1.1.2試劑優(yōu)級(jí)純丙酮、色譜純甲醇(江蘇淮陰塑料制品廠精細(xì)化工研究所)、優(yōu)級(jí)純醋酸、高純水(經(jīng)MILLI-Q處理，電導(dǎo)率 1.0s/cm2)。1.1.3大隆標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液精確稱取提純后含量99%的大隆標(biāo)準(zhǔn)品0.1000g，于100ml容量瓶中，用少量丙酮完全溶解后，再用甲醇稀釋至刻度，置冰箱4保存。該溶液濃度為1.0mg/ml。1.1.4大隆標(biāo)準(zhǔn)使用溶液取大隆標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液0.5ml，于10ml容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度。該溶液濃度為50g/ml。1.2實(shí)驗(yàn)原理大隆殺鼠藥中的有效成分經(jīng)丙酮浸取、甲醇稀釋后，用色譜柱分離，再以紫外檢測(cè)器在最大吸收峰處測(cè)量吸收強(qiáng)度。其吸收強(qiáng)度與濃度關(guān)系符合朗

4、伯比爾定律。1.3色譜條件色譜柱：AGEX ODS C18柱(5 4.6mm×25cm)；流動(dòng)相：甲醇10%醋酸(V/V)90+10；流速1.0ml/min；檢測(cè)器波長(zhǎng)265nm；進(jìn)樣體積20l。1.4大隆樣品前處理樣品稱重全部精確至0.0001g。1.4.1原粉稱取大隆原粉樣品0.020.03g，于25ml具塞比色管中，用丙酮完全溶解后稀釋至刻度。取該溶液1.0ml于10ml比色管，用甲醇稀釋至刻度。1.4.2母粉稱取母粉樣品0.10.3g，于50.0ml具塞比色管中，用移液管加入25ml丙酮，在液體快速混勻器上振蕩510min，放置片刻，待液體稍清亮后，以0.5m FH濾膜過(guò)濾。

5、1.4.3母液稱大隆母液0.10.3g，于25.0ml具塞比色管中，加甲醇至刻度，混勻后以0.5m FH濾膜過(guò)濾。1.4.4毒餌樣品經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后過(guò)4060目分樣篩。取過(guò)篩后樣品25g，于25ml具塞比色管中，用移液管加入10ml丙酮，浸泡20min，將比色管置液體快速混合器上萃取10min，放置片刻，待液體稍清亮后以0.5m FH濾膜過(guò)濾。經(jīng)上述處理后的樣品，用HPLC以外標(biāo)法定量分析。1.5結(jié)果計(jì)算用標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積與樣品的峰面積進(jìn)行外標(biāo)法定量。計(jì)算公式：式中 Cs為大隆標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度(g/ml)；As為大隆標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積；Aw為樣品溶液的峰面積；W為樣品的重量(g)；K為樣品稀釋倍數(shù)。2

6、結(jié)果與討論2.1樣品中共存物的分離實(shí)驗(yàn)選擇良好的色譜分離條件，將大隆與樣品中的雜質(zhì)完全分離，是大隆有效成分準(zhǔn)確定量的關(guān)鍵。我們用甲醇與水、甲醇與不同濃度醋酸、甲醇與1%(w/v)正磷酸的不同比例為流動(dòng)相，分別以BECKMAN和AGEX色譜柱做分離條件實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如下：2.1.1AGEX ODS C18柱(5，4.6mm×25cm)在甲醇10%醋酸90+10時(shí)，大隆原粉、母粉、母液及干擾成分較多的毒餌樣品中，有效成分及與其共存的雜質(zhì)均可完全分離，不影響大隆的準(zhǔn)確定量(14)。1大隆原粉色譜分離2大隆母粉色譜分離3大隆母液色譜分離4大隆毒餌色譜分離2.1.2BECKMAN ODS C18柱

7、(5，4.6mm×25cm C18柱)在甲醇10%醋酸75+25為流動(dòng)相時(shí)，可得到大隆標(biāo)準(zhǔn)溶液異構(gòu)體的兩個(gè)峰(5)，且測(cè)定樣品時(shí)異構(gòu)體與樣品中其它雜質(zhì)也能完全分離。異構(gòu)體的比例與滅鼠效能、生物活性、代謝速度等有關(guān)5-6。但由于醋酸在流動(dòng)相中所占的比例較大，為避免對(duì)色譜柱的損傷，實(shí)驗(yàn)前后柱子的沖洗比較麻煩，不是特殊需要不采用該條件。 5大隆異構(gòu)體色譜分離2.24羥基香豆素類殺鼠藥的同時(shí)分離在實(shí)驗(yàn)條件下，4羥基香豆素色譜峰的保留時(shí)間(RT)為1.64，殺鼠靈為2.66，殺鼠迷為3.46，溴敵隆為4.31，大隆為6.26，故該方法亦可應(yīng)用于誤食鼠藥中毒樣品的定性、定量分析。2.3樣品前處理

8、條件的選擇實(shí)驗(yàn)2.3.1溶劑的選擇大隆易溶于三氯甲烷、苯，中度溶解于丙酮，微溶于甲醇。前兩種溶劑毒性較大，污染嚴(yán)重；我們以丙酮做為樣品前處理溶劑，既可實(shí)現(xiàn)在色譜分離時(shí)所產(chǎn)生的溶劑峰不干擾大隆的準(zhǔn)確定量，又做到其溶解度能夠滿足實(shí)際樣品分析的需要。2.3.2大隆母粉、毒餌浸取時(shí)間的選擇液體快速混合器震動(dòng)力量大，頻率高，速度均勻，大隆含量為0.5%的母粉，稱取0.4g加丙酮25ml；0.5/萬(wàn)的毒餌，稱7.0g加丙酮10ml，在混合器上震動(dòng)浸取510min，被測(cè)組份可完全浸出(表1)。表1母粉、毒餌浸取時(shí)間實(shí)驗(yàn)樣品浸取時(shí)間(min)樣品浸取時(shí)間(min)5101551015母粉0.490.490.5

9、0毒餌0.480.480.48(%)0.500.500.50(/萬(wàn))0.510.500.510.500.490.502.4紫外檢測(cè)器吸收波長(zhǎng)的選擇實(shí)驗(yàn)在上述色譜條件下，在對(duì)大隆標(biāo)準(zhǔn)溶液分析的同時(shí)，用165型紫外檢測(cè)器在200350nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，大隆紫外最大吸收波長(zhǎng)為265nm。2.5線性范圍和檢測(cè)下限實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確吸取一定量的大隆標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，制成濃度為5.0、30.0、60.0、120.0、240.0、300.0g/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液系列，在上述色譜條件下以20l定量杯進(jìn)樣，做峰面積與濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程Y=3.7194+10.1374x，相關(guān)系數(shù)：r=0.99

10、99，方法的最小檢測(cè)濃度0.3g/ml(按3倍信噪比計(jì))，檢測(cè)下限6.0ng。2.6精密度實(shí)驗(yàn)大隆原粉、母粉、母液、毒餌樣品各1份，按上述樣品前處理方法及測(cè)定條件做8次重復(fù)測(cè)定，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為0.59、3.45、1.02、4.11(表2)。 表2精密度實(shí)驗(yàn)(n8)樣品精密度平均值SRSD(%)原粉81.60%4.87×10-10.59母粉0.50%1.73×10-23.45母液0.52%5.34×10-31.02毒餌0.51/萬(wàn)2.10×10-24.112.7方法的準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)取精密度實(shí)驗(yàn)后已知有效成分含量的原粉、母粉、母液、毒餌樣品各15份

11、于比色管中，分成3組，每組分別加入樣品本底濃度0.5倍、1倍、2倍的大隆標(biāo)準(zhǔn)溶液，搖動(dòng)比色管，使樣品與標(biāo)準(zhǔn)溶液充分接觸。除母液外，其它樣品管置水浴中將溶劑完全揮發(fā)掉。將以上比色管按樣品處理方法的步驟制成待測(cè)溶液，再按上述色譜條件測(cè)定其回收率，每種樣品各濃度組的平均回收率、標(biāo)準(zhǔn)差、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差見(jiàn)表3。表3大隆樣品回收率實(shí)驗(yàn)(n5)樣品種類本底量(g/ml)加標(biāo)量(g/ml)平均回收率(%)標(biāo)準(zhǔn)差(s)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差(RDS%)原粉 50.025.099.341.61651.627250.050.099.721.56031.564750.0100.0100.070.80090.8003母粉 20.01

12、0.097.681.78241.824720.020.098.831.00321.015120.040.098.910.38980.3941母液 20.010.098.201.70731.738620.020.099.520.87150.875720.040.099.150.33180.3347毒餌 10.05.097.022.31292.384010.010.097.301.61011.654810.020.098.850.87140.8816綜合上述，大隆殺鼠藥用快速提取法處理樣品、HPLC定量分析，具有簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確度好、靈敏度高、節(jié)省經(jīng)費(fèi)的特點(diǎn)，適宜大批量樣品測(cè)定。該方法不僅適用于各級(jí)衛(wèi)生防病等部門的鼠藥質(zhì)量監(jiān)測(cè)工作，還可為鼠藥生產(chǎn)及用戶提供保證鼠藥質(zhì)量的可靠數(shù)據(jù)。 作者單位：天津市衛(wèi)生防病中心(郵編 300011)參考文獻(xiàn)1張一賓,張懌.農(nóng)藥.北京:中國(guó)物資出版社,1998，534.2國(guó)家技術(shù)監(jiān)督局標(biāo)準(zhǔn)化司編.中華人民共和國(guó)標(biāo)準(zhǔn)目