銀杏葉制劑對(duì)缺氧性肺動(dòng)脈高壓的影響及其與蛋白激酶C的

1、銀杏葉制劑對(duì)缺氧性肺動(dòng)脈高壓的影響及其與蛋白激酶C的關(guān)系【摘要】 目的 探討銀杏葉制劑對(duì)大鼠缺氧性肺動(dòng)脈高壓的影響及作用機(jī)制與蛋白激酶C（PKC）的關(guān)系。方法 （1） Wistar大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照（C）組、缺氧（H）組及銀杏葉治療（GBH）組（200 mgkg-1d-1，灌胃），每組7只，測(cè)其平均體、肺循環(huán)動(dòng)脈壓（mSAP、mPAP）及右心室重/（左心室重室間隔重）RV/（LVS）后，再取動(dòng)物左、右肺外肺動(dòng)脈（PA）干，觀察對(duì)500 nmol/L PKC激動(dòng)劑phorbol 1213-dibutyrate （PDBu）的時(shí)間-效應(yīng)曲線及對(duì)1011 000 nmol/L PDBu的濃度-效應(yīng)

2、曲線，以衡量PKC的功能狀態(tài)。 （2） 將18例肺葉切除患者的肺內(nèi)肺動(dòng)脈隨機(jī)分為PDBu組、PKC 抑制劑RO318220PDBu組及銀杏苦內(nèi)酯B（BN52021）PDBu組，每組6例，作對(duì)125 nmol/L PDBu的濃度-效應(yīng)曲線，以衡量PKC的功能狀態(tài)。結(jié)果 （1） 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：H組的mPAP、RV/（LVS）均分別高于C組及GBH組（P均0.05），GBH組的mPAP仍高于C組（P0.05）。在離體PA水平，H組的PKC功能狀態(tài)均分別顯著高于C組及GBH組（P均0.05）。（2） 人體標(biāo)本實(shí)驗(yàn)：在離體人肺內(nèi)PA水平，PDBu組的PKC功能狀態(tài)均分別顯著高于RO318220PDBu組及B

3、N52021PDBu組（P均0.05）。結(jié)論 銀杏葉制劑有降低慢性缺氧大鼠肺動(dòng)脈高壓、減輕右心室肥厚之效，其作用機(jī)制至少部分與抑制PKC通道的功能有關(guān)。The effect of ginkgo biloba on hypoxic pulmonary hypertension and the role of protein kinase CYANG Hui， XU Yongjian， ZHANG Zhenxiang（Respiratory Department， Tongji Hospital， Tongji Medical University， Wuhan 430030China）【Abst

4、ract】 Objective To elucidate whether the mechanism of relieving hypoxic hypertension by ginkgo biloba involves attenuation of the function of protein kinase C（PKC） signal channel Methods 1 Wistar rats were randomly divided into control（C）， hypoxic（H） and ginkgo biloba treatment（GBH）（200 mgkg-1d-1， o

5、rally） groups （n7） Each rat was first measured mean pulmonary arterial pressure （mPAP）， mean systemic arterial pressure （mSAP） and the ratio of the weight of right ventricle to that of left ventricle plus septum RV/（LVS）， then two main pulmonary artery rings were isolated to exposed to PDBu（a specif

6、ic activator of PKC） to observe the time-response curve and the dose-response curve in response to 500 nmol/L PDBu and 1011 000 nmol/L PDBu respectively to evaluate the function of protein kinase C signal channel 2 Intrapulmonary artery rings of human（IARH） from pneumolobectomy were randomly divided

7、 into PDBu， RO318220 （inhibitor of PKC）PDBu and ginkgolide B（BN52021）PDBu groups（n6）， the IARH of three groups were exposed to 125 nmol/L PDBu to achieve dose-response curves respectively Results （1） mPAP， RV/（LVS） of the H group were greater than those of C and GBH groups respectively （P0.05） mPAP

8、of GBH group was greater than that of C group （P0.05） In PA experiments， the function of protein kinase C of H group was higher than those of C and GBH groups respectively（P0.05） （2） In IARH experiments， the function of protein kinase C of PDBu group was higher than those of RO318220PDBu and BN52021

9、PDBu groups respectively（P0.05） Conclusions Ginkgo biloba can reduce chronic hypoxic pulmonary hypertension and relieve the hypertrophy of right ventricle， which is partly related to attenuation of the function of PKC signal channel【Key words】 Ginkgo biloba； Protein kinase C； Hypertension， pulmonary

10、銀杏葉制劑中的銀杏黃酮苷和銀杏苦內(nèi)酯具有降低體循環(huán)血壓、改善血液流變學(xué)、清除氧自由基等廣泛的藥理學(xué)效應(yīng)1。蛋白激酶C（PKC）信號(hào)通道是重要的細(xì)胞內(nèi)生物信號(hào)傳導(dǎo)途徑，既往研究表明，該通道在缺氧性肺血管收縮及肺血管改建兩大缺氧性肺動(dòng)脈高壓（HPAH）發(fā)病環(huán)節(jié)中均有重要地位2，3。已有的研究提示，銀杏葉制劑中尤以銀杏苦內(nèi)酯B （Ginkgolide BBN52021）可拮抗血小板活化因子（PAF）受體4，從而使PAF不能與其受體結(jié)合而激活細(xì)胞內(nèi)的PKC通道。目前，對(duì)銀杏葉的藥理研究多集中于體循環(huán)，在肺循環(huán)研究尚少，尤其是對(duì)肺動(dòng)脈PKC通道功能影響的研究國(guó)內(nèi)外更少。我們的實(shí)驗(yàn)擬觀察銀杏葉制劑對(duì)HPA

11、H大鼠肺動(dòng)脈壓及右心室肥厚的作用，并進(jìn)而探討該制劑對(duì)人及HPAH大鼠離體肺動(dòng)脈環(huán)PKC通道功能的影響，以期為闡明它對(duì)肺循環(huán)的作用及其作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)資料。材料與方法一、實(shí)驗(yàn)藥品銀杏葉制劑：（1） 銀杏葉片：江蘇揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)生產(chǎn)，每片含銀杏葉標(biāo)準(zhǔn)萃取物（EGb761）40 mg，其中含銀杏總黃酮苷24%，銀杏苦內(nèi)酯6%，以30%聚乙二醇-400溶解成混懸液灌胃。（2） BN52021（美國(guó)Sigma公司）以二甲基亞砜（DMSO）溶解，濃度為20 mg/ml。PKC特異性激動(dòng)劑phorbol 1213-dibutyrate （PDBu）及抑制劑RO318220（美國(guó)Sigma公司）用DMSO溶解

12、分裝（注：以上用DMSO溶解的試劑，浴槽內(nèi)的DMSO終濃度0.8%，經(jīng)空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)證實(shí)對(duì)血管張力無影響）。二、實(shí)驗(yàn)分組動(dòng)物部分：Wistar雄性大鼠21 只，250300 g，隨機(jī)分為3組，每組7只。（1） 正常對(duì)照組：每日以30%聚乙二醇-400 2 ml灌胃。（2） 缺氧組：按我們以往工作的方法5行常壓缺氧，8 h/d，共14 d，每日缺氧前以30%聚乙二醇-400 2 ml灌胃。（3） 銀杏葉治療組：銀杏葉片以30%聚乙二醇-400溶解成混懸液，200 mg*kg-1*d-1灌胃后同前法缺氧，8 h/d，共14 d。人體標(biāo)本部分： 人體肺內(nèi)肺動(dòng)脈取自本院胸外科肺癌切除術(shù)標(biāo)本。18例患者中

13、男13例，女5例，年齡5567歲，除肺部腫瘤外，血?dú)夥治?、肺功能、心電圖等輔助檢查未發(fā)現(xiàn)明顯異常。肺內(nèi)動(dòng)脈在盡量遠(yuǎn)離癌灶、肉眼無癌浸潤(rùn)處取材，制成直徑為2.54 mm，長(zhǎng)為23 mm的血管環(huán)，隨機(jī)分為3組，每組6例。（1） PDBu組：作人肺內(nèi)肺動(dòng)脈環(huán)對(duì)125 nmol/L PDBu的濃度-效應(yīng)曲線。（2） RO318220PDBu組：以RO318220 （5 mol/L）預(yù)孵育人肺內(nèi)肺動(dòng)脈環(huán)30 min后，同前作PDBu濃度-效應(yīng)曲線。（3） BN52021PDBu組：以BN52021（300 mol/L）預(yù)孵育人肺內(nèi)肺動(dòng)脈環(huán)30 min后，再同前法作PDBu的濃度-效應(yīng)曲線。三、實(shí)驗(yàn)方法及

14、觀察指標(biāo)動(dòng)物部分：（1） 整體水平：動(dòng)物以20%烏拉坦（0.5 ml/100 g）腹腔注射麻醉后先按孫波等6方法測(cè)定體循環(huán)動(dòng)脈壓（mSAP）及肺循環(huán)動(dòng)脈壓（mPAP），然后迅速開胸取心肺，在4 Krebs液中分離左、右肺外肺動(dòng)脈干；并分別剪下右心室、左心室及室間隔，待自然干燥后以電子天平稱重并計(jì)算右心室重/（左心室重室間隔重）RV/（LVS）以反映右心室肥厚程度。（2） 離體水平： 每只動(dòng)物分別取左、右兩段肺外肺動(dòng)脈干（長(zhǎng)22.5 mm，直徑1.52 mm），作對(duì) PDBu的時(shí)間-效應(yīng)曲線及濃度-效應(yīng)曲線，以衡量PKC通道的功能狀態(tài)。 將兩段肺動(dòng)脈環(huán)分別以兩端有拉鉤的銀絲懸于2個(gè)5 ml恒溫浴

15、槽中（其中充滿Krebs液，T37 ，pH7.40，持續(xù)通入95%O2、5%CO2混合氣體），拉鉤一端懸于張力換能器，張力信號(hào)送入多導(dǎo)生理記錄儀記錄。肺動(dòng)脈環(huán)在最適前負(fù)荷（600700 mg）下平衡1.5 h后，觀察其對(duì)5 mol/L鹽酸苯腎上腺素（PE）的反應(yīng)（取反應(yīng)峰值為P0），然后反復(fù)洗脫至張力回到基線后，分作如下處理： 時(shí)間-效應(yīng)曲線：浴槽中加入 500 nmol/L PDBu后保持1.5 h， 觀察血管張力變化，取最大張力值P1（表示為P0%）、達(dá)P1一半時(shí)對(duì)應(yīng)的時(shí)間t1/2、峰值持續(xù)時(shí)間T及在不同時(shí)間點(diǎn)（2、4、8、12、20、40、60、80 min）時(shí)張力值（表示為P0%）為指

16、標(biāo)。 濃度-效應(yīng)曲線：浴槽中累積加入PDBu，使其濃度在1011 000 nmol/L范圍遞增（取10、50、100、1 000、5 000、11 000 nmol/L 6個(gè)點(diǎn)），觀察血管張力變化，取達(dá)最大張力值一半時(shí)對(duì)應(yīng)的濃度（EC50）為指標(biāo)。人體標(biāo)本部分：同動(dòng)物標(biāo)本處理法將人體肺內(nèi)肺動(dòng)脈環(huán)懸于5 ml恒溫浴槽中記錄其張力變化。在最適前負(fù)荷（8001 200 mg）下平衡1.5 h后，觀察血管環(huán)對(duì)5 mol/L PE的反應(yīng)（峰值記為P0%）， 然后反復(fù)洗脫至張力回到基線后作如下處理：（1） PDBu組：浴槽中累積加入PDBu，使其濃度在125 nmol/L范圍內(nèi)遞增（取1、2.5、5、10

17、、25 nmol/L 5個(gè)點(diǎn)），觀察血管張力變化。（2） RO318220PDBu組：以5 mol/L RO318220預(yù)孵育血管環(huán)30 min后，同PDBu組處理。（3） BN52021PDBu組：以300 mol/L BN52021預(yù)孵育血管環(huán)30 min后，同PDBu組處理。各組取PDBu濃度-效應(yīng)曲線上在各濃度點(diǎn)的張力值（表示為P0%）及達(dá)最大張力值一半時(shí)對(duì)應(yīng)的濃度（EC50）為指標(biāo)。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：數(shù)據(jù)以s表示，組間差異的顯著性檢驗(yàn)用方差分析，兩兩比較用q檢驗(yàn)。結(jié)果一、動(dòng)物部分1mSAP、mPAP及RV/（LVS）：缺氧組的mPAP及RV/（LVS）均分別高于正常對(duì)照組及銀杏葉治療組（P

18、均0.05），銀杏葉治療組的mPAP仍高于正常對(duì)照組（P0.05），三組動(dòng)物mSAP比較差異無顯著性（P0.05，表1）。表1 三組動(dòng)物mPAP、mSAP及RV/（LVS）比較（s）組別只數(shù)mPAP（mm Hg）RV/（LVS）mSAP（mm Hg）正常對(duì)照組711.01.20.2600.020131.42.4缺氧組722.01.0*0.3600.020*134.05.5銀杏葉治療組713.41.3*#0.2700.050#130.01.4注：與正常對(duì)照組比較*P0.05，與缺氧組比較#P0.05，1 mmHg0.133 kPa2PKC通道功能狀態(tài)指標(biāo)：（1） 時(shí)間-效應(yīng)曲線：各組肺動(dòng)脈環(huán)均在

19、500 nmol/L PDBu的作用下呈時(shí)間依賴性的、緩慢增強(qiáng)而持久的收縮反應(yīng)。缺氧組的P1、T及在各時(shí)間點(diǎn)時(shí)的張力值均分別高于正常對(duì)照組及銀杏葉治療組（P均0.05），t1/2則低于后兩組（P均0.05，表2，圖1）。（2） 濃度-效應(yīng)曲線：各組肺動(dòng)脈環(huán)在1011 000 nmol/L PDBu的作用下，呈濃度依賴性收縮反應(yīng)（表3）。缺氧組在各濃度點(diǎn)的張力值均分別高于正常對(duì)照組及銀杏葉治療組（P均0.05，表3），而EC50低于后兩組（P均0.05，表2）。圖1 三組動(dòng)物肺動(dòng)脈環(huán)各時(shí)間點(diǎn)的收縮反應(yīng)表2 三組動(dòng)物肺動(dòng)脈環(huán)P1、t1/2、T及EC50的比較（s）組別只數(shù)P1（P0%）t1/2（m

20、in） T（min）EC50（nmol/L） 正常對(duì)照組7162135.90.4 590.466641缺氧組733021*3.00.4*14.21.5*14121*銀杏葉治療組714816#5.30.8# 491.2#93453#注：與正常對(duì)照組比較*P0.05，與缺氧組比較#P0.05表3 三組動(dòng)物肺動(dòng)脈環(huán)對(duì)1011 000 nmol/L PDBu濃度依賴性收縮反應(yīng)的比較（s）組別只數(shù)張力值（P0%）10（nmol/L）50（nmol/L）100（nmol/L）1 000（nmol/L）5 000（nmol/L）11 000（nmol/L）正常對(duì)照組 71.00010585126829415

21、3251850030缺氧組741.00500*15010*20015*50025*55030*58035*銀杏葉治療組70.50010#396#11611#15515#32020#49528#注：與正常對(duì)照組比較*P0.05，與缺氧組比較#P0.05二、人體標(biāo)本部分1 PDBu組與RO318220PDBu組比較：兩組人肺內(nèi)肺動(dòng)脈環(huán)均在125 nmol/L的PDBu作用下，呈濃度依賴性收縮反應(yīng)。RO318220PDBu組在各濃度點(diǎn)的張力值均低于PDBu組（P均0.05），RO318220可幾乎完全抑制肺動(dòng)脈環(huán)對(duì)PDBu的反應(yīng)（6例中有3例對(duì)PDBu無反應(yīng)，故EC50不能計(jì)算）（表4，圖2）。圖2

22、 三組人肺內(nèi)動(dòng)物各時(shí)間點(diǎn)的收縮反應(yīng)2PDBu組與BN52021PDBu組比較：兩組人肺內(nèi)肺動(dòng)脈環(huán)均在125 nmol/L的PDBu作用下，呈濃度依賴性收縮反應(yīng)。BN52021PDBu組對(duì)1、5、10 nmol/L PDBu的收縮反應(yīng)均低于PDBu組（P均0.05，表4，圖2）；該組的EC50（13.22.5） nmol/L表4 三組人肺動(dòng)脈環(huán)對(duì)125 nmol/L PDBu濃度依賴性收縮反應(yīng)的比較（s）組別例數(shù)張力值（P0%）1 nmol/L2.5 nmol/L5 nmol/L10 nmol/L25 nmol/LPDBu組661.02.8122.0 60198.09.0207.0 90220.

23、0 90RO318220PDBu組6 000.0* 11 03* 891.1* 136 15* 185 15*BN52021PDBu組621.11.8* 62010.0 7909.0*106.010.0*157.013.0注：與PDBu組比較*P0.05高于PDBu組（3.90.8） nmol/L，差異有顯著性（P0.05）。實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，BN52021單獨(dú)孵育時(shí)可引起血管環(huán)靜息張力基線下漂（資料未顯示），即可引起人肺內(nèi)肺動(dòng)脈環(huán)一定程度的舒張。討論銀杏黃酮苷和銀杏苦內(nèi)酯是銀杏葉主要的藥理成分，具有降低體循環(huán)血壓、改善血液流變學(xué)、清除氧自由基等廣泛的藥理學(xué)效應(yīng)。本組實(shí)驗(yàn)對(duì)慢性缺氧大鼠予銀杏葉標(biāo)準(zhǔn)

24、萃取物（EGb761）制劑灌胃2周，發(fā)現(xiàn)該制劑可部分降低慢性缺氧大鼠的肺動(dòng)脈高壓、減輕其右心室肥厚，而對(duì)大鼠平均體循環(huán)動(dòng)脈壓無明顯影響，與個(gè)別文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致7。PKC 信號(hào)通道是重要的細(xì)胞內(nèi)生物信號(hào)傳導(dǎo)途徑， 對(duì)血管平滑肌的舒縮、增殖均具有重要的調(diào)節(jié)作用。慢性缺氧可致該酶活性增高、酶量增多而參與缺氧性肺血管收縮和肺血管重建過程，在HPAH發(fā)病中有重要地位。本組實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，銀杏葉治療組大鼠比缺氧組離體肺動(dòng)脈環(huán)的PKC通道功能狀態(tài)明顯下調(diào)，提示銀杏葉制劑降低慢性缺氧大鼠肺動(dòng)脈高壓、減輕右心室肥厚的藥理學(xué)機(jī)制涉及抑制肺動(dòng)脈平滑肌PKC通道的功能。 PKC通道被PDBu激活后，可引起人肺內(nèi)肺動(dòng)脈環(huán)異常

25、增強(qiáng)而持久的收縮，而該酶活性被RO318220特異性阻斷后，收縮反應(yīng)顯著降低；人肺內(nèi)肺動(dòng)脈環(huán)經(jīng)BN52021預(yù)處理后對(duì)PKC特異性激動(dòng)劑反應(yīng)顯著下降。表明PKC通道在人肺內(nèi)肺動(dòng)脈平滑肌張力調(diào)節(jié)的細(xì)胞內(nèi)生物信號(hào)傳導(dǎo)中有重要地位。銀杏葉制劑下調(diào)肺動(dòng)脈PKC通道功能的具體機(jī)制尚不清楚。已有研究證實(shí)，銀杏葉制劑中成分BN52021是天然的PAF受體特異性拮抗劑8而PAF受體信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制屬甘油二酯（DG）、三磷酸肌醇（IP3）和Ca2的信使體系9。PAF與其受體結(jié)合后可激活磷酸肌醇特異性的磷脂酶C，繼而催化質(zhì)膜上磷脂酰肌醇水解， 產(chǎn)生DG和IP3，DG可迅速激活PKC，通過PKC對(duì)其底物的磷酸化而引發(fā)細(xì)

26、胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)傳遞，從而產(chǎn)生血管平滑肌收縮、增殖等生物學(xué)效應(yīng)。因此我們推測(cè)BN52021抑制肺動(dòng)脈PKC通道功能的具體作用機(jī)制可能與其阻斷PAF的功效有一定關(guān)系，但尚待研究證實(shí)。至于它能否通過其它機(jī)制抑制PKC通道的功能或拮抗PKC通道激活后的效應(yīng)而起到一定程度的抑制HPAH的作用，亦尚有待研究。志謝 承蒙同濟(jì)醫(yī)院胸外科陳啟福、湯應(yīng)雄、潘鐵成和趙金平教授協(xié)助收集人肺內(nèi)肺動(dòng)脈標(biāo)本，特致謝基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（39770341）和國(guó)家教委留學(xué)回國(guó)人員科研啟動(dòng)基金資助項(xiàng)目（97436）參考文獻(xiàn)1劉玲玲，于心若 銀杏藥用價(jià)值 中草藥，1994，25：219-2212劉琰， 徐永健， 張珍祥，等 蛋白激酶C激活劑對(duì)缺氧性肺動(dòng)脈高壓大鼠離體肺動(dòng)脈環(huán)反應(yīng)性的影響 中華結(jié)核