鹿筋膠原抗炎免疫作用研究

1、鹿筋膠原抗炎免疫作用研究【摘要】目的研究鹿筋膠原的抗炎免疫作用。方法通過(guò)大鼠足腫脹模型和大鼠棉球肉芽腫模型研究鹿筋膠原的抗炎作用;通過(guò)觀察小鼠對(duì)2，4二硝基氯苯(DNCB)所致的遲發(fā)型超敏反應(yīng)(DTH)的影響和網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬功能的影響研究鹿筋膠原的免疫調(diào)節(jié)作用。結(jié)果鹿筋膠原能有效地抑制角叉菜膠引起的足腫脹;減輕棉球肉芽腫產(chǎn)生的炎癥反應(yīng);提高二硝基氯苯所致小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)和小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能。結(jié)論鹿筋膠原具有明顯的抗炎、免疫調(diào)節(jié)作用。 【關(guān)鍵詞】 鹿筋膠原; 抗炎; 免疫調(diào)節(jié)鹿筋作為鹿產(chǎn)品的一種,是鹿科動(dòng)物梅花鹿Cervus nippon Temminck或馬鹿C.elaphus L.的四

2、肢干燥筋，始載于唐本草,用于治療腎虛手足無(wú)力、風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛、勞損、轉(zhuǎn)筋等癥1，而鹿筋中的主要成分是膠原蛋白2。膠原是結(jié)締組織極其重要的的結(jié)構(gòu)蛋白，起著支撐器官、保護(hù)機(jī)體的功能，是決定結(jié)締組織韌性的主要因素。膠原與組織的形成、成熟、細(xì)胞間信息的傳遞、細(xì)胞增生、分化、運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞免疫、腫瘤轉(zhuǎn)移以及關(guān)節(jié)潤(rùn)滑等有密切關(guān)系，也與一些結(jié)締組織膠原病的發(fā)生密切相關(guān)3。膠原蛋白對(duì)關(guān)節(jié)癥等膠原病具有很好的預(yù)防及治療作用4。目前研究鹿筋膠原的相關(guān)報(bào)道很少，本研究主要研究鹿筋膠原的抗炎免疫調(diào)節(jié)作用，以期待為新藥開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。1 材料與儀器1.1 鹿筋膠原制備梅花鹿鹿筋(市售)去肉、皮、毛后，采用醋酸浸提使其膨脹，水

3、煮提取，胃蛋白酶酶解，離心，上清液凍干，即得鹿筋膠原蛋白，膠原蛋白含量為80%。1.2 動(dòng)物Wistar大鼠，雄性，體質(zhì)量180220 g，由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(SCXK-吉-2008-0005);昆明種小鼠，雌雄兼用，體重1822 g，由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(SCXK-2008-0001)。1.3 試劑1%角叉菜膠，實(shí)驗(yàn)室配置;丙酮(分析級(jí))、乙酸(分析級(jí))、2, 4-二硝基氯苯(DNCB)(分析級(jí))，上海佘山化工廠產(chǎn)品;一得閣墨汁(一得閣生理鹽水=15，過(guò)濾)。1.4 儀器AEL-200型電子天平，日本島津株式會(huì)社產(chǎn)品;DT100型和DT2000型電子天平，美國(guó)雙杰產(chǎn)品

4、; 751-G型紫外分光光度計(jì)，上海分析儀器廠產(chǎn)品; S658電熱恒溫水溫箱, 吉林農(nóng)安產(chǎn)品;GZX-9076MBE數(shù)顯鼓風(fēng)烘干箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠產(chǎn)品;電子秒表，上海手表廠產(chǎn)品。2 方法2.1 鹿筋膠原抗炎作用的藥理實(shí)驗(yàn)研究2.1.1 鹿筋膠原對(duì)角叉菜膠所致大鼠足腫脹的影響取雄性大鼠40只，按體質(zhì)量隨機(jī)分為4組，即模型對(duì)照組，鹿筋膠原高、中、低劑量組。模型對(duì)照組按10 mlkg-1劑量灌胃蒸餾水，鹿筋膠原組按0.4，0.2，0.1 gkg-110 ml-1劑量灌胃給予鹿筋膠原，連續(xù)灌胃7 d，末次給藥30 min后，在大鼠右后足掌腱膜下注射1%角叉菜膠0.1 ml/只，分別于致

5、炎后0.5，1，2，4，6，8，24 h測(cè)量致炎足跖周長(zhǎng)，計(jì)算給藥前后足跖周長(zhǎng)的差值，即為腫脹度。2.1.2 鹿筋膠原對(duì)大鼠棉球肉芽腫的影響取雄性大鼠40只，腹腔注射戊巴比妥鈉35 mg/kg，麻醉，消毒，于腋下左右兩側(cè)埋入重量(201)mg的無(wú)菌棉球(青霉素0.2 mg/ml，浸泡，烘干)各一個(gè)。于術(shù)后2h按體質(zhì)量隨機(jī)分為4組，即模型對(duì)照組，鹿筋膠原高、中、低劑量組。給藥劑量與方式同“2.1.1”，灌胃給藥1次/d。7 d后，處死大鼠，仔細(xì)剝離并取出棉球，在60、12 h烘干，稱(chēng)重。肉芽腫重量(mg)=術(shù)后棉球的重量(mg)-術(shù)前棉球的重量(mg)。2.2 鹿筋膠原免疫調(diào)節(jié)作用的藥理實(shí)驗(yàn)研究

6、2.2.1 鹿筋膠原對(duì)DNCB致小鼠遲發(fā)性超敏(DTH)反應(yīng)的影響取小鼠40只(雌雄各半)，在小鼠背部皮下注射1.25%二硝基氯苯丙酮液0.02 ml/只以致敏，24 h后，按體質(zhì)量隨機(jī)分為4組，即模型對(duì)照組，鹿筋膠原高、中、低劑量組。模型對(duì)照組按10 mlkg-1劑量灌胃蒸餾水，鹿筋膠原組按0.6，0.3，0.15gkg-110ml-1劑量灌胃給鹿筋膠原，1次/d，連續(xù)給藥9 d，第10天以0.25%二硝基氯苯丙酮液作對(duì)照，38 h后以踝關(guān)節(jié)處剪下兩足，于電子天平上稱(chēng)重，以?xún)勺愕闹亓坎钪禐槟[脹度作為遲發(fā)型超敏反應(yīng)(DTH)的指標(biāo)。2.2.2 鹿筋膠原對(duì)小鼠網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬功能的影響取小鼠40

7、只(雌雄各半)，按體質(zhì)量隨機(jī)分為4組，即模型對(duì)照組，鹿筋膠原高、中、低劑量組。給藥劑量與方式同“2.2.1”，1次/d，連續(xù)灌胃7d，于末次給藥后1 h，做碳粒廓清功能實(shí)驗(yàn)。小鼠尾靜脈注射一得閣墨汁，于注射后2，10 min分別從內(nèi)眥靜脈叢取血20l，并立即將其加到2ml 0.1%Na2CO3溶液中。用721分光光度計(jì)在600 nm處測(cè)光密度值(OD)，以Na2CO3溶液做空白對(duì)照，計(jì)算單位時(shí)間內(nèi)血清中碳粒廓清速度，同時(shí)摘取肝臟和脾臟稱(chēng)重以校正K值。吞噬指數(shù)計(jì)算方法：k=(1gOD1-1gOD2)/(t2-t1,)，吞噬指數(shù)()=體質(zhì)量/(肝重+脾重)k1/3，數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)。2.3 統(tǒng)計(jì)方法

8、計(jì)算資料均采用表示，模型對(duì)照組與正常對(duì)照、各給藥組與模型對(duì)照組之間差異采用t檢驗(yàn)。3 結(jié)果3.1 鹿筋膠原抗炎作用3.1.1 鹿筋膠原對(duì)大鼠角叉菜膠引起的足腫脹的影響由表1得知，致炎后模型對(duì)照組大鼠足跖明顯腫脹，與鹿筋膠原組相比有顯著性差異(P0.05，P0.01)，提示鹿筋膠原具有減輕大鼠足跖腫脹作用。藥物起效時(shí)間在致炎30 min后，4 h作用最強(qiáng)，8 h后作用逐漸降低，說(shuō)明鹿筋膠原有較好的抗炎作用。3.1.2 鹿筋膠原對(duì)大鼠棉球肉芽腫的影響從表2得知，與模型對(duì)照組比較，鹿筋膠原中、高劑量組能顯著抑制棉球引起的肉芽腫(P0.05，P0.01)。3.2 鹿筋膠原免疫調(diào)節(jié)作用3.2.1 鹿筋膠

9、原對(duì)DNCB致小鼠遲發(fā)性超敏(DTH)反應(yīng)的影響由表3可知，鹿筋膠原中、低劑量組與模型對(duì)照組比較，腫脹度有不同程度的升高。說(shuō)明鹿筋膠原在一定劑量上可促進(jìn)二硝基氯苯所致小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)，增強(qiáng)小鼠的免疫力。表1 鹿筋膠原對(duì)大鼠角叉菜膠引起的足腫脹的影響表2 鹿筋膠原對(duì)大鼠棉球肉芽腫的影響表3 鹿筋膠原對(duì)小鼠超敏反應(yīng)足腫脹的影響3.2.2 鹿筋膠原對(duì)小鼠網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬功能的影響 由表4可知，與模型對(duì)照組比較，鹿筋膠原組顯著提高小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能(P0.05，P0.01)，且不同劑量間存在一定的量效關(guān)系。4 討論免疫與炎癥雖是機(jī)體對(duì)異物的兩種不同反應(yīng),但有著內(nèi)在的聯(lián)系,某些作用機(jī)制實(shí)為兩者所共有

10、5。這是因?yàn)樗鼈兩婕傲嗽S多共同的細(xì)胞類(lèi)型、細(xì)胞因子、化學(xué)介質(zhì)、發(fā)病機(jī)理和神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)機(jī)制等。免疫不僅可使炎癥反應(yīng)增強(qiáng)或起始加速,還可調(diào)節(jié)炎癥過(guò)程6。因此本實(shí)驗(yàn)在觀察受試藥物抗炎作用的同時(shí),還初步研究了該藥物對(duì)免疫功能的影響,以便更好地闡明鹿筋膠原的抗炎免疫藥理作用。表4 鹿筋膠原對(duì)小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)的影響在本實(shí)驗(yàn)研究中，鹿筋膠原對(duì)急性抗炎實(shí)驗(yàn)角叉菜致大鼠足腫脹、慢性抗炎實(shí)驗(yàn)大鼠棉球致肉芽腫都有顯著的治療作用;在免疫調(diào)節(jié)作用中，能提高二硝基氯苯所致小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)和單核巨噬細(xì)胞的吞噬功能，從而提高小鼠的自身免疫功能。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果，為鹿筋膠原的臨床應(yīng)用提供了藥理學(xué)參考。【參考文獻(xiàn)】 1 蘇 敬.唐本草M.上海：上海衛(wèi)生出版社, 1957:210.2 蔣挺大,張春萍.膠原蛋白M.北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2006：3.3 劉邦強(qiáng)，盧 振，高 音，等.三品同名異物鹿筋的代替使用鑒別及應(yīng)用J.中國(guó)民族民間醫(yī)藥雜志，2005，14(