植物組織培養(yǎng)中的褐變現(xiàn)象與防止方法

1、 植物組織培養(yǎng)中的褐變現(xiàn)象及其防止措施 摘要：細(xì)胞受損后，由于細(xì)胞區(qū)隔作用被破壞，毒性酚類或其氧化物醌類物質(zhì)毒害細(xì)胞，導(dǎo)致組織褐變，植物組織培養(yǎng)過程中培養(yǎng)低效或失敗。目前認(rèn)為組織培養(yǎng)中褐變程度主要受外植體材料的基因型、生理狀態(tài)、種類、大小、預(yù)處理、培養(yǎng)條件、培養(yǎng)基及培養(yǎng)方式的影響。在目前的研究中控制褐變的有效方法主要有低溫培養(yǎng)、暗培養(yǎng)、勤轉(zhuǎn)種、添加抗氧化劑、增效劑或吸附劑于培養(yǎng)基中等。關(guān)鍵詞:植物;組織培養(yǎng);褐變;防治方法褐變是植物組織培養(yǎng)中一種普遍存在的現(xiàn)象，是由于組織中多酚氧化酶被激活，使細(xì)胞酚類物質(zhì)被氧化而產(chǎn)生棕褐色醌類物質(zhì)，這種褐變現(xiàn)象又被稱為酚污染。多酚類物質(zhì)及其氧化物醌類物質(zhì)會(huì)抑制

2、其它酶的活性，從而毒害整個(gè)外植體，嚴(yán)重影響外植體的脫分化、再分化和生長。褐變這種現(xiàn)象與菌類污染和過度含水化(即玻璃化)并稱植物組織培養(yǎng)的3大難題。目前褐變已成為植物組織培養(yǎng)發(fā)展的一大障礙1。 1褐變現(xiàn)象的原因1.1 非酶促褐變 非酶促褐變是由于細(xì)胞受脅迫或其他不利條件影響所造成的細(xì)胞程序化死亡或自然發(fā)生的細(xì)胞死亡，即壞死形成的褐變現(xiàn)象，并不涉及酚類物質(zhì)的產(chǎn)生。諸多不利條件都可以造成細(xì)胞的程序化死亡，但這種褐變?nèi)舨扇∵m當(dāng)措施或者愈傷組織適應(yīng)了脅迫環(huán)境就不再發(fā)生。1.2 酶促褐變 多數(shù)認(rèn)為，植物組織培養(yǎng)中的褐化現(xiàn)象主要是由酶促褐變引起的，即由多酚氧化酶( PPO，Polyphenol Oxidas

3、e)作用于天然底物酚類物質(zhì)而引起的。在正常條件下,細(xì)胞中的酚和醌之間保持一種動(dòng)態(tài)平衡,醌類物質(zhì)水平較低;而酚氧化酶及其底物分布在正常組織的不同部位，酚類物質(zhì)分布在細(xì)胞的液泡內(nèi)，酶則分布在各種質(zhì)體或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，這種區(qū)域性分布致使底物與酶被質(zhì)膜分隔開來；但當(dāng)外植體或培養(yǎng)材料處于機(jī)械損傷等逆境，或細(xì)胞受傷或衰老時(shí)，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)或細(xì)胞 中物質(zhì)區(qū)域化分布的破壞會(huì)導(dǎo)致酚氧化酶釋放或合成，如果此時(shí)在合適的pH和溫度等條件下，酚氧化酶、酚類(底物)和氧發(fā)生酶促氧化反應(yīng)，形成有毒的棕褐色醌類物質(zhì),從而使組織發(fā)生褐變。此外，組織的老化或病變也可激活酚氧化酶而引起褐變。一般認(rèn)為,褐化是指外植體或培養(yǎng)材料接種后在組織培養(yǎng)

4、過程中， 由于切割造成機(jī)械損傷,傷口處分泌出酚類化合物，在有氧的條件下，切面細(xì)胞中的酚類物質(zhì)為多酚氧化酶催化,氧化為醌,醌再通過非酶促反應(yīng)產(chǎn)生有色物質(zhì)而導(dǎo)致組織褐變,變成棕褐色或暗褐色,并逐漸擴(kuò)散到培養(yǎng)基中,抑制細(xì)胞內(nèi)其它酶的活性,影響細(xì)胞的正常代謝,毒害整個(gè)組織,甚至導(dǎo)致組織死亡。尤其是木本植物組織的外植體褐變死亡是其培養(yǎng)難度較大的主要因素。因此,探討褐化發(fā)生的機(jī)制及其影響因素,采取有效的防止褐化的措施,是保證植物組織培養(yǎng)成功 的關(guān)鍵所在。 2影響褐變的因素 2.1基因型 不同種植物、同種植物的不同類型或品種，在組織培養(yǎng)中發(fā)生褐變的頻率和程度都存在差異。這是由于各種植物表達(dá)的多酚類物質(zhì)種類、

5、含量以及酚氧化酶的種類、活性存在差異，有些植物種類組織培養(yǎng)較易成功，有些則很困難。一般木本植物的酚類化合物含量比草本植物高，因而在組培過程中更容易發(fā)生褐變。例如在相同的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)培養(yǎng)，孝順竹比小佛肚竹和風(fēng)尾竹更易褐變2。2.2外植體生理狀態(tài) 材料本身的生理狀態(tài)不同，接種后褐變的程度也不同。通常分生部位接種后形成醌類物質(zhì)少而分化的部分形成醌類物質(zhì)較多，褐變隨著材料的組織木質(zhì)化程度和年齡而增加。 植物體內(nèi)酚類化合物的含量受到取材時(shí)間的影響。例如，柿的嫩芽莖尖的多酚氧化酶活性顯著高于休眠芽，以嫩枝莖尖為外植體進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)易褐變死亡3。同年6月份所取的核桃半木質(zhì)化新植莖芽萌發(fā)率高于冬季休眠芽和4月份嫩

6、枝莖芽腋芽，且褐變率及褐變死亡率都較后兩者低4。2.3外植體的種類和大小 一般認(rèn)為，木本植物較草本植物的外植體在培養(yǎng)過程中更容易發(fā)生褐變。外植體小的材料，由于切口所占比例較大而較易發(fā)生褐變。切口越大，酚類物質(zhì)被氧化的面積就越大， 褐變程度越嚴(yán)重5。2.4材料的預(yù)處理 材料在接種前經(jīng)過一定預(yù)處理可減輕外植體在培養(yǎng)中的褐變。預(yù)處理一般有低溫或黑暗條件下預(yù)培養(yǎng)；外植體在水或抗氧化劑中切割或浸泡，以減少外植體與氧的接觸和使水溶性多酚和醌類物質(zhì)充分的滲出外植體。例如竹在培養(yǎng)時(shí)外植體在無菌水或半胱氨酸(100mg/L) 溶液中浸泡 24 h有利于控制褐變6；魔芋培養(yǎng)過程中，在1%的檸檬酸溶液中切割外植體，

7、可有效抑制外植體褐變；黑暗預(yù)處理能減輕蝴蝶蘭R4品種葉片外植體的褐變程度，其中以預(yù)處理10d的褐變最輕;未經(jīng)暗處理的褐變最重且多酚氧化酶(PPO)活性最大7。2.5培養(yǎng)條件 培養(yǎng)過程中,低溫比高溫有利于抑制褐變，高溫會(huì)促進(jìn)酚類氧化;而低溫抑制酚類合成， 降低多酚氧化酶的活性,減少酚類氧化。暗培養(yǎng)或弱光培養(yǎng)對(duì)抑制褐變也有一定的作用。例如小佛肚竹在暗培養(yǎng)和弱光(800Lx)下培養(yǎng)的莖尖和莖段的褐變率比在強(qiáng)光(200Lx)下培養(yǎng)有所下降。2.6培養(yǎng)基及培養(yǎng)方式 培養(yǎng)基中過高的糖、絲氨酸濃度會(huì)加劇褐變8。在相同濃度下，蔗糖對(duì)褐變的抑制效果要優(yōu)于葡萄糖。礦質(zhì)元素也對(duì)褐變存在影響，在蝴蝶蘭初代過程中，培養(yǎng)

8、基中Fe3+、Cu2+,濃度越高，褐變?cè)絿?yán)重。這是由于Fe3+、Cu2+可作為催化劑加速多酚與活性氧(ROS)作用而被氧化為醌類物質(zhì)。棉花胚性愈傷組織培養(yǎng)基中，氮源配比不合適也會(huì)引起褐變。曼地亞紅豆杉愈傷組織誘導(dǎo)及繼代過程中，培養(yǎng)基pH值的變化可引起酚類與酚氧化酶結(jié)合部位的改變， 從而影響酚類的氧化程度。而細(xì)胞分裂素類激素能促進(jìn)酚類化合物的合成或刺激多分氧化酶活性提高,加速褐變。例如，隨著6-BA使用濃度增加，可增加牡丹培養(yǎng)中腋芽外植體的褐變和死亡數(shù)。在培養(yǎng)基中加入抗氧化物質(zhì)可有效降低褐變，例如在對(duì)東方杉愈傷組織培養(yǎng)基中加入抗壞血酸250mg/L，亞硫酸鈉250mg/L，檸檬酸5000mg/L

9、組合能有效降低褐變;茶條槭帶芽莖段進(jìn)行芽增殖培養(yǎng)的培養(yǎng)基中加入1/2該組合也能有效降低污染和控制褐變。在蝴蝶蘭無菌苗培養(yǎng)基中添加200mg/L谷胱甘肽對(duì)分化生長和減少褐變綜合效果好;Vc和硫代硫酸鈉對(duì)褐變抑制作用強(qiáng),同時(shí)也抑制外植體生長分化;活性炭抑制褐變效果好,但抑制分化。不同的培養(yǎng)方式引起褐變的程度不同，提高愈傷組織和培養(yǎng)基接觸面的氧氣供給有利于抑制褐變，減少多酚分泌型外植體材料四周的多酚類物質(zhì)也有利于減少褐變。有利抑制褐變的培養(yǎng)方式，對(duì)不同植物是不同的。例如曼地亞紅豆杉以珍珠巖基質(zhì)上覆蓋濾紙條培養(yǎng)效果最好；而核桃采用液態(tài)培養(yǎng)基可減輕外植體的褐變。在蝴蝶蘭培養(yǎng)中 1015d轉(zhuǎn)瓶,更換新鮮培

10、養(yǎng)基,褐變的比率可明顯降低。在桑樹培養(yǎng)中,當(dāng)轉(zhuǎn)種周期為15d時(shí)褐變率為10%，轉(zhuǎn)種周期為30d褐變率為66%9。3防止褐變的措施 3.1選擇適宜的外植體和培養(yǎng)條件 成功的經(jīng)驗(yàn)表明，選擇適當(dāng)?shù)耐庵搀w并建立最佳的培養(yǎng)條件是克服材料褐變的最主要手段10。選擇適宜的外植體，材料的年齡、取材部位、材料的大小及外植體受傷害程度等均能對(duì)褐變產(chǎn)生影響。外植體材料應(yīng)有較強(qiáng)的分生能力，在最適宜的細(xì)胞脫分化與再分化的條件下，使外植體處于旺盛的生長狀態(tài)，便可大大減輕褐變。一般情況下，取幼齡樹新萌發(fā)嫩枝條的帶芽莖段、嫩葉或莖尖作為外植體，也可采用幼胚來培養(yǎng)。另外對(duì)于某個(gè)種的植物進(jìn)行培養(yǎng)前，在不影響培樣目的的情況下，應(yīng)篩

11、選褐變低的基因型個(gè)體。在培養(yǎng)條件的許多因子中，較為重要的是適宜的元機(jī)鹽成分、適宜的蔗糖濃度及激素水平。培養(yǎng)早期的培養(yǎng)基中應(yīng)含較低濃度的元機(jī)鹽，降低Fe和Cu濃度或不用這兩種離子； 在保證正常培養(yǎng)的需求下使用低濃度細(xì)胞分裂素；愈傷組織或細(xì)胞培養(yǎng)物為異養(yǎng)型，應(yīng)使培養(yǎng)物獲得充足的氧氣，以利于分化和生長。 適宜的溫度及在黑暗條件下進(jìn)行培養(yǎng)也可減輕材料的褐變。易發(fā)生褐變的外植體，可先于低溫(420)預(yù)培養(yǎng)數(shù)小時(shí)，也可于黑暗或弱光照下預(yù)培養(yǎng)數(shù)日后再轉(zhuǎn)入正常培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。外植體受傷害程度直接影響褐變，切割時(shí)應(yīng)盡可能減小傷口面積，并縮短切口在空氣中的暴露時(shí)間。隨著pH增高，多酚被氧化的作用增強(qiáng)，因此培養(yǎng)基p

12、H值應(yīng)控制在6.0以下。組織培養(yǎng)的一些材料產(chǎn)生水解型多酚，這類外植體在培養(yǎng)過程中會(huì)由于多酚類物質(zhì)分泌到培養(yǎng)基中使培養(yǎng)基的顏色加深，并進(jìn)一步氧化為醌類物質(zhì)，而多酚類物質(zhì)及相應(yīng)的醌類物質(zhì)會(huì)抑制多種酶的活性，從而阻礙外植體對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的主動(dòng)吸收和轉(zhuǎn)化。對(duì)于培養(yǎng)初期多酚類物質(zhì)合成分泌的材料可以在液體培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)一段時(shí)間，使酚類物質(zhì)充分分泌到培養(yǎng)基中，減少外植體內(nèi)和外植體周圍的多酚物質(zhì)。對(duì)于培養(yǎng)過程中多酚類物質(zhì)不斷合成的材料在培養(yǎng)中要進(jìn)行轉(zhuǎn)移外植體到新鮮培養(yǎng)基中，一般轉(zhuǎn)移周期在2周左右。3.2使用抗氧化劑或增效劑 組織培養(yǎng)時(shí)，在培養(yǎng)基中加入抗氧化劑、增效劑培養(yǎng)或預(yù)培養(yǎng)，使用抗氧化劑和增效劑對(duì)材料進(jìn)行預(yù)處

13、理，可抑制外植體的酶促褐變。目前在培養(yǎng)基中一般單獨(dú)或組合添加VC、VE、-胡蘿卜素、硫代硫酸鈉、巰基乙醇、酒石酸、檸檬酸、亞硫酸鹽、植酸、二硫蘇糖醇等。VC和檸檬酸主要在早期起作用，隨培養(yǎng)時(shí)間延長作用消退，亞硫酸鈉在中后期作用較好，但亞硫酸鹽對(duì)植物具有一定毒害作用，不宜單獨(dú)添加。也可在有抗氧化劑或增效劑的無菌溶液中切割材料后再接種，這類處理適用于外植體切割后快速氧化的材料?？寡趸镔|(zhì)對(duì)外植體的培養(yǎng)會(huì)起到一定的副作用，培養(yǎng)基添加濃度不宜過高，一般在200mg/L以下,且多用于初期培養(yǎng)而不宜長期培養(yǎng)。還原性抗氧化劑在使用時(shí)應(yīng)注意保持其還原性，因此一般最好過濾除菌使用，而不與培養(yǎng)基一起高溫滅菌。3.

14、3使用吸附劑在培養(yǎng)基中加入吸附劑可以抑制褐變。吸附劑有聚乙烯吡略烷酮(PVP)和活性炭(AC) 等，活性炭是吸附性較強(qiáng)的元機(jī)吸附劑，但在使用過程中，應(yīng)盡量使用最小濃度來防止褐變，因?yàn)榛钚蕴康奈阶饔檬菬o選擇性的，活性炭濃度一般在0.10.5%之間。PVP是酚類物質(zhì)的專一吸附劑，其對(duì)酚的結(jié)合強(qiáng)于酶蛋白的結(jié)合，因而可使酶從多酚 一酶復(fù)合物中結(jié)合出來，從而使酶的抑制消除。但隨著 PVP用量的增加，大部分組織培養(yǎng)物之增殖率也隨之下降，這可能是由于PVP在吸附培養(yǎng)基中引起褐變的物質(zhì)之外，還吸附了部分植物激素。PVP濃度一般在0.3%左右11。3.4其它3.4.1改變培養(yǎng)基的狀態(tài) 如采用濾紙橋培養(yǎng)可使外植

15、體溢出的有毒物質(zhì)很快擴(kuò)散到液體培養(yǎng)基中，對(duì)外植體危害較輕；或采用液體培養(yǎng)、半固體培養(yǎng)、液體培養(yǎng)與固體培養(yǎng)交替進(jìn)行培養(yǎng)等也能減輕褐變的危害。3.4.2選擇適宜的接種方式 把培養(yǎng)體切面浸入培養(yǎng)基中，減少了褐化發(fā)生的表面積，且較大組織切塊的創(chuàng)傷面積相對(duì)較小，有利于保持轉(zhuǎn)培初期切塊淺表層細(xì)胞或組織處于原來的生長發(fā)育狀態(tài)，從而減輕了因切面褐變帶來的毒害作用。3.4.3通過試驗(yàn)選擇適宜的消毒方式可減少對(duì)外植體的傷害程度，從而減輕褐化程度。3.4.4添加天然附合物有試驗(yàn)表明，添加10%椰子水可提高洋蘭原球莖的存活率，減少褐變死亡現(xiàn)象12。4抗褐變研究展望 目前對(duì)于多酚類物質(zhì)系統(tǒng)的研究及應(yīng)用主要集中在植物化學(xué)

16、，食品、制革、精細(xì)化工領(lǐng)域，集中于對(duì)多酚的生產(chǎn)應(yīng)用，而在活細(xì)胞中的生化動(dòng)態(tài)代謝機(jī)理及其對(duì)細(xì)胞的作用研究很少。目前國內(nèi)植物組織培養(yǎng)關(guān)于褐變的研究文獻(xiàn)中，多數(shù)是針對(duì)具體材料進(jìn)行試驗(yàn)性處理，處理的抗褐變物質(zhì)種類多樣，且各種試劑配比、濃度、及具體作用差別較大。部分研究開始對(duì)總酚含量、多酚氧化酶活性、過氧化物酶活性、可溶糖含量、可溶蛋白含量進(jìn)行測定。測定褐變組織中具體多酚類物質(zhì)種類及其相關(guān)基因研究的報(bào)道極少。由于植物種甚至品種，由于基因型不同所產(chǎn)生的酚類物質(zhì)種類和量都有不同，而不同的酚類物質(zhì)對(duì)細(xì)胞的毒害作用機(jī)理不一樣且比較復(fù)雜，從而造成在培養(yǎng)過程中解決辦法的多樣化。因此，可著手于測定分析引起褐變的多酚類

17、物質(zhì)的種類，分析其危害細(xì)胞的生化原理，從根本上找出合理的解決方法，以形成完整體系。參考文獻(xiàn)1 石碧,狄瑩.植物多酚M.北京:科學(xué)出版社2000.2 顧小平,蘇夢云等.幾種從生竹愈傷組織誘導(dǎo)與防褐變技術(shù)研究J.林業(yè)科學(xué)研究.2005,19 (1).3 張妙霞.柿樹組織培養(yǎng)防止外植體褐變的研究J.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),1999,33(1).4 Bonga J M,Durzan D J著.樹木組織培養(yǎng).闕國寧等譯M.北京:中國林業(yè)出版社1988.5 張小紅,代侃韌等.核桃離體培養(yǎng)中外植體褐變的研究J .陜西林業(yè)科技 ,2005,4.6 孫敬三,桂耀林.植物細(xì)胞工程技術(shù)M.北京:科學(xué)出版社1995.7 趙伶俐,范崇輝等.黑暗預(yù)處理對(duì)蝴蝶蘭組培中外植體褐變的影響J.西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2006, 15(5).8 張明文,陳力耕.銀杏組織培養(yǎng)中控制褐變的研究J.中國南方果樹,2