應用寡核苷酸芯片進行HLADQA1位點基因分型

1、百度文庫-好好學習.天天向上應用寡核甘酸芯片進行HLA-DQA1位點基因分型作者：王彤，王天驕，何群，張玉魁，馬佳明，侯偉建，王紹成，潘忠誠，趙雨杰【摘要】為了構建HLA-DQA1位點寡核甘酸分型芯片并籍此建立一種應用于HLA系統(tǒng)基因分型的集成化技術平臺，在多態(tài)性集中的HLA-DQA1第二外顯子區(qū)域，自行設計一套寡核苜酸分型探針；采用本實驗室自建的方法，制成寡核甘酸芯片。提取的基因組DNA以組間特異性引物，單側引物熒光標記，行不對稱擴增。雜交后掃描檢測分析雜交信號，確定HLA等位基因型；分型結果以標準DA和PCR產物測序檢測。結果表明：100例樣本芯片分型全部成功，其中50例標準DXA與其模板

2、相符,另50例臨床樣本中隨機選取的10例與其測序結果相符，其中2例分型結果不完全；重復雜交實驗中，位點重現(xiàn)率95%。結論：研制的HLA-DQA1等位基因分型芯片，其準確性和重現(xiàn)性理想，且操作簡便、快捷，有廣泛的應用前景。【關鍵詞】基因分型HLA-DQA1GenotypingbyUsingOligonucleotideMicroarraysAbstractInordertofabricatetheHLA-DQA1genotypingchipanddevelopanintegrated,paralleltechnicalplatformtotypeHLAsystem,apairofprimersa

3、ndasetofprobesweredesignedaccordingtothesequencesofHLA-DQA1exon2,wherethepolymorphismisconcentrated.Theoligonucleotidechipwasmadewiththemethodsdevelopedinourlaboratory.ThetargetDNAwasasymmetricallyamplifiedwiththelabeledsenseprimer.Thesignalswerescannedandanalyzedafterthehybridizationbetweenmicroarr

4、ayandPCRproduct.Thealleletypesofthesampleswereidenlified.TheresultwasverifiedbythestandardDXAandDNAsequencing.Theresultsshowedthatthegenotypingwassuccessfullycarriedoutin50standardDXAsamplesand50clinicalsamples.Amongthem,resultsofthe50standardDNAsamplesmatchedtheirtemplates.Intheother50samples,resul

5、tsoftherandomlyselected10matchedtheirsequencingresultsexceptthattwoofthemgottheincompletelyresult.Inreproducibletests,thesignalreappearratewas95%.ItisconcludedthatHLA-DQA1genotypingbyusingourarraysystemissimpleandconvenientwithsatisfiedaccuracyandreproducibi1ity.KeywordsHLA-DQA1；genotype；oligonucleo

6、tidechip組織配型的情況是影響器官移植成活率的關鍵因素，同時，特定的HLA基因座位還和某些疾病相關聯(lián)，因此HLA的分型工作亦受到廣泛重視。到目前為止，國內外的HLA的分型研究仍多集中于A、B、DR位點。近年來，組成較為復雜的II型位點因與疾病有較多關聯(lián)而多有報道。其中DQ位點與擴張性心肌癥1,病毒性乙型肝炎2,糖尿病3,4,銀屑病5等多種疾病的罹患率及預后相關。1996年，HLA-DQ也被定義為移植抗原6o目前，HLA分型有血清學分型和基因分型，后者更具優(yōu)勢和發(fā)展前途。對基因分型國際上推薦使用PCR-SSP和PCR-SSOP方法，但兩者在設計或操作上略顯繁瑣?；蛐酒膯柺罏镠LA分型工

7、作提供了新的思路，基因芯片的高通量、集成化和并行檢測等優(yōu)勢使其極為適用于復雜的HLA遺傳系統(tǒng)。國內外在這方面的報道很多，但尚沒有成熟的分型產品問世，也未見臨床大規(guī)模應用的報道。本研究使用自行構建的寡核仃酸芯片(oligonucleotidemicroarrays),對HLA-DQA1位點進行基因分型檢測，旨在建立一套成熟的分型技術，用于復雜的HLA系統(tǒng)的分型研究。-3百度文庫-好好學習.天天向上材料和方法DNA樣本50例臨床樣本采自中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院，50例標準DNA樣品由中國刑警學院法醫(yī)系法醫(yī)學教研室提供7o主要試劑及儀器手臂分子氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)(Sigma公司)，P

8、CR試劑盒及相關試劑(Promega公司),蛙魚精DXA(Sigma公司),其他化學試劑均為分析純。PCR擴增儀(BiometraPersonalPCRsystem,USA),生物芯片點樣儀(MGII600,BioRobotics,England),激光共聚焦掃描儀(GeneTACTMLSIV,GenomicSolutionsInc.USA)引物及探針根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫新近公布的HLA-DQA1等位基因序列，在多態(tài)性集中的exon2保守區(qū)及變異區(qū)分別設計1對引物及16條特異性分型探針，交由上海生物工程公司合成，并在正義鏈引物5'端作FITC標記，序列如下：Pl(+)Exon2:5

9、'-TGTATTACATGGGMTATGTGATTTTAGA-3'；P2(-)Exon2:5'-CAGGGGTTGGAAATGTCCAC-3*,并在各探針5'端做氨基修飾。各組探針的序列見附表。全血基因組DA的提取改良的酚/氯仿法：1ml抗凝的外周血,896Xg離心5分鐘,分離中層白細胞后，傳統(tǒng)酚/氯仿/異丙醇法8抽提DNA,-20保存。PCR擴增與產物標記擴增體系20U1,含基因組DNA1口1。以組間特異性引物,行1：20不對稱擴增。擴增條件965分鐘，9630秒，5940秒，7240秒，35個循環(huán)。產物以聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)檢測。載片制備本室自建流

10、程。市售玻片(20mmX20mm)于鋁酸溶液中浸泡12小時以上，蒸儲水洗凈，INNaOH浸泡1小時，丙酮化3分鐘。浸入手臂分子溶液(2%氨基丙基三乙氧基硅烷，以95%丙酮溶解)10分鐘，丙酮清洗，104烤干后，5%戊二醛中浸泡過夜。寡核甘酸微陣列的制備以預先摸索好的條件，將16條寡核苜酸探針以探針緩沖液重懸至80Umol/L,與同等濃度的陽性對照探針（全序列匹配的反義鏈引物）、陰性對照無關探針（與目標序列同源性低于50%）、空白對照探針緩沖液，共同加入384孔板。啟動生物芯片點樣儀，制成預先設計好的微陣列。點樣中注意保濕，點樣后37水化過夜，80烤干，備用。Table.Probesequenc

11、es（略）封閉與核酸雜交按本室方法90取制備好的寡核苜酸芯片，用前以SDS洗去多余的未共價結合的探針。浸入5%二乙胺（MPB,pH=9）,室溫封閉30分鐘，充分洗凈吹干。PCR產物加雜交液（鞋魚精DNA10ug/ml）按1：1稀釋混勻，取8U1覆蓋于各微陣列，加放硅烷化蓋片。置入濕度適宜的雜交艙中55c保溫30秒。洗滌與檢測分析取出雜交芯片，沖去蓋片。用預熱至60c的洗液（IXSSC/%SDS,XSSC/%SDS,XSSC）行梯度洗滌，用ddH20洗凈，吹干。使用激光共聚焦掃描儀檢測，CCD成像軟件分析雜交信號，確定樣本的基因型。結果基因組DNA的獲取及靶基因的擴增基因組DXA的濃度為100-

12、200ng/uloA260/280值1,純度均>50%。PCR產物經PAGE檢測，可見擴增條帶清晰，特異性理想，對稱產物長度538bp,與設計相符。寡核甘酸芯片的分型100份樣品分型全部成功。其中50份標準樣品分型結果與其模板全部相符。另50份臨床血樣隨機抽取10份進行PCR產物測序,2份分型結果不完全相符（測序確定其為復合型，分別為0301/04,04/06；基因芯片分型為單純型，即0301,04）,另8例正確。圖A,B,C示1例選擇測序的臨床樣本。分型結果的穩(wěn)定性為驗證芯片的穩(wěn)定性及重現(xiàn)率，隨機選取10份樣品重復5次雜交實驗。16個分型位點中，2份樣品完全重復，3份可重復15

13、個分型位點，5份重復14個分型位點。重現(xiàn)率95%。HLA復合體遺傳區(qū)位于，長約3600kb,約占人類基因組總長度的1/3000。第十三屆國際組織相容性專題會議確定已發(fā)現(xiàn)的HLA等位基因達到1340個。HLA血清學分型多用微量淋巴細胞毒實驗，在20世紀80年代中期之前是HLA研究的重點，其檢查I類抗原經濟有效，但在檢測U類抗原時卻遇到了困難：一方面II類抗原在未激活T細胞上不表達，需分離純化B細胞；另一方面I1類抗原多由雙座位等位基因構成復雜的多態(tài)性，使得準確判定相應等位基因產物的抗原特異性十分困難。Opelz等10曾將來自58個移植中心的4000份冰凍組織標本進行回顧性分析，發(fā)現(xiàn)血清學方法分型

14、HLA-A,HLA-B錯誤率4%,而HLA-DR分型錯誤率高達25%。因此II類抗原多不采用血清學分型。目前，HLA基因分型國際上推薦使用PCR-SSP和PCR-SSOPoBunce等11用188個引物，經144次PCR建立一步法PCR-SSP,成功地對HLA-I、II類所有抗原進行了分型。該方法特異性較高，但主要依賴于PCR技術，操作略顯繁瑣，且結果分析非常復雜。PCR-SSOP因具有靈敏度高、誤差率小、樣本量少的優(yōu)點，是現(xiàn)今國內外分型應用最多的方法。但該法選擇的支持介質是膜12或微滴定板13,對于HLA復雜的等位基因，不具有集成化的優(yōu)勢?；蛐酒鳛椤?0世紀影響最為深遠的科學技術手段之一

15、”，非常適合分型復雜的HLA系統(tǒng)，已引起眾多科研機構的關注。但各家在制作分型芯片時方法差別相當大，表明基因芯片的技術流程還需要標準化。國際上對實質性器官移植通用“六抗原無錯配"標準，即HLA-A>-B、-DR在供受者中無錯配，記為“0AgMM”14。而HLA-DQA1,-DQB1及-DRB1的連鎖不平衡導致在限定人群中產生預期的抗原系。如大多白種人供受HLA-A、-B、-DRB1匹配者，HLA-DQB1及HLA-DQA1也同樣匹配15。本研究所采用的HLA-DQA1位點的探針組合，尚屬中等分辨率檢測，若進行高分辨率檢測，還需要設計更多的探針及進行探針的優(yōu)化。而HLA基因分型的要

16、求則視用途而定，就臨床實質性組織器官移植而言，采用中分辨率的分型條件是最佳選擇。因高分辨度將增加分型所需的時間和費用，且不易尋找到匹配的供者。但法醫(yī)學上的個人鑒定則不同，確定唯一的等位基因型是其目的。本室研制的寡核甘酸芯片制作相對簡單，易于操作，且穩(wěn)定性好，特異性和靈敏度都能滿足基因分型的需要，故適合器官移植前的組織配型及疾病相關基因型檢測等臨床應用。在多次實驗中，體會到探針連接，即水化的步驟至關重要，它對實驗結果影響很大。水化過程中應注意保濕，且濕盒內要保持合適的鹽溶液濃度。另外，雜交信號的強度與PCR擴增后的電泳條帶似無明顯相關。當某些原因造成PCR產量不足，或擴增條帶特異性不理想時，對雜

17、交信號強度及特異性并無明顯影響。這在理論上一方面歸因于堿基之間嚴格的互補配對，另一方面歸因于芯片通過二級放大獲得的高靈敏度。同時，有效而適宜的背景封閉可降低背景亮度，間接提高信噪比。【參考文獻】ILiuW,LiWM,SunNL.RelationshipbetweenHLA-DQA1polymorphismandgeneticsusceptibilitytoidiopathicdilatedcardiomyopathy.ChinMedJ,2004；117:1449-14522ZangGQ,XiM,FengML,etal.Curativeeffectsofinterferon-aandHLA-DR

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