微生物實(shí)驗(yàn)報(bào)告

1、食品微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)開放性實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目報(bào)告書“校園湖水中細(xì)菌學(xué)檢查”一實(shí)驗(yàn)流程圖參考文獻(xiàn)：1. 中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn).食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)，GB/T4789.32003:1318 2. 論大腸菌群檢測(cè)方法（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位論文） 3. 水環(huán)境中大腸菌群的檢測(cè)方法的研究 4. 中國(guó)環(huán)境檢測(cè)水中大腸菌群的快速檢測(cè)方法 5. 環(huán)境保護(hù)與循環(huán)經(jīng)濟(jì)水環(huán)境中大腸菌群的檢測(cè)方法的研究 6. 環(huán)境工程微生物學(xué)第二版，周群英、高延耀篇著 高等教育出版社出版 7.環(huán)境工程微生物學(xué), 王國(guó)惠 主編 化學(xué)工業(yè)出版社出版 2005.7 8污染控制微生物試驗(yàn)，馬放、任南琪、楊基先 主編 哈爾濱工業(yè)大學(xué)出版社出版 2006.

2、1 9.環(huán)境微生物學(xué)，樂毅全、王士男 化學(xué)工業(yè)出版社 2005.310水質(zhì)的細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn) 撖云軒二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1. 學(xué)習(xí)水樣的采取方法和水樣細(xì)菌總數(shù)測(cè)定的方法； 2. 掌握水樣中大腸菌群測(cè)定的原理、意義和檢測(cè)方法。 三、實(shí)驗(yàn)原理 1.細(xì)菌總數(shù)檢測(cè)原理：水中的細(xì)菌總數(shù)越多，說(shuō)明水中有機(jī)物的含量就越高，水體被污染的程度越重。水中細(xì)菌的種屬繁多，它們對(duì)營(yíng)養(yǎng)和其他生長(zhǎng)條件的要求差別很大，不可能找到一種培養(yǎng)基在一種條件下，使水中所有的細(xì)菌均能生長(zhǎng)繁殖，以一定的培養(yǎng)基平板上生長(zhǎng)出來(lái)的菌落，計(jì)算出來(lái)的水中的細(xì)菌的總數(shù)實(shí)際上是一種近似值。腸道中的絕大多數(shù)腐生性和致病性的細(xì)菌，可在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上進(jìn)行生長(zhǎng)。因

3、此應(yīng)用平板菌落計(jì)數(shù)技術(shù)來(lái)測(cè)定水樣中的細(xì)菌總數(shù)基本上能代表水樣中細(xì)菌的數(shù)量。 2.大腸菌群檢測(cè)的原理：大腸菌群是一群能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌，該菌主要來(lái)源于人畜糞便，故以此作為糞便污染指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)食品的衛(wèi)生質(zhì)量，推斷食品中有否污染腸道致病菌的可能。食品中的大腸菌群數(shù)系以100ml(g)檢樣內(nèi)大腸菌群最可能數(shù)(MPN)表示。MPN法是一種將樣品多次管稀釋至無(wú)菌的計(jì)數(shù)方法，將三個(gè)稀釋梯度的待檢驗(yàn)樣品稀釋液接種于九只或15只試管培養(yǎng)基中，每個(gè)稀釋梯度樣液接種3或5支，經(jīng)過培養(yǎng)后查閱MPN檢測(cè)表，就可以得到原來(lái)樣品液中微生物的估計(jì)數(shù)量。 3.水和飲料的微生物指標(biāo)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：

4、按中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB173241998.純凈水的微生物衛(wèi)生指標(biāo)為菌落總數(shù)20cfu/1ml。大腸菌群3mpn/100ml。致病菌不得檢出。霉菌.酵母菌不得檢出。其中一項(xiàng)不合格者為不合格產(chǎn)品。四、實(shí)驗(yàn)步驟（一）材料的采集：校園湖水星月湖 取距湖水面10-15cm深層水樣，先將滅菌的帶玻璃塞瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻轉(zhuǎn)過來(lái)，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛滿后，將瓶塞蓋好，再?gòu)乃腥〕?，最好立即檢查，否則需放入冰箱4C中保存，但不能超過24h。（二）材料的預(yù)處理： 1乳糖蛋白胨培養(yǎng)基(供多管發(fā)酵法的復(fù)發(fā)酵用)(1) 成份：蛋白胨2.5g，牛肉膏0.75g，乳糖1.25g，Nacl 1.25g

5、，1.6%溴甲酚紫乙醇0.25ml，蒸餾水250ml.(2) PH=7.2-7.4(3) 制備：按配方分別稱取上述成份加熱溶于250ml蒸餾水，調(diào)整pH=7.2-7.4加入1.6%的溴甲酚乙醇溶液0.25ml。充分混勻后分裝于試管內(nèi)，每管10ml，另取一小倒管裝滿培養(yǎng)基倒放入試管內(nèi)，塞好棉塞，包扎。置于高壓滅菌鍋內(nèi)以0.7kg/cm2（115）滅菌20min,取出置于陰冷處備用。2三倍濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)液（供多管法發(fā)酵用）（1）成份：蛋白胨7.5g,牛肉膏2.25g,乳糖3.75g,Nacl3.75g,1.6%溴甲酚紫乙醇 溶液0.75ml,蒸餾水250ml。 （2）pH=7.2-7.4(3)

6、制備：按配方分別稱取上述成份加熱溶于250ml蒸餾水，調(diào)整pH=7.2-7.4加入1.6%的溴甲酚乙醇溶液0.75ml，充分混勻后分裝于試管內(nèi)，每管5ml。在每管中倒放入裝滿培養(yǎng)基的小導(dǎo)管。塞好棉塞，包扎，置于高壓滅菌鍋內(nèi)以115滅菌20min，取出置于陰冷處備用。 3伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基（1）成份：蛋白胨2.5g，乳糖2.5g,磷酸氫二鉀0.5g,瓊脂5g, 蒸餾水250ml., 2%伊紅5ml,美藍(lán)水溶液3.25ml。 （2）制備：先將瓊脂加至200ml蒸餾水，加熱溶解，后加入磷酸氫二鉀及蛋白胨乳糖使之溶解,再調(diào)pH=7.2-7.4,再加入伊紅,美藍(lán)水溶液, 置于高壓滅菌鍋內(nèi)以（115）滅菌20

7、min,儲(chǔ)存于冷暗處備用。 4牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基制備(1) 蛋白胨1.5g，牛肉膏0.75g，Nacl 0.75g，瓊脂3g, 蒸餾水250ml. （2）pH=7.6（3）制備：將上述成份依次倒入裝有250ml蒸餾水的燒杯中溶解，待全部溶解后，加水補(bǔ)足因加熱蒸發(fā)的水量，用10%NaOH調(diào)整pH為7.6。塞上棉塞，包扎好待滅菌。5.乳糖膽鹽發(fā)酵管（單料）（1）成分蛋白胨 20g 、豬膽鹽(或 牛、羊膽鹽) 5g 、乳糖 10g 、0.04%溴甲酚紫水溶液 25mL、 蒸餾水 1 000mL、pH 7.4（2）制法將蛋白胨、膽鹽及乳糖溶于水中,校正pH,加入指示劑,分裝每管10mL,并放入一個(gè)小倒

8、管,115高壓滅菌15min。注:雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管除蒸餾水外,其他成分加倍。6、乳糖膽鹽發(fā)酵管（單料，雙料一起配制，按樣品份數(shù)成比例配制，雙料：?jiǎn)瘟?1：2）蛋白胨 40g 、豬膽鹽(或 牛、羊膽鹽) 10g 、乳糖 20g 、0.04%溴甲酚紫水溶液 12mL （酌情增減）、蒸餾水 1 000mL 、 pH 7.4（3）按樣品份數(shù)*45=所需配制量，按上述比例換算配料稱取量。（4）將試管排好，放入小倒管（管口朝下），1份樣品需9支試管，其中3支配雙料，6支配單料。（5）鍋中放入比所需配制量略多的蒸餾水（考慮加溫煮沸時(shí)蒸發(fā)）按1換算值稱取配料、乳糖，放入鍋中，靜置10-15分鐘，小火煮沸5-

9、10分鐘，同時(shí)不斷攪拌。（6）用40g/L的NaOH調(diào)節(jié)PH至7.4，加入溴甲酚紫水溶液，混勻。（7）配雙料：每管加5ml,共加樣品份數(shù)*3管。（8）配單料：在配雙料后剩余的溶液中加等量的蒸餾水（配制量*2/3），每管加10ml,共加樣品份數(shù)*6管（9）放入高壓鍋中滅菌。7EC肉湯胰蛋白(月示)或胰酪(月示)20.0g、3號(hào)膽鹽或混合膽鹽 1.5g、乳糖5.0g、磷酸氫二鉀(K2HPO4) 4.0g、磷酸二氫鉀(KH2PO4) 1.5g、氯化鈉5.0g、蒸餾水1000.0mL將以上成分溶解于蒸餾水中,分裝16mm150mm試管(管內(nèi)有倒立的小發(fā)酵管),每管8mL。121高壓滅菌15min,最終

10、pH6.90.1。8生理鹽水氯化鈉8.5g、蒸餾水 1000.0mL 將氯化鈉溶于蒸餾水中,121高壓滅菌15min。9革蘭氏染色液結(jié)晶紫染色液：結(jié)晶紫1.0g、95乙醇20.0Ml、1草銨水溶液 80.0mL將結(jié)晶紫完全溶解于乙醇中,然后與草酸銨溶液混合。革蘭氏碘液：碘1.0g、碘化鉀2.0g、蒸餾水300.0mL將碘與碘化鉀先行混合,加入蒸餾水少許充分振搖,待完全溶解后,再加蒸餾水至300mL。沙黃復(fù)染液：沙黃0.25g、95乙醇 10.0mL、蒸餾水90.0mL將沙黃溶解于乙醇中,然后用蒸餾水稀釋。染色法a. 將涂片在火焰上固定,滴加結(jié)晶紫染液,染1min,水洗。b.滴加革蘭氏碘液,作用

11、1min,水洗。 c. 滴加95乙醇脫色約1530s,直至染色液被洗掉,不要過分脫色,水洗。d.滴加復(fù)染液,復(fù)染1min,水洗、待干、鏡檢。 結(jié)果：革蘭氏陽(yáng)性菌呈紫色,革蘭氏陰性菌呈紅色。10磷酸鹽緩沖稀釋液 貯存液磷酸二氫鉀(KH2PO4) 34.0g、蒸餾水500mL、1 mol/L氫氧化鈉175 mL、將磷酸二氫鉀溶于蒸餾水中,用1 mol/L氫氧化鈉約175 mL調(diào)至1 mol/L氫氧化鈉約175 mL。用蒸餾水加至1000mL貯存于冰箱。（三）細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定：1. 水樣稀釋：先取10ml滅菌的移液管取10ml原水樣，并和4管9ml無(wú)菌水排列好，按原水樣，10-1（2個(gè)），10-2（2

12、個(gè)）依次編號(hào)，再用1ml無(wú)菌移夜管吸取原水樣于10-2標(biāo)號(hào)的含9ml無(wú)菌水的試管中，搖勻即為10-2濃度菌液，同樣方法用1無(wú)菌移液管吸取1濃度的無(wú)菌液于標(biāo)號(hào)含9無(wú)菌水的試管中，搖勻即為10濃度菌液，其余10-1，10-2濃度，均按以上方法配制。2. 配置瓊脂培養(yǎng)皿7個(gè)，包括原樣水（2個(gè)），10-1（2個(gè)），10-2（2個(gè)），蒸餾水1個(gè)（對(duì)照用）。瓊脂培養(yǎng)皿的制作采用倒平板法：取1支1mL無(wú)菌移液管分別取0.5mL菌液于相應(yīng)編號(hào)的培養(yǎng)皿內(nèi)加熱融化培養(yǎng)基，當(dāng)培養(yǎng)基冷至45左右時(shí)，右手拿裝有培養(yǎng)基的錐行瓶，左手拿培養(yǎng)皿，以中指、無(wú)名指和小指拖住皿底，拇指和食指夾住皿蓋，靠近火焰，將皿掀開，到入培養(yǎng)基

13、后將培養(yǎng)皿平房在桌上，順時(shí)針和逆時(shí)針來(lái)回轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基和菌液充分混合，冷凝后即成平板，倒置于30培養(yǎng)2448h,觀察結(jié)果。3. 初步發(fā)酵，將滅好菌的培養(yǎng)液從試管中取出，將水樣注入試管中，向普通試管中注入原樣水1ml（2個(gè)），10-1ml（2個(gè)），10-2ml（2個(gè)），蒸餾水1ml（1個(gè)），然后向小導(dǎo)管（7個(gè)）內(nèi)注入普通培養(yǎng)基，分別倒置于以上試管中向三倍濃縮試管中注入10ml原樣水（2個(gè)）。10ml蒸餾水（1個(gè)）對(duì)照。同樣方法取3個(gè)小導(dǎo)管注入三倍濃縮培養(yǎng)液中，分別倒置于試管中，以上10支試管送至37攝氏度恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。4. 取出已經(jīng)培養(yǎng)好的試管里的細(xì)菌，對(duì)試管進(jìn)行觀察，并記錄結(jié)果發(fā)現(xiàn)：產(chǎn)酸

14、且產(chǎn)氣的原樣水+三倍濃縮（2個(gè)），產(chǎn)酸10-1（2個(gè)），10-2（1個(gè)），原樣水（2個(gè)），表明為陽(yáng)性。制備伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基，取有變化的試管里的細(xì)菌進(jìn)行接種、劃線于伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上，進(jìn)行培養(yǎng)。同時(shí)將瓊脂培養(yǎng)皿取出，觀察細(xì)菌菌落數(shù)并記數(shù) 5. 取出培養(yǎng)好的伊紅美藍(lán)培養(yǎng)皿，觀察分別挑取不同培養(yǎng)皿內(nèi)的細(xì)菌，對(duì)其進(jìn)行染色，顯微鏡觀察并判斷其陰陽(yáng)性，發(fā)現(xiàn)并取培養(yǎng)出的大腸桿菌接種于乳糖培養(yǎng)基及三倍乳糖培養(yǎng)基中進(jìn)行復(fù)發(fā)酵。6. 觀察復(fù)發(fā)酵結(jié)果（四）大腸菌群檢測(cè)：1. 培養(yǎng)基和試劑 冰箱：04；恒溫培養(yǎng)箱：361;恒溫水浴鍋：461；顯微鏡：10100； 均質(zhì)器或滅菌乳缽；架盤藥物天平：0g500g,精確至0.5

15、9；滅菌吸管1ml(具0.01L刻度)； 100ml（具0.1ml刻度）；滅菌錐形瓶：500mLo；滅菌玻璃珠：直徑約5mm；滅菌培養(yǎng)皿：直徑90mm；滅菌試管：16mm或160mm；滅菌刀、剪子、鑷子等，乳糖膽鹽發(fā)酵管;伊紅美藍(lán)瓊脂平板；乳糖發(fā)酵管；EC肉湯；磷酸鹽緩沖液；0.85%滅菌生理鹽水；革蘭氏染色液。2. 檢樣稀釋 以無(wú)菌操作將檢樣25 (mL）放于含有225ml滅菌生理鹽水或其他稀釋液的滅菌玻璃瓶?jī)?nèi)（瓶?jī)?nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠）或滅菌乳缽內(nèi)，經(jīng)充分振搖或研磨做成1：10的均勻稀釋液。固體檢樣在加入稀釋液后，最好用滅菌均質(zhì)器，以8 000rmin10 000r/min的速度處理1mi

16、n，做成l：10的均勻稀釋液。 用1mL滅菌吸管吸取1：10稀釋液1mL，沿管壁徐徐注人含有9ml滅菌生理鹽水或其他稀釋液的試管內(nèi)，振搖試管混勻，做成1：100的稀釋液。另取1mL滅菌吸管，按上條操作依次做l0倍遞增稀釋液，每遞增稀釋一次，換用1支1mL滅菌吸管 3. 乳糖發(fā)酵試驗(yàn) 根據(jù)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)z樣污染情況的估計(jì)，選擇三個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度，接種三管。乳糖發(fā)酵試驗(yàn)將待檢樣品接種于乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)，接種量在1mL以上者，用雙料乳糖膽鹽發(fā)醉管，1mL及1mL以下者，用單料乳糖膽鹽發(fā)酵管。每一稀釋度接種三管，置36 士1 溫箱內(nèi)，培養(yǎng)24h士2h，如所有乳糖膽鹽發(fā)酵管都不產(chǎn)氣，則可報(bào)告為大腸菌群陰性，如有產(chǎn)氣者，則按下