基因工程復(fù)習(xí)題及參考答案

1、【基因工程復(fù)習(xí)題及參考答案】緒論、基因工程基礎(chǔ)一、填空題1. 基因工程是20 世紀(jì)70 年代發(fā)展起來(lái)的遺傳學(xué)的一個(gè)分支學(xué)科。基因工程技術(shù)的誕生使人們從簡(jiǎn)單地利用現(xiàn)存的生物資源進(jìn)行諸如發(fā)酵、釀酒、制醋和醬油等傳統(tǒng)的生物技術(shù)時(shí)代,走向按人們的需要定向地改造和創(chuàng)造具有新的遺傳性品種的時(shí)代。2.Cohen 等在1973 年構(gòu)建了第一個(gè)有功能的重組DNA 分子。3.基因工程的兩個(gè)基本特點(diǎn)是:(1分子水平上的操作,(2細(xì)胞水平上的表達(dá)。4.基因克隆中三個(gè)基本要點(diǎn)是:克隆基因的類型、受體的選擇和載體的選擇。5.克隆基因的主要目的有四個(gè):擴(kuò)增DNA ;獲得基因產(chǎn)物;研究基因的表達(dá)調(diào)控;改造生物的遺傳特性。6.

2、基因工程的基本程序包括DNA 制備、體外DNA 重組、遺傳轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)化細(xì)胞的篩選等方面。7.基因工程又稱重組DNA 技術(shù)/基因操作技術(shù)/基因克隆/分子克隆/遺傳修飾/新遺傳學(xué)。8.克隆的進(jìn)行依賴于各種參與DNA 新陳代謝的酶的使用,它們主要是從原核細(xì)胞中分離的。限制性內(nèi)切核酸酶能夠?qū)NA 切割成特定大小的片段。各種各樣的DNA 聚合酶也是克隆所必需的,包括將RNA 轉(zhuǎn)錄出單鏈DNA 的反轉(zhuǎn)錄酶。DNA 連接酶用于連接限制性片段?？寺∫残枰獊?lái)源于微生物的DNA 序列,包括用來(lái)運(yùn)載被被克隆DNA 的克隆載體。質(zhì)粒載體來(lái)源于天然細(xì)菌質(zhì)粒,通常攜帶有抗生素抗性基因。其他載體來(lái)源于噬菌體,如噬菌體,它們

3、經(jīng)過(guò)修飾后可以運(yùn)輸外源DNA。要想克隆一個(gè)感興趣的真核生物的基因就必須先制作一個(gè)能與該基因雜交的探針。人們已經(jīng)發(fā)展了很多有效而精細(xì)的技術(shù)來(lái)分析克隆的DNA。例如,極微量的DNA 片段可以通過(guò)PCR 得到擴(kuò)增。在感興趣基因的啟動(dòng)子上連接,如CAT 或LacZ 之類的報(bào)告基因能夠定量檢測(cè)基因的活性。二、選項(xiàng)題(單選或多選1.因研究重組DNA 技術(shù)而獲得諾貝爾獎(jiǎng)的科學(xué)家是(C 。A. Kornberg AB. Gilbert WC. Berg PD. McClintock2.第一個(gè)用于構(gòu)建重組體的限制性內(nèi)切核酸酶是(A 。A. Eco R IB. Eco BC. Eco CD. Eco R II3.

4、 靶(目的基因通常是指(A 。A、擬進(jìn)行研究或利用的基因B、人工合成的基因C、載體DNA 分子D、具有編碼序列的DNA 分子三、判斷題1.利用噬菌體或動(dòng)物病毒作為載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞的過(guò)程稱為轉(zhuǎn)移。錯(cuò)誤,為轉(zhuǎn)染,質(zhì)粒DNA 為轉(zhuǎn)化2.Berg P 的創(chuàng)造性的工作是在體外構(gòu)建了重組DNA 分子,所用的載體是一種具有復(fù)制能力的細(xì)胞質(zhì)質(zhì)粒。錯(cuò)誤,用的是動(dòng)物病毒DNA(猿猴病毒SV403.克隆即無(wú)性繁殖的意思。通過(guò)克隆可以在無(wú)性的條件下獲得遺傳結(jié)構(gòu)和表型完全相同的一群個(gè)體。錯(cuò)誤,不嚴(yán)謹(jǐn),對(duì)分子可以,對(duì)細(xì)胞或個(gè)體不一定4.催生基因工程技術(shù)誕生的關(guān)鍵技術(shù)是DNA 轉(zhuǎn)化技術(shù)的突破。錯(cuò)誤,II 型酶的分離純化四、問(wèn)答

5、題1.為什么說(shuō)基因工程是在上世紀(jì)70 年代初起發(fā)展起來(lái)的?答:這是因?yàn)?1967 年發(fā)現(xiàn)了連接酶;大腸桿菌的轉(zhuǎn)化技術(shù)于1970 年獲得突破;限制性內(nèi)切核酸酶的分離始于1970 年;Berg 在1972 年構(gòu)建了第一個(gè)重組的DNA 分子。2.基因工程操作的基本步驟是什么?施工材料的準(zhǔn)備,即目的基因、載體、工具酶和受體細(xì)胞(宿主的準(zhǔn)備。用限制性內(nèi)切酶分別將外源DNA 和載體分子切開(kāi)。(切目的基因與載體DNA 的體外重組,形成重組DNA 分子。(接把重組的DNA 分子引入受體細(xì)胞,并建立起無(wú)性繁殖系。(轉(zhuǎn)和擴(kuò)篩選出所需要的無(wú)性繁殖系,并保證外源基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定遺傳、正確表達(dá)。(檢3.如何理解基因

6、工程的兩個(gè)特點(diǎn)?答:基因工程的兩個(gè)基本特點(diǎn)是分子水平的操作和細(xì)胞水平的表達(dá)。分子水平的操作包括DNA 分離、切割和連接(還有其他一些DNA 的修飾等。由于體外重組DNA 的最終目的是要改變生物的遺傳性,所以分子水平的操作和細(xì)胞水平的表達(dá)是基因工程的兩個(gè)最基本的特點(diǎn)。4.什么是動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器?答:能夠分泌乳汁的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)其他來(lái)源的基因產(chǎn)品,并通過(guò)乳腺分泌出來(lái)。5.基因克隆是如何使含有單個(gè)基因的DNA 片段得到純化的?答:大分子質(zhì)量的DNA 會(huì)含有許多特殊限制性內(nèi)切核酸酶的限制位點(diǎn),因此用一種限制酶處理一完整染色體或整個(gè)基因組會(huì)產(chǎn)生許多不同的DNA 片段,每一個(gè)片段帶有基因組的一個(gè)不同的基

7、因或一個(gè)不同的小片段。當(dāng)全部片段與用同種限制酶處理過(guò)的載體分子混合時(shí)(如圖所示,每個(gè)片段將插入一個(gè)不同的載體分子(如一個(gè)質(zhì)粒。同樣地,當(dāng)用這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞時(shí),每個(gè)宿主細(xì)胞將只接收一個(gè)質(zhì)粒DNA 分子,而篩選出的含重組質(zhì)粒的每個(gè)菌落實(shí)際上會(huì)含有某一特異的供體DNA 片段的多個(gè)拷貝。一旦帶有待研究的特定基因的克隆被確認(rèn)了,此重組DNA 分子可從宿主細(xì)胞中提取出來(lái)進(jìn)行純化。6.比較遺傳工程、基因工程和生物技術(shù)。答:遺傳工程是遺傳學(xué)和工程學(xué)相結(jié)合的一門技術(shù)科學(xué)。借用工程技術(shù)上的設(shè)計(jì)思想,在離體條件下,對(duì)生物細(xì)胞、細(xì)胞器、染色體或DNA 分子進(jìn)行按圖施工的遺傳操作,以求定向地改造生物的遺傳性。遺傳工

8、程的概念有廣義和狹義之分。狹義的遺傳工程就是指基因工程?；蚬こ?gene engineering又稱基因操作(gene manipulation、重組DNA(recombinant DNA?；蚬こ淌且苑肿舆z傳學(xué)理論為基礎(chǔ),以分子生物學(xué)和微生物學(xué)的現(xiàn)代方法為手段,將不同來(lái)源的基因(DNA 分子,按預(yù)先設(shè)計(jì)的藍(lán)圖,在體外構(gòu)建雜種DNA 分子,然后導(dǎo)入活細(xì)胞,以改變生物原有的遺傳特性,獲得新品種,生產(chǎn)新產(chǎn)品,或是研究基因的結(jié)構(gòu)和功能。生物技術(shù)又稱生物工藝學(xué),生物工程學(xué)。是根據(jù)生物學(xué)、化學(xué)和工程學(xué)的原理進(jìn)行工業(yè)規(guī)模的經(jīng)營(yíng)和開(kāi)發(fā)微生物、動(dòng)植物細(xì)胞及其亞細(xì)胞組分,進(jìn)而利用生物體所具有的功能元件(如基因

9、、蛋白質(zhì)等來(lái)提供商品或社會(huì)服務(wù)的一門綜合性科學(xué)技術(shù)。它包括基因工程、細(xì)胞工程、酶工程和發(fā)酵工程等。限制內(nèi)切核酸酶一、填空題1.基因工程中把那些具有識(shí)別雙鏈DNA 分子中的某種特定核苷酸序列,并由此切割DNA 雙鏈結(jié)構(gòu)的內(nèi)切核酸酶統(tǒng)稱為限制性內(nèi)切核酸酶。2.通過(guò)比較用不同組合的限制性內(nèi)切核酸酶處理某一特定基因區(qū)域所得到的不同大小的片段,可以構(gòu)建顯示該區(qū)域各限制性內(nèi)切核酸酶切點(diǎn)相互位置的限制酶切圖譜。3.II 類限制性內(nèi)切核酸酶分子質(zhì)量較小,一般在2040kDa。這類酶的專一性強(qiáng),它不僅對(duì)酶切點(diǎn)鄰近的兩個(gè)堿基有嚴(yán)格要求,而且對(duì)更遠(yuǎn)的堿基也有要求,因此,II 類酶既具有切割位點(diǎn)的專一性,也具有識(shí)別位

10、點(diǎn)的專一性,一般在識(shí)別序列內(nèi)切割。切割的方式有平切和交錯(cuò)切,產(chǎn)生平末端的DNA 片段或突出黏性末端的DNA 片段。作用時(shí)需要Mg2+ 作輔助因子,但不需要ATP 和SAM 。4. 完全的回文序列具有兩個(gè)基本的特點(diǎn):能夠在中間劃一個(gè)對(duì)稱軸,兩側(cè)的序列兩兩對(duì)稱互補(bǔ)配對(duì);兩條互補(bǔ)鏈的53的序列組成相同,即將一條鏈旋轉(zhuǎn)180°,則兩條鏈重疊。5.II 類限制性內(nèi)切核酸酶一般識(shí)別 46 個(gè)堿基,也有識(shí)別多序列的限制性內(nèi)切核酸酶。6.個(gè)體之間DNA 限制性片段長(zhǎng)度的差異叫限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP。7.限制性內(nèi)切核酸酶是按屬名和種名相結(jié)合的原則命名的,第一個(gè)大寫字母取自屬名的第一個(gè)字母,第二

11、、三兩個(gè)字母取自種名的前兩個(gè)字母,第四個(gè)字母則用菌株名表示。8.限制性內(nèi)切核酸酶Acy I 識(shí)別的序列是5-GRCGYG-3,其中R 代表A 或者T,Y 代表G或者C。9.在酶切反應(yīng)管加完各種反應(yīng)物后,需要離心幾秒鐘,其目的是混合均勻和防止部分酶切。10.基因組DNA 分子部分酶切消化可采取的措施有:減少酶量;縮短反應(yīng)時(shí)間;增大反應(yīng)體積等。11.第一個(gè)分離得到的限制性內(nèi)切核酸酶是Eco K ,而第一個(gè)用于構(gòu)建重組DNA 分子的限制性內(nèi)切核酸酶是Eco R I 。12.限制性內(nèi)切核酸酶Bsu R I 和Hae III 的來(lái)源不同,但識(shí)別的序列都是GGCC,因此他們屬于同裂酶。13.由于DNA 是

12、由四種堿基組成的,所以任何限制性內(nèi)切核酸酶的切割頻率的理論值應(yīng)該是4n 。14.部分酶切是指控制反應(yīng)條件,使得酶在DNA 序列上的識(shí)別位點(diǎn)只有部分得到切割,它的理論依據(jù)是酶切速度是不均衡的。15.I 類限制酶識(shí)別DNA 的位點(diǎn)和切割的DNA 位點(diǎn)是不同的,切割位點(diǎn)的識(shí)別結(jié)合有兩種模型,一種是限制酶移動(dòng),另一種是DNA 彎曲。16.限制性內(nèi)切核酸酶通常保存在50% 濃度的甘油溶液中。二、選項(xiàng)題(單選或多選1.關(guān)于宿主控制的限制修飾現(xiàn)象的本質(zhì),下列描述中只有( B 不太恰當(dāng)。A.由作用于同一DNA 序列的兩種酶構(gòu)成B.這一系統(tǒng)中的核酸酶都是II 類限制性內(nèi)切核酸酶C.這一系統(tǒng)中的修飾酶主要是通過(guò)甲

13、基化作用對(duì)DNA 進(jìn)行修飾D.不同的宿主系統(tǒng)具有不同的限制-修飾系統(tǒng)2.RFLP 產(chǎn)生自( C 。A.使用不同的限制性內(nèi)切核酸酶B.每種類型的染色體有兩條(二倍體C.DNA 序列中堿基的隨機(jī)變化D.Southern 印跡E.不同探針的使用3.II 類限制性內(nèi)切核酸酶( B 。A.有內(nèi)切核酸酶和甲基化酶活性且經(jīng)常識(shí)別回文序列B.僅有內(nèi)切核酸酶活性,甲基化酶活性由另外一種酶提供C.限制性識(shí)別非甲基化的核苷酸序列D.有外切核酸酶和甲基化酶活性E.僅有外切核酸酶活性,甲基化酶活性由另外一種酶提供4.III 型限制性內(nèi)切核酸酶( C 。A.由兩個(gè)亞基組成,僅識(shí)別半甲基化位點(diǎn)。甲基化位點(diǎn)相對(duì)于限制位點(diǎn)的位

14、置(上游或下游決定了DNA 是被甲基化還是被限制B.不同亞基的識(shí)別位點(diǎn)甲基化和限制活性相互排斥:MS 亞基促使甲基化,R 亞基促使限制C.由兩個(gè)亞基組成,在識(shí)別位點(diǎn)附近識(shí)別并進(jìn)行甲基化或限制D.在錯(cuò)配修復(fù)中起關(guān)鍵作用,因?yàn)槊附Y(jié)合到DNA 上是以結(jié)構(gòu)扭曲為基礎(chǔ)而不是序列錯(cuò)誤識(shí)別5.分析限制性內(nèi)切核酸酶切割雙鏈DNA 所得到的DNA 片段的長(zhǎng)度有助于物理作圖,這是因?yàn)? C 。A.即使只用一種限制酶,因?yàn)镈NA 是線性的,所以也可以迅速確定限制性片段序列B.內(nèi)切核酸酶在等距離位點(diǎn)切割DNA,同時(shí)對(duì)于每個(gè)生物體的長(zhǎng)度是特異的C、DNA 的線性意味著單限制酶切片段的長(zhǎng)度之和等于DNA 的總長(zhǎng),而雙酶切

15、產(chǎn)生的重疊片段則產(chǎn)生模糊的圖譜D.這些內(nèi)切核酸酶的消化活性是物種特異的E.這一技術(shù)同時(shí)為核苷酸序列提供了廣泛信息6、通過(guò)限制性片段分析,可以對(duì)等位基因進(jìn)行精確的分析比較,其原因是( BD 。A.限制性內(nèi)切核酸酶只切割兩個(gè)變異等位基因中的一個(gè)B.它利用限制性位點(diǎn)作為遺傳標(biāo)記C、一個(gè)特定細(xì)胞中等位基因的核苷酸序列不會(huì)是相同的D.它不依賴于變異等位基因產(chǎn)物的功能E.限制性內(nèi)切核酸酶的切點(diǎn)被限制在DNA 的編碼區(qū)域內(nèi)7、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP 是( C 。A.用于遺傳的“指紋結(jié)構(gòu)”模式分析的技術(shù)B.二倍體細(xì)胞中的兩個(gè)等位基因限制性圖譜的差別C.物種中的兩個(gè)個(gè)體限制性圖譜間的差別D.兩種物種個(gè)體

16、間的限制性圖譜差別E.兩種酶在單個(gè)染色體上限制性圖譜的差別8. 下面有關(guān)限制酶的敘述哪些是正確的?(BCDE A. 限制酶是外切酶而不是內(nèi)切酶B. 限制酶在特異序列(識(shí)別位點(diǎn)對(duì)DNA 進(jìn)行切割C. 同一種限制酶切割DNA 時(shí)留下的末端序列總是相同的D. 一些限制酶在識(shí)別位點(diǎn)內(nèi)稍有不同的位置切割雙鏈DNA,產(chǎn)生黏末端E.一些限制酶在識(shí)別位點(diǎn)內(nèi)相同的位置切割雙鏈DNA,產(chǎn)生平末端9.因研究噬菌體的限制與修飾現(xiàn)象的本質(zhì)而獲得諾貝爾獎(jiǎng)的科學(xué)家是(C 。A. Lederberg JB. Arber WC. Smith HD. Sanger F10.第一個(gè)被分離的II 類酶是( C 。A.Eco KB.H

17、in d IIIC.Hin d IID.Eco B11.雙鏈DNA 中一段自我互補(bǔ)的序列被稱為回文序列,這種序列一般具有( ABC 特征。A、有對(duì)稱軸B.兩條鏈的53方向的序列相同C.是類酶的識(shí)別序列D.可增強(qiáng)基因的表達(dá)12.在下列進(jìn)行DNA 部分酶切的條件中,控制哪一項(xiàng)最好?( B A.反應(yīng)時(shí)間B.酶量C.反應(yīng)體積D.酶反應(yīng)的溫度13.在下列試劑中,哪一種可以螯合Ca2+?( D A.EDTAB.檸檬酸鈉C.SDSD.EGTA14.Bst B I (TTCGAA 消化可產(chǎn)生怎樣的末端? ( C A.含5'CGAA3'序列的黏末端B.含5'CG3'序列的黏末端C

18、.含5'AAGC3'序列的黏末端D.平末端E.含5'GC3'序列的黏末端15.限制性內(nèi)切核酸酶可以特異性地識(shí)別( B 。A.雙鏈DNA 的特定堿基對(duì)B.雙鏈DNA 的特定堿基序列C.特定的三聯(lián)密碼D.以上都正確16. 下面關(guān)于限制性核酸內(nèi)切酶的表示方法中,正確的一項(xiàng)是(D 。A. Sau 3A IB. E.co R IC. hin d IIID. Sau3A I17.限制性內(nèi)切核酸酶的星號(hào)活性是指( A 。A. 在非常規(guī)條件下,識(shí)別和切割序列發(fā)生變化的活性B.活性大大提高C.切割速度大大加快D.識(shí)別序列與原來(lái)的完全不同18.下面哪一種不是產(chǎn)生星號(hào)活性的主要原因?

19、 ( D A.甘油含量過(guò)高B.反應(yīng)體系中含有有機(jī)溶劑C.含有非Mg2+的二價(jià)陽(yáng)離子D.酶切反應(yīng)時(shí)酶濃度過(guò)低19. DNA 被某種酶切割后,電泳得到的電泳帶有些擴(kuò)散,下列原因中,哪一項(xiàng)不太可能? ( A A.酶失活B.蛋白質(zhì)(如BSA同DNA 結(jié)合C.酶切條件不合適D.有外切核酸酶污染20.關(guān)于回文序列,下列各項(xiàng)中( ABC 是不正確的。A.是限制性內(nèi)切核酸酶的識(shí)別序列B.是某些蛋白質(zhì)的識(shí)別序列C.是基因的旁側(cè)序列D.是高度重復(fù)序列21.為什么使用限制性內(nèi)切核酸酶對(duì)基因組DNA 進(jìn)行部分酶切?( E A.為了產(chǎn)生平末端B.為了產(chǎn)生黏末端C.只切割一條鏈上的酶切位點(diǎn),產(chǎn)生開(kāi)環(huán)分子D.可得到比完全酶

20、切的片段略短的產(chǎn)物E.可得到比完全酶切的片段略長(zhǎng)的產(chǎn)物22. Bam H I、Xba I、Bgl II 的識(shí)別位點(diǎn)分別是:GGATCC、TCTAGA、AGATCT,哪些酶切結(jié)果可產(chǎn)生互補(bǔ)的末端?( C A.以上幾種酶切結(jié)果產(chǎn)生的末端都可互補(bǔ)B.產(chǎn)生的末端都不能互補(bǔ)C.僅Bam H I 與Bgl II 的酶切末端互補(bǔ)D.僅Bam HI 與Xba I 的酶切末端互補(bǔ)E.僅Xba I 與Bgl II 的酶切末端互補(bǔ)23.從細(xì)菌中分離基因組DNA,經(jīng)過(guò)識(shí)別GAATTC 序列的6 堿基酶長(zhǎng)時(shí)間消化后,發(fā)現(xiàn)DNA 分子未被切動(dòng),基因組大小為4Mb,造成該結(jié)果的原因是什么? ( C A.基因組中沒(méi)有GB.基

21、因組中沒(méi)有AC.該細(xì)菌的DNA 已經(jīng)過(guò)甲基化修飾D.所有酶切位點(diǎn)都位于基因內(nèi),而該限制性內(nèi)切核酸酶不作用于基因內(nèi)E.所有酶切位點(diǎn)都位于啟動(dòng)子及調(diào)控區(qū)內(nèi),而該限制性內(nèi)切核酸酶只作用于基因內(nèi)24. 關(guān)于限制性內(nèi)切核酸酶的來(lái)源及其天然存在的意義,下列哪種說(shuō)法是正確的?( D A.來(lái)自噬菌體,用于復(fù)制病毒DNAB.來(lái)自噬菌體,具有抗微生物作用C.來(lái)自酵母菌,參與DNA 復(fù)制D.來(lái)自細(xì)菌,有防御病毒侵染的意義E.是細(xì)菌內(nèi)的DNA 復(fù)制酶25. 識(shí)別10 堿基序列的限制酶,大約每隔( A 進(jìn)行一次切割。A.4l0B.104C.2l0D.102E.24三、判斷題1.限制與修飾現(xiàn)象是宿主的一種保護(hù)體系,它是通

22、過(guò)對(duì)外源DNA 的修飾和對(duì)自身DNA 的限制實(shí)現(xiàn)的。錯(cuò)誤,正相反2.限制性內(nèi)切核酸酶在DNA 中的識(shí)別/切割位點(diǎn)的二級(jí)/三級(jí)結(jié)構(gòu)也影響酶切效率。一般來(lái)說(shuō),完全切割質(zhì)?；虿《綝NA,要比切割線狀DNA 需要更多的酶,最高的需要20 倍。正確3.如果限制性內(nèi)切核酸酶的識(shí)別位點(diǎn)位于DNA 分子的末端,那么接近末端的程度也影響切割,如HpaII 和Mbo I 要求識(shí)別序列之前至少有一個(gè)堿基對(duì)存在才能切割。正確4.能夠產(chǎn)生防御病毒侵染的限制性內(nèi)切核酸酶的細(xì)菌,其本身的基因組中沒(méi)有被該核酸酶識(shí)別的序列。正確5.限制性圖譜與限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP 圖譜的最顯著的區(qū)別在于前者是一個(gè)物理圖譜而后者是一個(gè)

23、連鎖圖。正確6.用限制性內(nèi)切核酸酶Hae III 分別切割載體DNA 和供體DNA 后,可用E.coli DNA 連接酶進(jìn)行連接。錯(cuò)誤,Hae III 產(chǎn)生平末端,此酶不能連接平末端7.已知某一內(nèi)切核酸酶在一環(huán)狀DNA 上有三個(gè)切點(diǎn),因此,用此酶切割該環(huán)狀DNA,可得到三個(gè)片段。正確8.迄今所發(fā)現(xiàn)的限制性內(nèi)切核酸酶既能作用于雙鏈DNA,又能作用于單鏈DNA。錯(cuò)誤9.基因工程中使用的II 類限制性內(nèi)切核酸酶不僅有內(nèi)切核酸酶的活性,而且有甲基化酶的活性。錯(cuò)誤,II 型無(wú)甲基化活性10.DNA 多態(tài)性就是限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性。錯(cuò)誤,RFLP 只是DNA 多態(tài)性一部分11.甘油會(huì)使許多限制性內(nèi)切核酸酶

24、的特異性發(fā)生改變,這是導(dǎo)致一些酶的星活性的主要原因之一,防止的辦法是在酶切反應(yīng)體系中,將甘油的濃度控制在5%以下。正確12.具有Eco R II 末端的外源片段只能以一個(gè)方向插入到Eco R II 末端的載體中。正確,CCWGG,W=A 或T?13.從Escherichia coli K 中分離的限制性內(nèi)切核酸酶命名為E.co K。錯(cuò)誤,Eco K14.同一種限制性內(nèi)切核酸酶切割靶DNA, 得到的片段的兩個(gè)末端都是相同的。錯(cuò)誤,如果識(shí)別的不是完整的回文序列,末端不同15.在限制與修飾系統(tǒng)中,修飾主要是甲基化作用,一旦位點(diǎn)被甲基化了,其他的限制酶就不能切割了。錯(cuò)誤,甲基化不能被同一系統(tǒng)限制酶識(shí)別

25、16.稀有酶是指那些識(shí)別序列很長(zhǎng)又不常用的限制性內(nèi)切核酸酶。錯(cuò)誤,指在某種事物基因組DNA 中切割頻率很低的酶17.EGTA 是鎂離子螯合劑,加入反應(yīng)液后,可以抑制所有需要鎂離子作為輔助因子的酶活性。錯(cuò)誤,是鈣離子螯合劑,可抑制需鈣離子作為輔助因子的酶活性,如Bal 31四.問(wèn)答題(一簡(jiǎn)答1.現(xiàn)分離到X82 噬菌體的個(gè)突變型,它同野生型的噬菌斑相當(dāng)不同,并已分離到這兩種噬菌體的DNA。請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)一個(gè)實(shí)驗(yàn),初步鑒定是點(diǎn)突變、插入突變還是缺失突變?提示:用RFLP 方法。2.說(shuō)明Sanger DNA 測(cè)序法的原理。答:Sanger DNA 測(cè)序法建立在兩個(gè)基本原理之上:核酸是依賴于模板在聚合酶的作用下

26、由5端向3端聚合;可延伸的引物必須能提供游離的3羥基末端,雙脫氧核苷酸由于缺少游離的3羥基末端,因此會(huì)終止聚合反應(yīng)的進(jìn)行。如果分別用四種雙脫氧核苷酸終止反應(yīng),則會(huì)獲得四組長(zhǎng)度不同的DNA 片段。通過(guò)比較所有DNA 片段的長(zhǎng)度可以得知核苷酸的序列。3.在酶切反應(yīng)緩沖液中加入BSA 的目的是什么?機(jī)制是什么?答:目的是保護(hù)酶的活性,機(jī)制是通過(guò)提高溶液中蛋白質(zhì)的濃度,防止酶的失活。4.某學(xué)生在用Eco R I 切割外源DNA 片段時(shí),出現(xiàn)了星號(hào)活性,請(qǐng)分析可能的原因。答:鹽離子濃度不對(duì),溫度不對(duì),甘油濃度過(guò)高。5.在序列5'-CGAACATATGGAGT-3'中含有一個(gè)6bp 的II

27、 類限制性內(nèi)切核酸酶的識(shí)別序列,該位點(diǎn)的序列可能是什么?答:回文序列是5-CATATG-3。6.下面幾種序列中你認(rèn)為哪一個(gè)(哪些最有可能是II 類酶的識(shí)別序列:GAATCG、AAATTT、GATATC、ACGGCA?為什么?答:GATATC 和AAATTT,因?yàn)樗鼈兪腔匚男蛄小?.用Klenow 酶填補(bǔ)的辦法可使5' 黏性末端轉(zhuǎn)變成平末端。這種方法常使DNA 上的某些限制酶的識(shí)別位點(diǎn)消失。請(qǐng)問(wèn),對(duì)于下列限制酶,用這種方法處理會(huì)不會(huì)使它們的識(shí)別序列都消失? Bam H I (GGATCC、Taq I (TCGA、Bss H II (GCGCGC。答:Bss H II 不會(huì)。8.當(dāng)兩種限制

28、性內(nèi)切核酸酶的作用條件不同時(shí),若要進(jìn)行雙酶切,應(yīng)采取什么措施? 為什么?答:注意星號(hào)活性;先低鹽,后高鹽;先低溫酶,后高溫酶;并且可以直接在換酶前將第一種酶失活,再加第二種酶,否則,易產(chǎn)生星號(hào)活性,或使用通用緩沖液。9.什么是同裂酶?什么是同尾酶?10.何謂限制性物理圖譜?答:限制性物理圖譜即限制性內(nèi)切核酸酶作圖(restriction mapping。簡(jiǎn)單地說(shuō)就是DNA 分子中限制性內(nèi)切核酸酶切割位點(diǎn)的定位,即DNA 分子中各種不同限制性內(nèi)切核酸酶的酶切位點(diǎn)的線性排列圖。標(biāo)明限制酶在DNA 分子上的限制性位點(diǎn)的數(shù)目、限制性片段大小及其線性排列的順序。(二問(wèn)答1.什么是細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng)(Re

29、striction ModificationSystem,R-M system?答:細(xì)菌中有作用于同一DNA 的兩種酶,即分解DNA 的限制酶和改變DNA 堿基結(jié)構(gòu)使其免遭限制酶分解的修飾酶。而且,這兩種酶作用于同一DNA 的相同部位,把這兩種酶所組成的系統(tǒng)稱為限制與修飾系統(tǒng)。2.細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng)有什么意義?答:不同種的細(xì)菌或不同的細(xì)菌菌株具有不同的限制酶和修飾酶組成的限制與修飾系統(tǒng)。修飾的本質(zhì)是通過(guò)甲基化酶將DNA 中某些堿基進(jìn)行甲基化修飾,由于宿主自身DNA 上的這些位點(diǎn)進(jìn)行了修飾,限制酶就不能進(jìn)行切割。而外來(lái)的DNA 在相應(yīng)的堿基上沒(méi)有被甲基化,宿主的限制酶通過(guò)對(duì)該位點(diǎn)的識(shí)別來(lái)分辨敵我

30、,并將入侵的外來(lái)DNA 分子降解掉。所以DNA 限制作用和修飾作用為細(xì)胞提供了保護(hù)。3.說(shuō)明限制性內(nèi)切核酸酶的命名原則要點(diǎn)。答:基本原則:屬名+種名+株名十序號(hào)。首字母:取屬名的第一個(gè)字母,且斜體大寫。第二個(gè)字母:取種名的第一個(gè)字母,斜體小寫。第三個(gè)字母:取種名的第二個(gè)字母,斜體小寫。第四個(gè)字母:若有株名,株名則作為第四個(gè)字母,用正體。順序號(hào):若在同一菌株中分離了幾種限制酶,則按先后順序冠以I、II、III 等,用正體。所有的限制酶,前面還應(yīng)帶有系統(tǒng)的名稱,如限制性核酸內(nèi)切酶R. Hin d III。修飾酶則在前面加上甲基轉(zhuǎn)移酶M,如甲基轉(zhuǎn)移酶M. Hin d III。在上下文已清楚只涉及限制

31、酶的地方,R 可被省去。4.何謂限制性內(nèi)切核酸酶的切割頻率?答:切割頻率是指限制性內(nèi)切核酸酶在某DNA 分子中預(yù)測(cè)的切點(diǎn)數(shù)。由于DNA 是由四種類型的單核苷酸組成,假定DNA 的堿基組成是均一的,而限制性內(nèi)切核酸酶的識(shí)別位點(diǎn)是隨機(jī)分布的,那么對(duì)于任何一種限制酶的切割頻率,理論上應(yīng)為1/4n,n 表示該限制酶識(shí)別的堿基數(shù)。如識(shí)別4 個(gè)堿基的限制酶,其切割頻率應(yīng)為每256 個(gè)堿基有一個(gè)識(shí)別序列和切點(diǎn)(1/44 = 1/256,識(shí)別5 個(gè)堿基的限制性內(nèi)切核酸酶,其切割頻率應(yīng)為每1024 個(gè)堿基有一個(gè)識(shí)別序列和切點(diǎn),余類推。5.什么是限制性內(nèi)切核酸酶的星號(hào)活性?受哪些因素的影響?答:II 類限制酶雖然

32、識(shí)別和切割的序列都具有特異性,但是這種特異性受特定條件的限制,即在一定環(huán)境條件下表現(xiàn)出來(lái)的特異性。條件發(fā)生改變,限制酶的特異性就會(huì)松動(dòng),識(shí)別的序列和切割都有一些改變。改變后的活性通常稱第二活性,而將這種因條件的改變會(huì)出現(xiàn)第二活性的酶的右上角加一個(gè)星號(hào)表示,因此第二活性又稱為星號(hào)活性。誘發(fā)星號(hào)活性的因素有如下幾種:高甘油含量(>5%,v/v;限制性內(nèi)切核酸酶用量過(guò)高(>100U/gDNA;低離子強(qiáng)度(<25mmol/L;高pH(8.0 以上;含有有機(jī)溶劑,如DMSO、乙醇等;有非Mg2+的二價(jià)陽(yáng)離子存在(如Mn2+、Cu2+、Co2+、Zn2+等。6.雙酶消化法(double

33、digest繪制限制性內(nèi)切核酸酶酶譜的原理是什么?答:雙酶消化法是繪制DNA 中兩個(gè)或兩個(gè)以上限制性內(nèi)切核酸酶圖譜所采用的方法。做法是在兩個(gè)限制性內(nèi)切核酸酶分別單獨(dú)消化DNA 分子的基礎(chǔ)上,再用這兩個(gè)酶同時(shí)或先后消化DNA,根據(jù)它們的結(jié)果構(gòu)建物理圖譜。7.什么是DNA 多態(tài)性(DNA polymorphism?答:在正常人群中,各個(gè)體DNA 分子的某些位點(diǎn)可以發(fā)生中性改變,這些改變雖然會(huì)使DNA 一級(jí)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定變化,但不影響基因的表達(dá),如果這種中性突變?cè)谌巳褐械念l率不低于1%,這一現(xiàn)象被稱為多態(tài)性。DNA 多態(tài)性本質(zhì)上是染色體DNA 中核苷酸數(shù)目或排列順序的個(gè)體差異,這些差異多數(shù)為中性突變,

34、不引起表型改變。8.什么是限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(restriction fragment lengt hpolymorphism,RFLP?答:當(dāng)DNA 序列的差異發(fā)生在限制性內(nèi)切核酸酶的識(shí)別位點(diǎn)時(shí),或當(dāng)DNA 片段的插入、缺失或重復(fù)導(dǎo)致基因組DNA 經(jīng)限制性內(nèi)切核酸酶酶解后,其片段長(zhǎng)度的改變可以經(jīng)凝膠電泳區(qū)分時(shí),DNA多態(tài)性就可應(yīng)用限制性內(nèi)切核酸酶進(jìn)行分析,這種多態(tài)性稱為限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP。9.計(jì)算下列三種酶各自在某染色體DNA 序列上識(shí)別位點(diǎn)間的平均距離:Alu I:5 AGCT 3,Eco R I: 5GAATTC 33TCGA 5,3CTTAGG 5Acy I:5GPuCG

35、PyC 33CPyGCPuG 5(注:Py=任何一種嘧啶;Pu=任何一種嘌呤答:Alu I:(1/44=1/256 Eco R I:(1/46=1/4096Acy I:(1/44(1/22=1/102410.何為回文序列?答:回文序列(palindromic sequence是一段自我互補(bǔ)的序列,即同其互補(bǔ)鏈一樣的序列(兩者的閱讀方向都是從53,。根據(jù)回文序列的結(jié)構(gòu)可分為:完全的回文序列、不完全的回文序列和間斷的回文序列。完全回文序列(如GAATTC,通常是限制性內(nèi)切核酸酶的識(shí)別序列;不完全的回文序列(如TACCTCCAT,CGTGATA,常是其他蛋白質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)(如阻抑蛋白,在基因表達(dá)調(diào)控中

36、有重要作用;間斷的回文序列(如GGTTXXXAACC,有一段是顛倒的重復(fù),它可使單鏈的核苷酸有可能在tRNA 中所見(jiàn)到的一樣,形成發(fā)夾環(huán)的結(jié)構(gòu)。聚合酶與修飾酶一、填空題1、連接酶(ligase是一類用于核酸分子連接形成磷酸二酯鍵的核酸合成酶。2.原核生物主要有兩種類型的DNA 連接酶:E.coli DNA 連接酶和T4 DNA 連接酶。基因工程中使用的主要是T4 DNA 連接酶,它是從T4 噬菌體感染的E.coli 中分離的一種單鏈多肽酶,分子質(zhì)量為68 kDa,由T4 噬菌體基因30 編碼。E.coli DNA 連接酶是由大腸桿菌基因51 編碼,也是一條多肽鏈的單體,分子質(zhì)量為74 kDa。

37、這兩種DNA 連接酶有兩個(gè)重要的差異:它們?cè)诖呋磻?yīng)中所用的能量來(lái)源不同,T4 DNA 連接酶用ATP ,而E.coli DNA 連接酶則用NAD+作為能源;它們催化平末端連接的能力不同,在正常情況下只有T4 DNA 連接酶能夠連接平末端,E.coliDNA 連接酶則不能。即使是調(diào)整反應(yīng)條件,E.coli DNA 連接酶催化平末端的連接效率也只有T4DNA 連接酶的1/10 。3. 從小牛胸腺中分離純化的末端轉(zhuǎn)移酶催化的基本反應(yīng)是將脫氧單核苷酸加到DNA 的3-ON 端,同時(shí)釋放出游離的無(wú)機(jī)磷。催化反應(yīng)時(shí)不需要模版,但需要引物,單鏈DNA 是最好的引物,單鏈DNA 受體的長(zhǎng)度最短需有 3 個(gè)d

38、NTP。具有3突出末端的雙鏈DNA 也是較好的反應(yīng)底物。二價(jià)離子和DNA 末端狀態(tài)對(duì)催化反應(yīng)影響較大,但是用Co2+ 作為輔助離子,可以催化任何形式的末端(突出的、隱含的、平齊的加接單核苷酸,但突出的3端效率較高。以Mn2+/Mg2+作為輔助因子,只能在單鏈DNA 或雙鏈DNA 的3突出端加尾。4.DNA 聚合酶I 的Klenow 片段是用枯草桿菌蛋白酶切割DNA 聚合酶I 得到的分子質(zhì)量為76kDa的大片段,具有兩種酶活性:53聚合酶活性;3 5外切核酸酶的活性。5.反轉(zhuǎn)錄酶除具有以DNA 和RNA 為模板合成DNA 的53合成酶的活性外,還具有四種酶的活性:53外切核酸酶活性;3 5外切核

39、酸酶活性;DNA 內(nèi)切酶的活性(Mn2+,切割SC DNA;解旋酶的活性。_6.為了防止DNA 的自身環(huán)化,可用堿性磷酸酶脫去雙鏈DNA 5端得磷酸基團(tuán)。7.切口移位(Nick Translation法標(biāo)記DNA 的基本原理在于利用DNA 聚合酶I 的53外切核酸酶和53聚合酶活性的作用。8.欲將某一具有突出單鏈末端的雙鏈DNA 分子轉(zhuǎn)變成平末端的雙鏈形式,通?？刹捎肧1 核酸酶切割或DNA 聚合酶補(bǔ)平。9.反轉(zhuǎn)錄酶除了催化DNA 的合成外,還具有核酸水解酶H 的作用,可以將DNA-RNA 雜種雙鏈中的RNA 水解掉。10.DNA 連接酶是基因克隆的分子黏合劑,而限制性內(nèi)切核酸酶被譽(yù)為分子克隆

40、的剪刀。二、選項(xiàng)題(單選或多選1.T4 DNA 連接酶是從T4 噬菌體感染的E.coli 中分離的,這種連接酶(B 。A.催化連接反應(yīng)時(shí)既能以ATP 又能以NAD 作為能量來(lái)源B.既能催化平末端連接又能催化黏性末端連接C. 是一種單肽酶,分子質(zhì)量為74kDaD.既能催化單鏈DNA 連接又能催化雙鏈DNA 連接2.DNA 連接酶在體內(nèi)的主要作用是在DNA 復(fù)制、修復(fù)中封閉缺口,(A 。A.將雙鏈DNA 分子中的5磷酸基團(tuán)同3'-OH 末端重新形成磷酸二酯鍵B.作用時(shí)不消耗能量C.需要Mn2+等二價(jià)輔助離子D.也可以連接RNA 分子3.在長(zhǎng)模板鏈的指導(dǎo)下引物延伸合成長(zhǎng)的DNA 互補(bǔ)鏈時(shí)應(yīng)選

41、用(D 。A. T4 DNA 聚合酶B.Klenow 酶C.大腸桿菌DNA 聚合酶ID.T7 DNA 聚合酶4.末端轉(zhuǎn)移酶是合成酶類,(C 。A.作用時(shí)不需要模板B.在Co2+的存在下,可以在突出的3端延長(zhǎng)DNA 鏈C.在Co2+的存在下,可以在隱蔽的3端延長(zhǎng)DNA 鏈D.上述說(shuō)法有兩種是正確的5.在基因工程中,可用堿性磷酸酶( AB 。A.防止DNA 的自身環(huán)化B.同多核苷酸激酶一起進(jìn)行DNA 的5端標(biāo)記C.制備突出的3 端D.上述說(shuō)法都正確A.需要ATP 作輔助因子B.需要NAD 作輔助因子C.可以進(jìn)行平末端和黏性末端連接D.作用時(shí)不需要模板7.下列哪一種酶作用時(shí)需要引物? ( C A.限

42、制酶B.末端轉(zhuǎn)移酶C.反轉(zhuǎn)錄酶D.DNA 連接酶8.S1 核酸酶的功能是( BCD 。A.切割雙鏈的DNAB.切割單鏈的RNAC.切割發(fā)夾環(huán)D.以上有兩項(xiàng)是正確的9.K1enow 酶與DNA 聚合酶相比,前者喪失了( C 的活性。A.53 合成酶B.35 外切酶C.53 外切酶D.轉(zhuǎn)移酶10.只能從DNA 分子的末端水解磷酸二酯鍵使核苷酸解離下來(lái)的酶是( A 。A.核酸外切酶B.核酸內(nèi)切酶C. DNA 連接酶D.末端轉(zhuǎn)移酶11.T4 噬菌體DNA 聚合酶具有兩種活性:聚合酶活性和35外切酶活性(作用于3突出端,因此可使黏末端變成平末端。如DNA 片段用一定的限制性內(nèi)切核酸酶處理后,再置于含T4

43、 聚合酶及四種三磷酸核苷酸的反應(yīng)體系中,則下面哪種情況可能發(fā)生?( C A.在T4 聚合酶的外切酶活性作用下,Bgl II (AGATCT切出的末端被切平B.在T4 聚合酶的外切酶活性作用下,Bgl II 及Pvu I(CGATCG切出的末端被切平C.在T4 聚合酶的外切酶活性作用下,Sac II (CCG CGG及Pvu I 切出的末端被切平D.在聚合酶活性作用下,Bgl II 及Pvu I 切出的末端被補(bǔ)平E.在聚合酶活性作用下,Sac II 及Pvu I 切出的末端被切平12.逆轉(zhuǎn)錄酶也稱反轉(zhuǎn)錄酶,是一種( B 。A. 依賴于DNA 的DNA 聚合酶B.依賴于RNA 的DNA 聚合酶C.

44、 依賴于DNA 的RNA 聚合酶D.DNA 聚合酶或RNA 聚合酶13.可以在切口部位起作用的酶是( A 。A.S1 核酸酶B.外切酶IIIC.外切核酸酶D.Bal 31 核酸酶三、判斷題1.T4 DNA 連接酶和E.coli 連接酶都能催化平末端和黏性末端的連接。錯(cuò)誤,平末端不能2.T4 DNA 連接酶和E.coli 連接酶都能催化雙鏈DNA 和單鏈DNA 的連接。錯(cuò)誤,都不能催化單鏈連接3.反轉(zhuǎn)錄酶能夠以單鏈RNA 或單鏈DNA 為模板,在引物的引發(fā)下合成一條互補(bǔ)的DNA 鏈。以RNA為模板合成的DNA 是互補(bǔ)DNA (Complementary DNA,cDNA。若是以DNA 模板合成D

45、NA, dNTP的摻入速度很低(每秒約5 個(gè)核苷酸,是T7 DNA 聚合酶合成速度的1%。正確4.以RNA 為模板,用反轉(zhuǎn)錄酶可同時(shí)產(chǎn)生單鏈和雙鏈的cDNA,雙鏈DNA 是由自身引物引導(dǎo)合成。但這種自身引物引導(dǎo)的合成效率遠(yuǎn)低于外加寡核苷酸引物引導(dǎo)的合成。正確5.Bal 31 核酸酶是Ca2+依賴性的,在反應(yīng)混合物中加入EDTA 便可抑制它的活性。錯(cuò)誤, EGTA 抑制Ca2+6.當(dāng)一個(gè)DNA 結(jié)合蛋白同它識(shí)別的核苷酸序列結(jié)合以后,就保護(hù)了它們的磷酸二酯鍵免遭切割,其結(jié)果,電泳膠上就有明顯可見(jiàn)的空缺帶(與對(duì)照相比,這就是DNA 足跡法。正確7.T4 DNA 連接酶和E.coli 連接酶作用時(shí)都需

46、要ATP 和NAD+作為輔助因子。錯(cuò)誤,T4 連接酶需要ATP,E.coli 需NAD+8.多核苷酸激酶之所以能夠用于DNA 片段的標(biāo)記,是因?yàn)樗軌驅(qū)蝹€(gè)的32P 標(biāo)記的單核苷酸加到每一DNA 鏈的5端。錯(cuò)誤,將ATP 上的3 2P 加到9.用同一種酶切割載體和外源DNA 得到黏性末端后,為防止它們自身環(huán)化,要用CIP 將它們脫磷酸。錯(cuò)誤,不能同時(shí)脫磷酸,一般只將載體脫磷酸10.Nick 和Gap 的含義是不同的,前者指DNA 的單鏈中有較小的缺失,后者僅是斷開(kāi)了一個(gè)磷酸二酯鍵。錯(cuò)誤,正相反四、問(wèn)答題1.DNA 連接酶的連接機(jī)理是什么?答:DNA 連接酶是利用ATP 或NAD+煙酰胺腺嘌呤二

47、核苷酸(氧化型提供的能量催化DNA 雙鏈間的缺口形成磷酸二酯鍵。在連接反應(yīng)中,首先ATP (NAD+與DNA 連接酶反應(yīng),同連接酶生成一種共價(jià)結(jié)合的酶-AMP 復(fù)合物。其中AMP(腺苷一磷酸通過(guò)一種磷酸酰胺鍵同DNA 連接酶的賴氨酸殘基的-氨基相連。同時(shí)釋放出焦磷酸或煙酰胺單核苷酸(NMN。AMP 激活DNA 一條鏈的5-末端磷酸基團(tuán), 并轉(zhuǎn)移到磷酸基團(tuán)上,形成DNA-腺苷一磷酸復(fù)合物。最后,3-OH 對(duì)激活的磷原子作親核攻擊,形成磷酸二酯鍵,同時(shí)釋放出AMP。連接反應(yīng)是由在形成酶-腺苷酸復(fù)合體時(shí),焦磷酸水解和釋放提供的能量驅(qū)動(dòng)下進(jìn)行的。在以ATP作為能源的連接酶中,一個(gè)磷酸二酯鍵的形成消耗掉

48、兩個(gè)高能磷酸鍵。2.DNA 連接酶的作用特點(diǎn)有哪些?連接反應(yīng)需要在一條DNA 鏈的3末端具有一個(gè)游離的-OH, 而另一條DNA 鏈的5 末端具有一個(gè)磷酸基團(tuán)(-P的情況下,才能發(fā)揮其連接DNA 分子的功能作用,而在末端帶有5-羥基和3-羥基;5-磷酸和3-二脫氧核苷基團(tuán)的兩個(gè)DNA 片段之間不起連接作用。連接反應(yīng)中需要ATP 或NAD+ 和Mg2+ 為輔助因子和激活因子;DNA 連接酶不能夠連接兩條單鏈的DNA 分子,被連接的DNA 鏈必須是雙螺旋的一部分。DNA 連接酶只封閉雙螺旋DNA 骨架上的缺口(Nick,即在雙鏈DNA 的某一條鏈上兩個(gè)相鄰核苷酸之間失去一個(gè)磷酸二酯鍵所出現(xiàn)的單鏈斷裂

49、,而不能封閉雙鏈DNA 的某一條鏈上失去一個(gè)或數(shù)個(gè)核苷酸所形成的裂口(Gap。3.影響DNA 連接酶連接反應(yīng)的因素主要有哪些?答:1 反應(yīng)溫度:最佳反應(yīng)溫度37,但黏性末端之間退火形成的氫鍵結(jié)合不穩(wěn)定,連接黏性末端的最佳溫度,一般認(rèn)為420比較合適。2 DNA 片段末端:不僅要考慮反應(yīng)體系中DNA 末端的總濃度,還要考慮載體與插入片段的末端濃度的比例。原則上應(yīng)保證一個(gè)DNA 分子的末端有較高的幾率與另一DNA 分子連接,減少同一個(gè)分子兩個(gè)末端之間的自身連接。載體與插入片段3:1 1:3。3 連接酶濃度:平末端DNA 分子的連接反應(yīng),最適酶量大約是12 單位;而黏末端DNA 片段間的連接,在同樣

50、的條件下,僅為0.1 單位時(shí),便能得到最佳連接效率。4.什么是Klenow 酶?有哪些活性?在基因工程中有什么作用?答:Klenow 酶是1974 年Klenow 用枯草桿菌蛋白酶水解DNA 聚合酶I,得到的兩個(gè)片段。其中大片段的分子質(zhì)量為75kDa,它具有53聚合酶和3 5外切核酸酶的活性,小片段具有53外切核酸酶活性。由于大片段失去了DNA 聚合酶I 中會(huì)降解5引物的53外切核酸酶活性,所以在基因工程中更有用。Klenow 酶主要有下列用途:(1 修復(fù)反應(yīng),制備平末端。可用Klenow 酶修復(fù)限制性內(nèi)切核酸酶或其他方法產(chǎn)生的5或3突出端,制備平末端,這樣可以使原來(lái)具有不相容的黏性末端的DN

51、A 片段通過(guò)平末端重組。如在反應(yīng)系統(tǒng)中加入放射性同位素標(biāo)記的脫氧核苷酸,用這種末端填補(bǔ)的方法可以制備3端標(biāo)記的探針。用Klenow 酶修復(fù)5突出端的反應(yīng)主要是利用了Klenow 酶的DNA 聚合酶活性,是填補(bǔ)反應(yīng);而修復(fù)3突出端則是用Klenow 酶的3 5外切核酸酶的活性,是切割反應(yīng)。用Klenow 酶的切割反應(yīng)來(lái)修復(fù)3突出端是不理想的,改用T4 DNA聚合酶或其他的酶是更好的選擇。(2 標(biāo)記DNA 3突出端(protruding end。該反應(yīng)分兩步進(jìn)行:先用3 5的外切核酸酶活性除去3突出端,產(chǎn)生3隱含末端,然后在高濃度的標(biāo)記底物(32P-dNTP 存在下,使降解3 5 作用與聚合(53

52、 作用達(dá)到平衡。這種反應(yīng)也叫交換或取代反應(yīng)(exchange/replacement reaction。不過(guò)這一反應(yīng)用T4 DNA 聚合酶的效果更好,因它的3 5的外切核酸酶活性較強(qiáng)。(3其他的一些用途。包括用雙脫氧末端終止法進(jìn)行DNA 序列分析、用于cDNA 第二鏈的合成、在定點(diǎn)突變中用于合成第二鏈、用引物延伸法(primer extension 制備單鏈DNA 探針等。5.堿性磷酸酯酶主要有兩種,細(xì)菌堿性磷酸酯酶(BIP和小牛腸堿性磷酸酯酶(CIP,二者有什么不同?在基因工程中有什么用途?答:主要差別是CIP 在68時(shí)失活,而B(niǎo)AP 在68穩(wěn)定,且耐酚抽提。應(yīng)用:dsDNA 的5端脫磷酸,

53、防止DNA 的自身連接。但是用CIP 處理后,最好將CIP 除去,再進(jìn)行連接反應(yīng)。DNA 和RNA 脫磷酸,然后用于多核苷酸激酶進(jìn)行末端標(biāo)記。6.切口平移法制備DNA 探針的原理是什么?答:在Mg 離子存在時(shí),用低濃度的DNA 酶I(DNase I處理雙鏈DNA,使之隨機(jī)產(chǎn)生單鏈斷裂。然后用DNA 聚合酶I 的5' 3'外切酶活性可以從斷裂處的5' 端除去一個(gè)核苷酸,而其聚合酶活性則將一個(gè)單核苷酸添加到斷裂處的3' 端。隨著反應(yīng)的進(jìn)行,即5' 端核苷酸不斷去除,而3' 端核苷酸同時(shí)摻入,導(dǎo)致斷裂形成的切口沿著DNA 鏈按合成的方向移動(dòng),這種現(xiàn)象稱

54、為切口平移。如果在反應(yīng)體系中加入放射性同位素標(biāo)記的核苷酸,則這些標(biāo)記的核苷酸將取代原來(lái)的核苷酸殘基,產(chǎn)生帶標(biāo)記的DNA 分子,用作DNA 分子雜交探針。質(zhì)粒及質(zhì)粒載體一、填空題1、基因工程中有三種主要類型的載體:質(zhì)粒DNA 、病毒DNA 、質(zhì)粒和病毒DNA 雜合體。2.由于不同構(gòu)型的DNA 插入EB 的量不同,它們?cè)诃傊悄z電泳中的遷移率也不同。SC DNA的泳動(dòng)速度最快,OC DNA 泳動(dòng)速度最慢,L DNA 居中,通過(guò)凝膠電泳和EB 染色的方法可將不同構(gòu)型的DNA 分別開(kāi)來(lái)。3.就克隆一個(gè)基因(DNA 片段來(lái)說(shuō),最簡(jiǎn)單的質(zhì)粒載體也必須包括三個(gè)部分:復(fù)制子(含有復(fù)制起點(diǎn)、選擇標(biāo)記(主要是抗

55、性基因、克隆位點(diǎn)(便于外源DNA 插入。另外,一個(gè)理想的質(zhì)粒載體必須具有低分子質(zhì)量。4.如果兩個(gè)質(zhì)粒不能穩(wěn)定地共存于一個(gè)寄主細(xì)胞中,則屬于同一個(gè)不親和群,這是因?yàn)樗鼈兊膹?fù)制機(jī)制相同所致。5.質(zhì)粒拷貝數(shù)是指細(xì)胞中質(zhì)粒的份數(shù)同染色體的比值,即質(zhì)粒/染色體。6.一個(gè)帶有質(zhì)粒的細(xì)菌在有EB 的培養(yǎng)液中培養(yǎng)一段時(shí)間后,一部分細(xì)胞中已測(cè)不出質(zhì)粒,這種現(xiàn)象叫質(zhì)粒消除(或治愈。7.pBR322 是一種改造型的質(zhì)粒,它的復(fù)制子來(lái)源于pMB1 ,它的四環(huán)素抗性基因來(lái)自于pSC101 ,它的氨芐青霉素抗性基因來(lái)自于pSE2124 (R 質(zhì)粒 。8.YAC 的最大容載能力是10002000kb ,BAC 載體的最大容載能力是300kb 。9.把那些沒(méi)有可檢測(cè)表型的質(zhì)粒稱為隱蔽性質(zhì)粒。10.pUCl8 質(zhì)粒是目前使用較為廣泛的載體。pUC 系列的載體是通過(guò)pBR322 和M13 兩種質(zhì)粒改造而來(lái)。它的復(fù)制子來(lái)自pMB1 ,Amp 抗性基因則是來(lái)自轉(zhuǎn)座子。11.Ti 質(zhì)粒是自然界存在的植物基因工程的天然載體。二、選項(xiàng)題(單選或多選1.下面關(guān)于松弛型質(zhì)粒(relaxed plas