淋巴細胞提取

1、淋巴細胞提取一實驗目的：小鼠脾淋巴細胞提取二實驗對象：B/C小鼠三實驗器材：1試劑：淋巴細胞別離液、1640培 養(yǎng)基2. 器材：無菌培養(yǎng)皿、200目尼龍網裁成 90mm*90mm正方形，滅菌、10mL玻璃注射器內活塞滅菌、不同規(guī)格的鑷子、剪刀假設干滅菌、細胞實驗常用器材離心管、移液 管、加樣槍、離心機、75%乙醇、燒杯無菌、大頭針、超凈臺四實驗步驟：1、斷頭處死小鼠，浸入 75%的乙醇中浸泡1-2分鐘。2、在超凈臺中小心剪開小鼠腹部外皮，用大頭針固定，再剪開小鼠腹腔，用鑷子摘下小鼠 脾臟。注意無菌操作。3、 參考圖一，在35mm培養(yǎng)皿中放入4-5ml淋巴細胞別離液使用前搖勻淋巴細胞別離液 用鑷

2、子固定尼龍網，然后用注射器活塞輕輕研磨小鼠脾臟，使得分散的單細胞透過尼龍網進入淋巴細胞別離液中。沒研磨每一只脾臟話費的時間最好控制在5分鐘之內，防止在研磨過程中液體揮發(fā)，使得密度與滲透壓改變，影響別離效果一、小甌脾臟研磨的達科為方法4、把懸有脾臟細胞的別離液立即轉移到離心管中，離心前再覆蓋上大約200卩L的1640培養(yǎng)基。5、800g離心30分鐘，注意離心設置較慢的加速度和減速度如果有十檔，一般設置在第 三檔。離心結束后淋巴細胞會漂浮上來，在1640覆蓋層下面聚集，細胞分層如圖二所示伸片1V40V1UEZ-S»p#HMMffiiw片過 導效界面an 與混亂，沒有 gfiWWGffiI

3、s圖二左:EZ-Sep Mouse 1X 別離小鼠脾臟細胞的分層示就圖即便死亡細胞和細胞碎片很薊也不影響港巴細胞的分圖二右:普通小鼠淋巴細胞別離液在死亡細胞和細胞碎片過多時不能形成淋巴細胞層。6、析出淋巴細胞層，再參加10mL1640培養(yǎng)基，250g離心10分鐘。傾倒上清液，參加3-5mL Lympho-SpotTM無血清培養(yǎng)基重懸，細胞計數。五、考前須知： 離心前在細胞懸液上面加蓋一層1640培養(yǎng)基，既有利于漂浮上來的淋巴細胞的聚集，又有利于下一步的吸取操作。覆蓋層不必太厚，2MI足矣。 如果實驗者一次實驗要處理很多只小鼠，需要注意兩點：其一，每研磨一只小鼠，立即把脾細胞懸液從培養(yǎng)皿轉入離心

4、管中，注意蓋嚴管蓋，切不可敞口放在超凈臺中。否那么，液體揮發(fā)，密度與滲透壓都會改變，嚴重影響別離效果。其二，在所有的小鼠脾臟處理完后，統(tǒng) 一再加1640覆蓋層。如果加早了，兩層液體會相互擴散，造成最終離心后的淋巴細胞層下移。 推薦使用尼龍網替代不銹鋼網篩，以為尼龍網更柔軟些 使用注射器活塞代替鑷子研磨脾臟，由于鑷子夾住脾臟的力度不好控制，易造成細胞死 亡。脾淋巴細胞的制備 將試驗小鼠摘除眼球放血后，頸椎脫臼處死后，浸泡于 75% 酒精中 5min ；將小鼠固定于解剖板上，無菌翻開腹部的皮膚，暴露 腹膜，用眼科剪翻開腹膜，小心取出脾臟；將脾臟置于已盛有 10mL PBS 的平皿中，輕輕洗滌并細心

5、剝去周圍結締組織(此步 可省略)；將脾臟移入 200 目銅網縫制的小袋中，用 4 號針頭在脾臟外表扎幾個針孔，然后用裝在 1mL 注射器上的彎針頭輕輕 刮取脾臟，使脾細胞從針孔中溢出并透過銅網進入 PBS中，再參加少許PBS,并用吸管吹打數次，制成單細胞懸液；取脾淋巴 細胞懸液1份，小心沿側壁參加到 2份的淋巴細胞別離液之液面上，以 2000rpm離心1020min ;收集界面上的細胞(白色云 霧層)，放入89mL盛有Hank s溶液的離心管中，混勻后，以 15002000rpm離心510min ;吸去上清液，沉淀經反復洗 滌2次，即得所需的淋巴細胞；細胞計數，用 RPMI-1640完全培養(yǎng)基

6、調節(jié)細胞密度至 2-5 X10*6個/mL;鋪板，將細胞懸液加 到96孔細胞板中，100gL/孔。如何從小鼠的脾臟中提取 T 淋巴細胞 ?越詳細越好 ,最好有每一步的具體操作步驟 枸杞多糖對荷瘤小鼠腫瘤微環(huán)境 T 淋巴細胞亞群及樹突狀細胞的影響摘要目的：研究枸杞多糖( Lycium barbarum polysaccharide, LBP )對荷瘤小鼠體內 腫瘤微環(huán)境中 T 淋巴細胞亞群和樹突狀細胞( dendritic cells, DCs )的影響，探討 LBP 對荷 瘤機體免疫逃逸的干預作用。方法：用 LBP 給 H22 荷瘤小鼠灌胃，連續(xù) 2 周后，測定腫瘤 重量，采用流式細胞術檢查腫

7、瘤浸潤淋巴細胞( tumor infiltrating lymphocyte, TIL )中 T 淋巴細胞亞群和 DCs 的數量，以及協(xié)同刺激分子 CD80( B7 1)表達的變化。結果： LBP 可明顯抑制腫瘤細胞的生長， 增加腫瘤浸潤 CD4+ 、CD8+ 細胞的數量。 LBP 高劑量組 CD4+ 和 CD8+ 細胞數量的百分比高于模型組 (P<0.05) 。 LBP 低劑量和高劑量組腫瘤浸潤 DCs 數量 及 B7 1 表達均較模型組升高，但差異無統(tǒng)計學意義。結論： LBP 的抗腫瘤作用可能與恢 復荷瘤小鼠 TIL 中 CD4+、CD8+ 的細胞數量、解除機體的免疫抑制狀態(tài)及增強機

8、體的抗腫 瘤免疫功能有關。 LBP 能否恢復荷瘤機體 DCs 的表型及功能尚待進一步研究。關鍵詞枸杞多糖 ; 免疫抑制 ; 淋巴細胞亞群 ; 腫瘤浸潤淋巴細胞 ; 樹突狀細胞Effects of Lycium barbarum polysaccharide ontumor microenvironmentlymphocytesubsets and dendritic cells in H22bearing miceHE Yan Li, YING Yi, XU YanLi, SU Jun Fang, LUO Hui, WANG HuiFeng(Department of Pathology, G

9、uangzhou University of Traditional Chinese Medicine, Guangzhou, Guangdong Province 510405, China; Department of Hematology, Guangzhou Municipal First People ' s Hospital, Guangzhou, Guangdong Province 510180, China)ABSTRACT Objective: To study the effects of Lycium barbarum polysaccharide (LBP)

10、on tumor microenvironment T lymphocyte subsets and dendritic cells in H22 bearing mice and the mechanisms for intervention of tumor immune escape by LBP. Methods: H22 bearing mice were given LBP orally for two weeks. T lymphocyte subsets and the phenotypes of dendriticcells in tumorinfiltrating lymp

11、hocytes (TIL) were detected by flow cytometry (FCM). Results:LBP could significantly increase the numbers of CD4+ and CD8+ T cells in TIL as compared with those in model control group (P<0.05). In model control group, the number of dendritic cells in tumor microenvironment decreased markedly, whi

12、le in LBP treated group, the increased number of dendritic cells and B7 1 expression were observed, but there were no significant differences between these two groups. Conclusion: LBP has anti tumor effect probably by increasing the numbers of CD4+and CD8+ T cells in TIL to relieve the immunosuppres

13、sion and enhance the anti tumor function of the immune system. But whether LBP can recover the phenocyte and function of dendritic cells in H22bearing mice should be further studied.KEY WORDS Lycium barbarum polysaccharide; immunosuppression; T lymphocyte subsets; tumor infiltrating lymphocyte; dend

14、ritic cells近年來的研究發(fā)現：腫瘤患者體內存在多種免疫逃逸機制，表現為CD4+和CD8+ T淋巴細胞數量減少，CD4+/CD8+比值改變及腫瘤間質中的樹突狀細胞(dendritic cells, DCs )表型異常，這些都是導致惡性腫瘤細胞逃逸機體免疫監(jiān)視從而造成腫瘤持續(xù)生長并發(fā)生轉移的 原因 1,2。已有研究證實：枸杞多糖(Lycium barbarum polysaccharide, LBP )具有明顯的免疫調節(jié)和免疫保護功能，可以增強機體的抗腫瘤作用3,4。但 LBP 抗腫瘤的作用機制究竟為何？是否與其影響免疫活性細胞的功能有關？如何從免疫逃逸的角度探討LBP 的抗腫瘤作用機制

15、？有關這方面的研究卻鮮見報道。 本實驗以 H22 肝癌腹水瘤荷瘤小鼠為模型， 研究LBP在全身給藥情況下，對腫瘤微環(huán)境中T淋巴細胞亞群及 DCs的影響，從免疫逃逸的角度揭示 LBP 抗腫瘤作用的機制。1 材料與方法1.1材料昆明種小鼠，清潔級，68周齡，體質量(18翌)g,雌雄各半，廣州中醫(yī)藥大學動物中心提供，動物質量合格證號0002769；H22 肝癌腹水型細胞株，中山大學醫(yī)學院動物中心細胞庫提供；LBP，由廣州中醫(yī)藥大學藥物化學研究所自寧夏枸杞子中提取，呈棕 黃色粉末，純度 >35% W型膠原酶和I型 DNase酶，均為Sigma公司產品；淋巴細胞別離 液,廣州展晨生物科技產品；異硫

16、氰酸熒光素( fluorescein isothiocyanate, FITC ) 標記的抗小鼠 CD4、CD80( B7 1)單克隆抗體,藻紅蛋白( phycoerythrin, PE )標記的抗 小鼠CD8a、CD11c單克隆抗體，美國BioLegend公司產品；電子天平，日本島津公司產品； FACS Vantage 流式細胞儀,美國 Becton Dickinson 公司產品。1.2實驗動物及分組 昆明種小鼠 60只,隨機分成 4組：正常組、模型組、 LBP 低劑量 組和LBP高劑量組，每組15只。其中后3個組，第1天右側腋下接種2X106個H22腫瘤 細胞。第3天起，前2個組小鼠予以生

17、理鹽水灌胃，0.5 ml/d ;后2個組LBP給藥劑量根據文獻5結合預試驗結果，分別給予LBP 0.625 g kg 1 1及1.25 g kg 1 1灌胃(均用生理鹽水稀釋成0.5 ml/d )，連續(xù)灌胃14 do1.3LBP 體內抑瘤率的測定 每日觀察并記錄小鼠生長情況及腫瘤大小，第 15 天小鼠眼球 放血后予以脫頸處死， 解剖并觀察腫瘤大小及重量， 計算腫瘤生長抑制率： 局部腫瘤的生長 抑制率=(模型組平均瘤重 LBP組平均瘤重)/模型組平均瘤重 X100%。所有動物均摘取胸 腺稱重，計算胸腺指數(胸腺指數=小鼠胸腺質量/體質量)。1.4腫瘤間質淋巴細胞的別離腫瘤組織稱重后，挑選瘤體質量

18、> 2 g者置于含青霉素和鏈霉素各500 U/ml、甲硝唑5卩g/m的RPMI 1640培養(yǎng)液中浸泡 30 min后，將瘤體剪成1 mm3 大小，置于含0.05% W型膠原酶、0.003% I型DNase酶及10%小牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)液中，4 C磁力攪拌過夜消化，200目消毒銅網過濾洗滌后，1 500 r/min離心15 min ,別離獲得腫瘤浸潤淋巴細胞( tumor infiltrating lymphocyte, TIL )，用 D Hanks 液洗滌 2 次，臺盼藍染色檢測細胞活力，調整細胞濃度至1X106/ml。1.5TIL中CD4、CD8a、CD11c、CD80

19、流式細胞儀分析 每個樣本分3管，每管中參加3 X105 個細胞，PBS液調整總體積為100卩,1其中第1管中參加不同熒光素標記的抗鼠 CD4、CD8a 單克隆抗體0.5 (0.25 g)、1.0 (0.2 誕，第2管中參加不同熒光素標記的抗鼠 CD11c、 CD80單克隆抗體1.0 (10.2 )1.0 (15 )第3管為空白對照管，室溫避光孵育 30 min , PBS液洗滌2次，每次實驗取2管細胞分別參加FITC和PE單熒光素標記抗體， 用流 式細胞儀檢測。1.6統(tǒng)計學方法 所有實驗數據均采用 SPSS 11.5軟件進行統(tǒng)計學分析，行單因素方差分 析及組間比擬最小顯著差 (least si

20、gnificant difference, LSD) 法。2 結果2.1LBP對H22荷瘤小鼠腫瘤生長及胸腺指數的影響模型組平均瘤體質量(2.48 ±.40)g, LBP低劑量組和高劑量組分別為(1.89 ±.29) g和(1.46 ±.26) g,其中，LBP高劑量組 與模型組比擬，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。 LBP 低劑量組和高劑量組的腫瘤生長抑制率分別為 23.79%和 41.12%。模型組荷瘤小鼠的胸腺質量較正常組輕, LBP 組荷瘤小鼠的胸腺 質量及胸腺指數那么有所恢復。見表 1。表 1 LBP 對 H22 荷瘤小鼠胸腺指數的影響(略)Ta

21、b 1 Effect of LBP on thymus index in H22 bearing mice*P<0.05, vs model control group2.2LBP 對 H22 荷瘤小鼠 TIL 中 T 淋巴細胞亞群的影響 模型組腫瘤間質浸潤 CD4+ 、CD8+ T淋巴細胞的百分比分別為(12.89 ±05) %和(7.72 ±48) %。 LBP組CD4+和CD8+細胞 的百分比擬模型組均有明顯升高，其中LBP低劑量組CD8+與模型組比擬差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，LBP高劑量組CD4+、CD8+與模型組比擬差異均有統(tǒng)計學意義(P<

22、;0.05)。見表2。2.3LBP對H22荷瘤小鼠 TIL中DCs的影響 模型組 TIL中CD11c+百分比為(23.07 翌.36) %，CD80+ 為(15.15 ±.47)%，雙陽性細胞僅為(11.65 ±.73)% ； LBP 組CD11c+、CD80+及雙陽性細胞的百分比擬模型組均略有升高，與CD4+、CD8+細胞百分比的升高變化有一定的平行關系，但模型組、 LBP 低劑量組和 LBP 高劑量組這三者之間的比 較差異無統(tǒng)計學意義。見表 2。表 2 LBP 對 H22 荷瘤小鼠 TIL 中 T 淋巴細胞亞群及 DCs 的影響(略)Tab 2 Effect of LB

23、P on T lymphocyte subsets and phenotypes of dendritic cells in TIL*P<0.05, vs model control group3 討論已有研究證實： LBP 具有廣泛的免疫調節(jié)作用，可以增強機體的抗腫瘤效應 3,4。本實 驗發(fā)現： LBP 能明顯抑制 H22 荷瘤小鼠腫瘤的生長，與文獻報道一致， LBP 高劑量組腫瘤 生長抑制率為 41.12%，與模型組比擬差異有統(tǒng)計學意義( P<0.05)； LBP 還可提高荷瘤小鼠 的胸腺質量及胸腺指數，對胸腺具有一定的保護作用。機體的抗腫瘤免疫主要依靠 T 淋巴細胞介導的細胞

24、免疫。成熟的 T 淋巴細胞分為 CD4+ 和 CD8+ T 淋巴細胞兩個亞群。一般認為： CD4+ T 淋巴細胞產生大量的細胞因子， CD8+ T 淋巴細胞在 CD4+ T 淋巴細胞的輔助及細胞因子的作用下可以殺傷腫瘤細胞，初次的抗腫瘤免疫反響主要依賴 CD8+ T 淋巴細胞和自然殺傷細胞的參與。腫瘤特異性的 CD4+ T 淋巴細 胞對腫瘤細胞也具有直接的殺傷作用6。缺乏CD4+和CD8+ T淋巴細胞，以及CD4+/CD8+比值的降低是導致抗腫瘤免疫效應低下的原因之一。一些研究還發(fā)現：LBP 是一種有效的免疫增強劑，對免疫系統(tǒng)具有正向的調節(jié)作用。劉彥平等 7用 BALB/c 小鼠做體內研究 發(fā)

25、現：LBP能增加小鼠脾臟總的 T淋巴細胞、輔助性 T淋巴細胞(helper T cell, Th )及抑制 性T淋巴細胞(suppressor T cell, Ts)的數量，使 Th和Ts亞群的比例恢復正常。有研究報道：食管癌組織中的 TIL 經白細胞介素 2、白細胞介素 4 聯(lián)合中藥黃芪、干地黃水提取物行 體外誘導后，CD3+、CD4+細胞比例及 CD4+/CD8+的比值均明顯上升8。本實驗通過流 式細胞術檢測發(fā)現：模型組 TIL中的T淋巴細胞數量明顯減少，說明腫瘤微環(huán)境中T淋巴細胞的抗腫瘤免疫活力低下，而LBP組的CD4+、CD8+ T淋巴細胞那么恢復明顯，CD4+在LBP高劑量組，CD8

26、+在LBP低、高劑量組與模型組之間的比擬差異均有統(tǒng)計學意義，說明 LBP可促進TIL中CD4+、CD8+ T淋巴細胞的增殖與活化，直接殺傷腫瘤細胞，或通過其 分泌的細胞因子輔助殺傷腫瘤細胞， 一定程度地解除荷瘤機體的免疫抑制狀態(tài)， 從而產生抗 腫瘤的效應。DCs 是目前發(fā)現的功能最強的抗原提呈細胞，在抗腫瘤免疫應答中起著不可替代的作用， 多數證據說明，荷瘤機體免疫機制的失能不是由于缺乏腫瘤抗原，而是由于DCs 的功能缺陷導致這些抗原不能被有效地提呈給 T 淋巴細胞，從而不能誘導細胞毒性 T 淋巴細胞產生 有效而特異性的免疫應答。有多種原因可導致荷瘤機體DCs 表型的改變，是引起抗腫瘤免疫功能減

27、弱的直接原因。 Chaux 等 9研究發(fā)現：癌旁組織浸潤的炎性細胞中主要組織相 容性復合體n類抗原分子高表達，而其B7 1 ( CD80 )和B7 2 ( CD86 )等共刺激分子那么無表達或低表達；丘少鵬等10對前列腺癌腫瘤微環(huán)境中DCs細胞與T淋巴細胞之間免疫關系的研究發(fā)現：腫瘤間質中DCs 占( 20.89±6.06) %，明顯低于癌旁組織中的(43.11於.13) %，且與T淋巴細胞的分布顯著相關，故認為癌組織中DCs數量的減少可能與前列腺癌腫瘤微環(huán)境 T 淋巴細胞抗腫瘤的免疫功能低下有關。 LBP 在體內外可促進多種 細胞因子的分泌 11，如白細胞介素 2、白細胞介素 3、

28、白細胞介素 6以及腫瘤壞死因子等， 這些因子均能刺激 DCs增殖及表型成熟12。CD11c強烈表達于DCs，通常采用B71、B7 2分子及主要組織相容性復合體n類抗原分子等單克隆抗體檢測DCs細胞表型及成熟程度13,14。本實驗發(fā)現：模型組腫瘤間質中浸潤的單個核細胞CD11c+的百分比為(23.07 翌.36) %、CD80+ 為(15.15 ±.47) %，而雙陽性細胞只占(11.65 ±.73) %，說明 成熟、有功能的DCs細胞數量較低；LBP低、高劑量組CD11c+、CD80+及雙陽性細胞的百 分比均有所上升，與 T 淋巴細胞亞群的變化有一定的平行關系，但各組間的比

29、擬無統(tǒng)計學 意義。本實驗還發(fā)現： LBP 可以增加腫瘤間質中 CD4+、 CD8+ T 淋巴細胞的數量， LBP 是 否可通過使 DCs 前體細胞增殖并誘導分化為成熟的 DCs 而使其具有正常的抗原提呈能力， 進而激活 T 淋巴細胞，從而發(fā)揮抗腫瘤的作用？上述問題值得進一步研究。因流式細胞儀的檢測有一定的細胞數量要求，細胞數低于105以下時數據的準確性下降，而腫瘤間質中淋巴細胞的別離操作步驟繁瑣， 又有屢次的洗滌過程， 因此可能造成較多細胞 的損傷與喪失，當腫瘤組織塊太小時， 更容易導致檢測失敗， 所以只將腫瘤重量 > 2 g者納入 檢測范圍，但這樣就造成腫瘤體積明顯減少的一局部 LBP

30、 組的樣本未納入檢測范圍，從而 可能導致結果的偏差。而 LBP的抗腫瘤作用是否與其增加 DCs的數量及促進其成熟有關， 尚待進一步的研究。T 淋巴細胞尼龍毛柱別離法在研究體內及體外的免疫系統(tǒng)時， 別離淋巴細胞群是一個關鍵步驟。 因為現在市場上并沒有T 細胞并不是十分方便。 T 細胞尼龍 T 細胞在沒有嚴重損傷的情況下到達的 而且操作簡便， 所需要的條件也不高，針對 B 細胞的特異性抗血清，所以別離淋巴細胞中的 毛別離法利用了尼龍毛對 B 細胞的親和力，從而使 足夠的純度。 因為這個方法不像流式和磁珠費用昂貴， 是一種非常實用的方法。在此我向各位解釋一下，現在別離T 細胞的方法主要是三種，流式，

31、磁珠法，尼龍毛法。與前兩種方法相比， 尼龍毛法的優(yōu)勢在于無需特定的設備儀器， 一般的實驗室均有條件操作； 價格相對低廉；可以進行大量樣本操作。 首先要指出的是實驗中所使用的是別離 T 細胞專用的尼龍毛 Nylon Fiber ，不是化工上的尼 龍纖維，曾經有人問過我這種問題，如果你買錯了，可是做不出來的！其次，現在市面上的 尼龍毛也是良雋不齊， 也有同仁反響買到的尼龍毛參加緩沖液以后成了一團糨糊， 根本沒法 使用，這個問題就要靠各位的慧眼了?，F在市面上有尼龍毛填料， 也已經有了商品化的尼龍毛柱子， 這兩者的區(qū)別主要是以下兩點：1. 商品化的柱子的填料量是已經定好的，有一個確定的上樣量范圍。而自

32、己買填料裝柱可以 控制填料量， 也就是可以控制上樣量， 這對于樣本量非常少， 或是樣本量非常大的實驗需求 非常適宜。2. 商品化的柱子已經經過了無菌處理一般是輻射滅菌 ，而自己裝柱當然就要自己滅菌了。3. 商品化的柱子在實驗的重復性上有著絕對的優(yōu)勢。自己裝的柱子在填料的處理和裝柱的松緊等方面不容易控制，差異性的控制就看你的實驗技巧了。操作方法：1. 秤取 1.5g 尼龍毛裝入 20-30ml 玻璃或一次性注射器內 要可以滅菌的 ，填料的體積控制在15 毫升左右 注射器上有標記， 所以還是比擬好控制的 ，因為尼龍毛的松緊關系到 T 細胞的 回收率，所以要特別注意。注射器下端配接 5 厘米左右長的帶有彈簧夾的橡皮管。2. 參加大量的PBS平衡柱子后，用鋁箔包裹，并置于適當的容器內，高壓滅菌15分鐘。商品化尼龍毛柱以上步驟可以省略，經過無菌 PBS 平衡后直接進行以下步驟。 3. 滅菌的尼龍毛柱垂直固定后放于超凈臺內，頂部以鋁箔覆蓋，防止污染